第一章_植物工廠化育苗的工廠與設(shè)備.ppt

植物工廠化育苗的工廠與設(shè)備,2,第一節(jié) 實驗室,一 、實驗室,植物組織培養(yǎng)是在嚴格無菌的條件下進行的。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。 實驗室設(shè)計原則：保證無菌操作，達到工作方便，防止污染。,準備室,培養(yǎng)室,溫 室,Text,實驗室,接種室,接種室,實驗室組成：,4,基本實驗室布局平面圖,實驗臺,擱架,培養(yǎng)架,培養(yǎng)架,培養(yǎng)架,培養(yǎng)架,藥品及儀器柜,無菌臺,無菌臺,擱 架,拉窗,冰箱,擱 架,水槽,電爐,門,4.5m,3.0m,3.5m,4.0m,準備室,緩沖室,無菌室,培養(yǎng)室,準備實驗室,5,緩沖室,6,無菌室,7,無菌室,8,9,9,無菌室,10,10,11,11,培養(yǎng)架,12,12,培養(yǎng)室,13,溫室,14,14,第二節(jié) 儀器與設(shè)備,15,冰箱,酸度計,電爐,1.基本設(shè)備,17,天平,純水器,18,攪拌器,19,蒸汽壓力滅菌鍋,2.滅菌設(shè)備,20,21,22,22,過濾滅菌裝置,23,23,紫外滅菌燈管,3、無菌操作設(shè)備,超凈工作臺,24,25,25,超凈工作臺,無菌接種箱,26,恒溫振蕩培養(yǎng)箱,光照培養(yǎng)箱,4、培養(yǎng)設(shè)備,27,搖 床,28,5、細胞學鑒定設(shè)備 光學研究顯微鏡、實體顯微鏡、倒置顯微鏡,29,倒置顯微鏡,光學顯微鏡,30,1、玻璃器皿,三、培養(yǎng)器皿及實驗用具,培養(yǎng)皿,三角瓶,培養(yǎng)瓶,2、金屬材質(zhì)用具,鑷子,解剖刀,接種針,32,接種盤,33,33,第二節(jié) 培養(yǎng)基,培養(yǎng)基是決定植物組織培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵因素之一。 培養(yǎng)基的構(gòu)成要素通常可分為：水分；無機鹽類；有機營養(yǎng)成分；植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)；天熱物質(zhì)； pH；凝固劑等。,34,34,構(gòu)成培養(yǎng)基的絕大部分組分為水分。 在研究上，常用蒸餾水來配制培養(yǎng)基，而最為理想的水應(yīng)該是純水。,（一）水分,大量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以上； C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9種 微量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以下 有的只含0.1mg/kg Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種,按照國際植物生理協(xié)會的建議： 所需濃度 0.5mmol/L的元素為大量元素 所需濃度 0.5mmol/L的元素為微量元素,35,（二）礦質(zhì)元素,1.大量元素 N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動中占有重要的位置。 P是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。 K對碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關(guān)系。,36,Mg、S、Ca是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用； S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。 Ca是構(gòu)成細胞壁的成分，對細胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。,2、微量元素 在微量元素中，鐵的使用最大 ： 一些氧化酶的組成成分 葉綠素形成的必要條件 使用乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）鰲合物防止鐵的沉淀,38,硼與蛋白質(zhì)合成、糖類運輸有著密切的關(guān)系 銅是某些氧化酶的成分，能夠促進離體根的生長 錳參與植物的光合、呼吸代謝 鉬參與氮素的代謝 氯是光合作用水光解的活化劑 微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。,39,（三）有機營養(yǎng)成分,培養(yǎng)基中的有機營養(yǎng)成分包括糖類物質(zhì) 、維生素類 和氨基酸類。,1.碳源 碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機酸，以糖類物質(zhì)最重要。 糖類物質(zhì)特點： 具有熱易變的性質(zhì) 利于吸收和利用 使用濃度一般在2%5% 提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓,41,2.維生素類,以各種輔酶的形式存在 參與多種代謝活動 對生長，分化等有很好的促進作用 主要分為脂溶性維生素和水溶性維生素 常用維生素有VB1和VB6,42,蛋白質(zhì)的組成成分 有機氮源 可直接被細胞吸收利用 培養(yǎng)基中常用的是甘氨酸,3.氨基酸,43,4.肌醇,環(huán)己六醇 細胞壁的構(gòu)建材料 參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動 促進活性物質(zhì)發(fā)揮作用,44,（四）植物生長調(diào)節(jié)劑,植物生長調(diào)節(jié)劑不僅可以促進植物組織的脫分化和形成愈傷組織，還可以誘導(dǎo)不定芽、不定胚的形成。 最常用的有生長素和細胞分裂素，有時也會用到赤霉素和脫落酸。,1.生長素類,促進細胞伸長和分裂 促進生根、抑制器官脫落、性別控制、延長休眠、頂端優(yōu)勢、單性結(jié)實 誘導(dǎo)愈傷組織形成 溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好 常用的生長素： IAA(吲哆乙酸) NAA (萘乙酸) 2,4-D(2,4，二氯苯氧乙酸) IBA(吲哆丁酸),46,2.細胞分裂素類,促進細胞分裂和分化 誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的形成 延緩組織的衰老并增強蛋白質(zhì)的合成 用于離體成花的調(diào)控 溶于0.5-1.0mol/L的鹽酸或稀薄的NaOH中 常用的細胞分裂素： KT (激動素) BA(6-卞基腺嘌呤) 2-ip(異戊烯氨基嘌呤) ZT（玉米素）,47,3.赤霉素類和脫落酸,A、赤霉素類 組織培養(yǎng)中不常使用 加速細胞的伸長生長 促進細胞的分裂 主要是GA3 B、脫落酸 抑制細胞分裂和伸長 促進脫落和衰老 促進休眠和提高抗逆能力,GA3,脫落酸,48,促進某些愈傷組織和器官的生長 化學成分不明、復(fù)雜 天然營養(yǎng)混合物 如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物,（五）天然復(fù)合物,49,50,（六）pH,在滅菌前，培養(yǎng)基的pH一般被調(diào)節(jié)到5.06.0 之間，最常用的pH為5.75.8。 pH過高時，培養(yǎng)基會變硬；pH過低時，則影響培養(yǎng)基的凝固。,50,（七）凝固劑,瓊脂是使用最普遍的凝固劑 用量一般在6-10g/L之間 顏色以淺、透明度高好，潔凈為上品 除了瓊脂外，在組織培養(yǎng)中還可以使用瓊脂糖、結(jié)冷膠等。,51,（八）其他添加物,52,1.活性炭,吸附培養(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì) 抑制外植體褐變 防止玻璃苗的產(chǎn)生 促進培養(yǎng)物生長和分化 促進生根 2.抗生素 防止外植體內(nèi)生菌造成的污染,活性炭,53,53,二、培養(yǎng)基的基本類型,培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基 培養(yǎng)過程不同：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基 其作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基 營養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基,（一）培養(yǎng)基的種類,成分和濃度不同：含鹽量較高的培養(yǎng)基、硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基、中等無機鹽含量的培養(yǎng)基、低無機鹽含量的培養(yǎng)基,54,54,1、MS培養(yǎng)基 無機鹽濃度高 高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽 含有一定數(shù)量的銨鹽 營養(yǎng)豐富 不需要添加更多的有機附加物,（二）幾種常見培養(yǎng)基的特點,2、White培養(yǎng)基 1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計 1963年作了改良，提高MgSO4的濃度和增加硼元素 無機鹽濃度較低 使用廣泛 在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果,附表：White培養(yǎng)基,56,3、B5培養(yǎng)基 1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設(shè)計 含有較低的銨鹽 較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素,B5培養(yǎng)基的組成和配方,57,4、N6培養(yǎng)基 1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)設(shè)計 KNO3和(NH4)2SO4含量高，不含鉬,N6培養(yǎng)基組成及配方,58,第三章 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,為了減少工作量，減小誤差，最方便的方法是預(yù)先配制好不同組分的培養(yǎng)基母液。,一、培養(yǎng)基母液的配制,60,1.配制母液原則 相同類型的試劑混合； 易形成沉淀的藥品分開； 母液濃度要適宜； 用量要認真計算和核對； 藥品要準確稱量。,61,2.MS培養(yǎng)基母液的配制,62,MS培養(yǎng)基母液根據(jù)試劑特性通常配成五種母液，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（100或1000倍）、Fe鹽（100倍）、Ca鹽（50倍）、有機物（100倍）。,63,3.激素母液的配制,64,生長素類、赤霉素類及脫落酸等用95乙醇溶解； 細胞分裂素類用1N HCl或1N NaOH溶解。 通常激素母液濃度生長素類為0.10.5 mg/ml, 細胞分裂素母液濃度為0.21.0 mg/ml.,二、培養(yǎng)基的配制,水,藥品,糖,瓊脂,混合,加熱溶解,調(diào)整pH,玻璃器皿,水洗,干燥,分裝,滅菌,封口,冷卻,接種,1、取出母液并按順序放好。將潔凈的各種玻璃器皿如量筒、容量瓶、移液管、移液槍和玻璃棒等放在指定位置； 2、取一只容量瓶，放入配制培養(yǎng)基總量的1/3左右純水，將母液按順序加入，并不斷攪拌； 3、加入植物生長調(diào)節(jié)劑后定容；,培養(yǎng)基的配制的具體步驟：,4、將定容的培養(yǎng)基倒入容器中，加入蔗糖和瓊脂，并加熱使其完全溶解； 5、調(diào)整pH； 6、將培養(yǎng)基分裝倒培養(yǎng)器皿中，封好瓶口； 7、滅菌，用高壓鍋滅菌（121，1520min）或過濾除菌； 8、滅菌后待高壓鍋溫度下降到50以下時，便可以取出、冷卻凝固后待用。,68,69,三、培養(yǎng)基的保存,配制好的培養(yǎng)基一般要在室溫、黑暗且清潔的地方放置35天再使用。 保存時間太久，培養(yǎng)基可能會污染、脫水、易分解的成分會發(fā)生分解，培養(yǎng)基成分會發(fā)生較大的變化。 每批培養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁或明顯標簽。,四、培養(yǎng)條件,71,溫度 光照 濕度 氣體 培養(yǎng)基的滲透壓 pH值,植物材料一般最適溫度在252之間,環(huán)境條件,光強： 10006000 lx,一般情況下，培養(yǎng)器內(nèi)相對濕度應(yīng)達100%，培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的相對濕度在70%80%,氧氣是愈傷組織生長所必需的,調(diào)節(jié)滲透壓常常從糖入手,植物組織培養(yǎng)時培養(yǎng)基的pH值大多在5.06.5,光質(zhì)：影響細胞分裂和器官分化,光周期：光照16h，黑暗8h,第三節(jié) 基本操作,一、洗滌,1、玻璃器皿洗滌,新購置玻璃器皿,1%稀HCl,浸漬12h,洗衣粉洗滌,清水沖洗,晾干備用,已用過的玻璃器皿,2、塑料用品洗滌,塑料器皿,2%NaOH浸泡12h,清水沖洗,2%5%鹽酸浸泡30min,清水沖洗,蒸餾水沖洗,晾干備用,73,3、金屬用品洗滌,熱洗衣粉水洗凈,沖洗,擦干,74,75,1.滅菌方法： （1）物理方法： 物理滅菌干熱、濕熱、射線處理、物理除菌、過濾、離心、沉淀等 （2）化學方法： 消毒劑、抗菌素滅菌,75,二、消毒滅菌,2、滅菌,（1）培養(yǎng)基滅菌：高溫高壓濕熱滅菌法 壓力在9.810410.8104Pa 溫度在121 滅菌2030min （2）玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌 干熱消毒滅菌,76,飽和蒸汽壓力與其對應(yīng)的溫度,77,（3）塑料器皿滅菌： 多采用高壓蒸汽消毒滅菌 （4）金屬用具滅菌：灼燒滅菌 浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷卻后使用,（5）過濾滅菌： 一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素。,78,（6）接種室滅菌,空氣消毒滅菌,接種室,超凈工作臺,紫外燈照射,70%75%的酒精擦洗,培養(yǎng)材料的接種,紫外燈照射,79,（7）外植體滅菌,流水沖洗1020min或更長時間,70%75%酒精中浸泡30s,0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右,蒸餾水沖洗45次,在10%的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡30min左右,備用,80,常用消毒劑消毒滅菌比較表,81,82,熏蒸滅菌 常用熏蒸劑是甲醛。熏蒸時，房間關(guān)閉緊密，按68ml/m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加克高錳酸鉀促進揮發(fā)。熏蒸時，房間可預(yù)先噴濕以加強效果。冰醋酸也可進行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。,82,（8）培養(yǎng)室滅菌,三、無菌操作,實驗員消毒,實驗室、無菌臺滅菌,實驗器材的滅菌,無菌接種,消 毒,實驗臺衛(wèi)生,培養(yǎng)室培養(yǎng),83,1、消毒，更換實驗服、帽子與鞋子，進入接種室。 2、打開超凈工作臺和無菌操作室的紫外燈，照射40min左右，后關(guān)閉。 3、開啟過濾室風機，使無菌風吹拂工作臺面和四周的臺壁。 4、用70%75%的酒精擦拭工作臺和雙手。,84,5、