2016分子腫瘤概論研究生學(xué)生.ppt

,分子腫瘤概論 重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室 王婭蘭 教授(博士生導(dǎo)師),分子腫瘤概論 一、有關(guān)腫瘤的基本概念（復(fù)習(xí)） 腫瘤（tumor, neoplasm) 基因水平 調(diào)控失常 異常增生 新生物 腫瘤生物學(xué)行為-浸潤、轉(zhuǎn)移能力 浸潤 (invasion)：起源處遷移 侵入周圍鄰近組織,轉(zhuǎn)移(metastasis)： 從原發(fā)部位 血管、淋巴管、體腔 它處繼續(xù)生長 與原發(fā)瘤同樣類型腫瘤 （轉(zhuǎn)移瘤或繼發(fā)瘤）,轉(zhuǎn)移的途徑,（2）Hematogenenous metastasis 全身臟器 （3）Transcoelomic metastasis 體腔內(nèi)臟器-脫落種植 （醫(yī)源性種植） 浸潤生長-惡性腫瘤生長的特點 腫瘤轉(zhuǎn)移過程必經(jīng)的第一步,腫瘤的組織結(jié)構(gòu) 實質(zhì) （parenchyma) 間質(zhì) （mesenchyma, stroma) 腫瘤間質(zhì)的主要成分 1. 血管 小血管 毛細血管 血竇樣 血管球樣,新的腫瘤血供模式 -血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM) 1999年，美國學(xué)者Maniotis等 一種完全不同于經(jīng)典血管生成的微循環(huán)模式 -小管狀（似血管） -管壁主要由基底膜(PAS陽性)圍成，外襯以腫瘤細胞 -腔內(nèi)有血漿和紅細胞流動 -管道與內(nèi)皮性血管相通 多存在于高度惡性腫瘤,血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry） 腫瘤細胞構(gòu)成 有基底膜 小管狀（似血管） 與血管交通,2. 結(jié)締組織間質(zhì) （1）纖維和基質(zhì) 膠原纖維 常規(guī) HE - 紅 特殊化學(xué)染色 VG 改良法- 紅 Masson- 蘭色 構(gòu)成成分 I II III型膠原原纖維 又由相應(yīng)原纖維分子構(gòu)成 免疫組化或分子生物學(xué)方法可區(qū)別,彈力纖維 常規(guī) HE-淡紅色 特殊化學(xué)染色 Weigert或Verhceff-暗蘭或黑色，彈力 酶消化后陰性,網(wǎng)狀纖維 銀染-黑色，故也稱嗜銀纖維。 PAS -強陽性,成分 膠原蛋白為主要成分 細胞間質(zhì)網(wǎng)狀纖維- 型膠原蛋白 基底膜網(wǎng)狀纖維- 型膠原蛋白和 層黏連蛋白（laminin）,纖維黏連蛋白 Fibronectin（FN） 作用 A. 連接基質(zhì)中各種成分 B. 介導(dǎo)細胞外基質(zhì)成分與細胞表面連接 黏蛋白 又稱蛋白多糖（proteoglycan） 如透明質(zhì)酸，硫酸肝素等 骨黏素 （osteonectin）,（2）基底膜 (basement membrane , BM) 多種成分 與疾?。[瘤浸潤）關(guān)系密切 型膠原 -不形成纖維，與、 型膠原不同 層黏連蛋白 （laminin ,LM） -有與細胞膜LM 受體相結(jié)合的位點,（3）細胞成分 固有的細胞成分 -纖維母細胞和纖維細胞 -肌纖維母細胞 -間充質(zhì)細胞 -巨噬細胞 -樹突狀細胞,反應(yīng)性細胞成分 各種細胞浸潤 - 淋巴細胞 最常見 -漿細胞 -巨噬細胞 都屬免疫活性細胞,二、腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的分子機制 （一）腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移 1.腫瘤細胞增殖和擴展 浸潤轉(zhuǎn)移的前提和基礎(chǔ) 2.腫瘤血管生成(tumor angiogenesis) 腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的必要條件,3.腫瘤細胞分離脫落，與細胞外基質(zhì)黏附 （1）瘤細胞表面負電荷增加 （2）瘤細胞黏附力的改變 瘤細胞自身結(jié)構(gòu)異常 瘤細胞同質(zhì)黏附力下降 指同種瘤細胞之間的黏附力,瘤細胞異質(zhì)黏附力增加 指腫瘤細胞與其它不同細胞及間質(zhì)的黏附力 同質(zhì)黏附力降低，有利于腫瘤細胞分離； 異質(zhì)黏附力的增加，有利于瘤細胞與基底膜、間質(zhì)成分粘附并穿過這些組織 均由黏附分子介導(dǎo) 通過配-受體之間的識別和結(jié)合實現(xiàn),（3）腫瘤黏附分子(adhesion molecules) 細胞表面結(jié)構(gòu) 鈣黏蛋白(cadherin) 又稱為鈣連接素，鈣黏素。 依賴細胞外鈣 介導(dǎo)鈣離子依賴性細胞與細胞（同源細胞）的黏附 據(jù)分布不同 E-鈣黏蛋白 P-鈣黏蛋白 N-鈣黏蛋白 H-cad,整合素(integrin) -細胞表面糖蛋白 ，約有20 多個亞型 -各種腫瘤細胞表面整合素種類不同 -腫瘤生長各個階段表達水平也不同 作用 a.介導(dǎo)細胞與細胞外基質(zhì)的黏附 b.參與不同細胞之間的黏附連接 C.扮演細胞信號傳遞的角色 配體-整合素-細胞骨架蛋白跨膜信息傳導(dǎo)系統(tǒng), 免疫球蛋白超基因家族(immunoglobulin superfamily) 主要參與細胞與細胞間的連接 ICAM-1 （細胞間黏附分子-1） VCAM-1 （血管黏附因子） NCAM （神經(jīng)細胞黏附因子） 其它 包括CEA 、DCC,選擇素(selectin) 內(nèi)源性植物凝血素（凝集素） 作用 介導(dǎo)內(nèi)皮細胞、血小板與瘤細胞黏附 選擇素家族包括： P-selectin E-selectin L-selectin, CD44 及其它 CD 44(透明質(zhì)酸受體) -介導(dǎo)細胞與細胞外基質(zhì)粘附 路易斯寡糖（SLEX，,s-LewisX ） -血管內(nèi)皮細胞E-選擇素的配體,4.瘤細胞的遷移(migration)及化學(xué)趨向性 (1)瘤細胞的運動 黏附；肌動蛋白、微管、中間絲 (2)瘤細胞運動的調(diào)節(jié),據(jù)其作用，大致可分為兩大類： 僅影響運動的因子 遷移刺激因子（MSF） 既影響運動又影響生長的因子 AMF (自分泌運動因子) HGF/SF（肝細胞生長因子/分散因子),(3)瘤細胞的化學(xué)趨向性 21KD 的蛋白質(zhì) 骨吸收因子,5.細胞外基質(zhì)的降解 (1)腫瘤浸潤細胞外基質(zhì)的步驟 Liotta 1986年提出 第一步 黏附于基底膜或其他間質(zhì)成分 第二步 分泌蛋白酶并激活, 降解瘤細胞 鄰近的細胞外基質(zhì) 第三步 進入受蛋白酶降解的基質(zhì)區(qū)域內(nèi),(2)腫瘤細胞產(chǎn)生的蛋白水解酶 絲氨酸蛋白酶類及其抑制因子 纖維蛋白溶解酶(纖溶酶) 纖溶酶原 a. 降解基質(zhì) 如纖維蛋白，F(xiàn)N, LM, 蛋白多糖 b. 激活膠原酶 膠原降解,尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator , u-PA）系統(tǒng) Au-PA： 介導(dǎo)細胞周圍基質(zhì)蛋白的降解 Bu-PA 受體（u-PAR）及纖溶酶原受體 活化u-PA 原酶形式的u-PA 纖溶酶原+纖溶酶原受體 纖溶酶,CPAI （PA 抑制劑） PAI1 是u-PA 的主要抑制劑 PAI2 不同腫瘤表達意義不一 PAI3 功能不清,基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP）及其抑制因子 需鈣、鋅離子作輔助因子 MMP 分類 膠原酶：如間質(zhì)膠原酶 （Collagenase） 明膠酶：如明膠酶A (gelatinase A) 間質(zhì)溶素：如間質(zhì)溶素1 、2 膜型基質(zhì)金屬蛋白酶：、型,可分別降解ECM中各種不同成分 ECM降解的主要蛋白水解酶類 金屬蛋白酶抑制物 TIMP-1 ，TIMP-2 浸潤與否取決于MMP與TIMP的對比 MMPTIMP ECM降解才能成為可能,胱氨酸蛋白酶類 Cathepsin B 作用 降解ECM中各種膠原、LM、 FN、黏蛋白 激活間質(zhì)膠原酶和IV型膠原酶 天（門）冬氨酸蛋白酶 cathepsin D, E 在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用 CD 表達的調(diào)節(jié),6.瘤細胞以主動方式入循環(huán)管道并形成栓子 微小淋巴管、微小靜脈壁 縫隙 血管 基底膜缺損 瘤細胞存在形式 單個 成團 同類癌栓 異類癌栓 黏附分子對其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,7.在特定器官的毛細血管滯留并黏著，再次穿過血管壁并定居、增殖 器官特異性（選擇性）機制 (1) 黏附分子的作用 (2) 化學(xué)趨化因子（歸巢現(xiàn)象) (3) 微環(huán)境不適合 (4) 與免疫狀態(tài)有關(guān),（二）機體免疫狀態(tài)與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移 參與控制轉(zhuǎn)移的免疫細胞主要有 NK 細胞 巨噬細胞 T 淋巴細胞 （三）腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 指基因的表達和改變能夠促進或?qū)е履[瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的基因,（四）腫瘤表觀遺傳改變與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移 表觀遺傳學(xué)(Epigenetics) -與遺傳學(xué)(genetic)相對應(yīng)的概念 -表型狀態(tài)改變，基因型不改變 -沒有DNA序列變化的情況下， 可遺傳的基因 表達改變，導(dǎo)致的基因產(chǎn)物的變化。 -1942年提出，上世紀80年代后期逐漸興起的一門新學(xué)科,DNA的“后天性”修飾 CpG島高甲基化 癌細胞基因組低甲基化 組蛋白殘基的各種修飾 磷酸化 乙?；?甲基化 泛素化等等,（五）腫瘤干細胞(tumor stem cell, TSC) 2001年由Reya等提出 2006年美國癌癥研究協(xié)會（AACR）定義 存在于腫瘤組織中具有無限自我更新能力并能產(chǎn)生不同分化程度的腫瘤細胞的細胞,特征 (1) 無限增殖和多向分化 (2)存在自我更新的信號傳導(dǎo)途徑 (3)具不同表型，異質(zhì)性，對放化療不敏感 (4)具有端粒酶活性 (5)能轉(zhuǎn)移到各種不同的組織,（六）腫瘤微環(huán)境與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移 腫瘤細胞 間質(zhì)細胞 細胞外基質(zhì) 間質(zhì)細胞所分泌的活性介質(zhì)（細胞因子） 共同構(gòu)成的局部內(nèi)環(huán)境,微環(huán)境改變 腫瘤細胞 -自分泌和旁分泌 全身和局部組織 -代謝、分泌、免疫 結(jié)果： 限制或促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,三.腫瘤學(xué)研究中常用的分子生物學(xué)基本技術(shù)及其應(yīng)用 (一)蛋白表達異常的檢測 -免疫組化（熒光）定位 -ELISA和Western blot 、流式細胞術(shù)定量,抗體,細胞,細胞,細胞,（二）蛋白質(zhì)相互作用的檢測方法 1.酵母雙雜交法 驗證兩個已知蛋白的相互作用 篩選與已知蛋白作用的未知蛋白 酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法，,酵母雙雜交的原理是將2個目的蛋白分別與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（transcription activation domain，AD）和DNA 結(jié)合區(qū)（DNA-binding domain，DBD）融合產(chǎn)生新的融合蛋白，如果這2個目的蛋白能夠互相作用，則該相互作用會促使AD和DBD 互相靠近而產(chǎn)生有活性的轉(zhuǎn)錄因子，進而激活事先構(gòu)建到酵母基因組中的報告基因的轉(zhuǎn)錄。 （真核轉(zhuǎn)錄因子DBD能把蛋白定位到基因組特定DNA序列上，AD能夠使轉(zhuǎn)錄裝置激活基因轉(zhuǎn)錄。當這兩個區(qū)域單獨存在時均沒有轉(zhuǎn)錄激活功能，但當它們在空間上彼此聯(lián)系時，則能夠激活基因轉(zhuǎn)錄。）,局限性 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內(nèi) 酵母雙雜交系統(tǒng)的一個重要的問題是“假陽性”,2.免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP） 是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的常用、經(jīng)典方法。 其基本原理是: 細胞裂解液中加入抗體，與抗原形成特異免疫復(fù)合物，經(jīng)過洗脫，收集免疫復(fù)合物，然后進行SDS-PAGE及Western blotting分析。,缺點 免疫沉淀蛋白有可能不是直接相互作用的蛋白，而是通過第三者間接相互作用的蛋白 靈敏度不及蛋白親和色譜高 必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性 假陽性的概率比較高,設(shè)置的對照包括： 在對照組中使用對照抗體，以缺失目的蛋白的細胞系作為陰性對照等等。,3.GST沉淀實驗（GST-pull down實驗） 主要是用來證明細胞外蛋白質(zhì)相互作用 利用GST (Glutathione-S-transferase， GST)和谷胱甘肽親和樹脂之間的高親和性 將GST固化在樹脂上 GST和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白在細菌、動物細胞等體系中融合表達 固化的誘餌蛋白【即誘餌蛋白(Bait protein)】可以捕獲細胞裂解物中的互作用靶蛋白 洗脫結(jié)合物后通過western blot 檢測誘餌蛋白和靶蛋白,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白,4.Far-Western blotting 在經(jīng)典Far-Western印跡中，運用經(jīng)標記的或可被抗體檢測的“誘餌”蛋白檢測轉(zhuǎn)移膜上的“獵物”靶蛋白。 用SDS-PAGE 或非變性PAGE分離含有未知靶蛋白的樣品（通常為細菌裂解液）然后轉(zhuǎn)膜。 轉(zhuǎn)膜后與已知誘餌蛋白孵育，運用該誘餌蛋白的特異性檢測系統(tǒng)檢測。（出相應(yīng)條帶+） 5.生物信息學(xué),（三）基因拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA異常 - 核酸分子生物學(xué)方法進行檢測 核酸變性、復(fù)性基本性質(zhì) 常用方法,1. 核酸分子雜交（nucleic acid molecular hybridisation）技術(shù) 最常用的基本技術(shù) 基本原理： -標記的已知堿基序列 （DNA或RNA單鏈片段） （探針probe ） （同位素 P32 I125 非同位素 生物素 地高辛 熒光素） -檢測靶核酸（待測核酸）中是否存在與之 同源的序列,（1）原位雜交 （ISH） （2）熒光原位雜交 （FISH）， （3）雙色（多色）銀染原位雜交（DSISH） （4）Southern blot (DNA 雜交) （5）Northern blot (RNA 雜交),2. 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction , PCR）技術(shù) 又稱體外基因擴增 利用DNA變性和復(fù)性原理 體外進行 特定的DNA 片段高效擴增 獲得或放大特異基因信號的重要手段,擴增產(chǎn)物的檢測 凝膠電泳分析 瓊脂糖凝膠電泳 (最常用) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 單一條帶,Real-time PCR RT-PCR 3.基因芯片技術(shù),(四)基因突變的檢測方法 1.聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products , PCR-SSCP） 長度相同，構(gòu)象不同 在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳 遷移率（泳動率）不同 堿基序列不同的單鏈DNA構(gòu)像改變,基本方法 作PCR 將產(chǎn)物變性而成為單鏈 進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 顯示結(jié)果 可用同位素/熒光素標記 非同位素標記,2.PCR-限制性片段長度多態(tài)性（restrection fragment length polymorphisms , RFLP）分析技術(shù) 基本原理 -序列中一個堿基發(fā)生改變 -使原來的內(nèi)切酶位點消失 或產(chǎn)生新的酶切位點 -用限制性內(nèi)切酶消化PCR 擴增出來的DNA片段 -檢測其酶切片段長度的差異,3.變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 基本原理 電泳時，不同濃度凝膠溫度不同 DNA鏈中有一個堿基改變 在不同的溫度發(fā)生解鏈 電泳遷移率改變,4. DNA 序列分析（DNA sequencing ） 5. 熒光原位雜交 ( FISH) 6 DNA 芯片技術(shù)（DNA chip ）,（五）腫瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability , MI）, 是指簡單重復(fù)序列的增加或丟失 PCR + DNA 序列凝膠電泳 （六）腫瘤易感性檢測 采用相應(yīng)基因變異方法進行檢測 （七）腫瘤相關(guān)病毒 核酸雜交技術(shù)與PCR技術(shù) (八) 基因重組技術(shù) 主要目的是獲得某一基因或DNA片段的大 量拷貝 (九) 基因轉(zhuǎn)染（gene transfection）技術(shù) （十）RNA干涉(RNA interference）,核酸雜交/PCR技術(shù)與蛋白表達【免疫組化/熒光、流式細胞術(shù)、WB方法結(jié)合、蛋白結(jié)合檢測方法 】 -蛋白表達 在翻譯水平上定位研究基因表達 -核酸雜交/PCR技術(shù) 檢測DNA/RNA， 在基因或轉(zhuǎn)錄水平研究基因表達,（十一）DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合檢測 1.凝膠阻滯實驗（Gel retard