堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測定.ppt

堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測定,浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院 生物化學教研室,目的與要求 通過堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測定，了解其測定方法及意義。 學會運用標準曲線測定酶的活性，加深對酶促反應動力學的理解。,原理,酶催化底物發(fā)生反應時，受多種因素影響，環(huán)境的溫度、pH和酶的濃度等等，在環(huán)境的溫度、pH和酶的濃度一定時，酶促反應速度與底物濃度之間的關系表現(xiàn)在反應開始時。酶促反應的速度(V)隨底物濃度(S)的增加而迅速增加。若繼續(xù)增加底物濃度，反應速度的增加率將減少。當?shù)孜餄舛仍黾拥侥撤N程度時，反應速度會達到一個極限值，即最大反應速度(Vmax)，如圖37所示,底物濃度與酶促反應速度的這種關系可用Michaelis-Menten方程式表示。 V = VmaxS/(Km+S) 上式中Vmax為最大反應速度，S為底物濃度，Km為米氏常數(shù)(Michaelis constant)，而其中V則表示反應的起始速度。當V= Vmax/2時，Km =S。所以米氏常數(shù)是反應速度等于最大反應速度一半時底物的濃度。因此Km的單位以摩爾濃度(molL)表示。 Km是酶的最重要的特征性常數(shù)，測定Km值是研究酶動力學的一種重要方法，大多數(shù)酶的Km值在0.01-100(mmol/L)間。,酶促反應的最大速度Vmax實際上不易準確測定，Km值也就不易準確測出。林-貝 (1ineweaver - Burk)根據(jù)Michaelis-Menten方程，推導出如下方程式，即：(兩邊取倒數(shù)） 1/V = （Km +S）/ VmaxS 或1/V = Km/ Vmax（1/S）+1/ Vmax (得類似：y=ax+b的直線方程 ） y = 1/V， a = Km/ Vmax， x = 1/S b = 1/ Vmax,此式為直線方程，以不同的底物濃度1/S為橫坐標，以1/V為縱坐標，并將各點連成一直線，向縱軸方向延長，此線與橫軸相交的負截距為-1/ Km，由此可以正確求得該酶的Km值，如圖所示。,本實驗以堿性磷酸酶為例，測定不同底物濃度的酶活性，再根據(jù)Lineweaver-Burk法作圖，計算其Km值。 可以作為堿性磷酸酶底物的物質(zhì)很多，底物反應的酶對于不同的底物有不同的Km值。本實驗以磷酸苯二鈉為底物，由堿性磷酸酶催化水解，生成游離酚和磷酸鹽。酚在堿性條件下與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化，生成紅色的醌衍生物，顏色深淺和酚的含量成正比。根據(jù)吸光度的大小可以計算出酶的活性，也可以從標準曲線上查知酚的含量，進而算出酶活性的大小。反應式如下：,三、試劑與器材 10.04mol/L 基質(zhì)液 20.1molL碳酸鹽緩沖液pH10(37) 3堿性溶液 40.5鐵氰化鉀 50.3 4-氨基安替比林 6酚標準液(0.1mg/mL) 737恒溫水浴鍋 8可見光分光光度計,四、操作步驟 1酚標準曲線的繪制 ： 酚含量（g）： 0 5 10 20 30 40 (2)混勻后室溫放置15分鐘，于510nm波長處比色。 (3)以酚含量(g)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制酚標準曲線,2. 底物濃度對酶促反應速度的影響 最終基質(zhì)濃度單位：mol/ml (2)加入血清后，各管混勻并且立即記錄時間，將上述各管置37水浴中準確保溫15分鐘。 (3)保溫結(jié)束，立即加堿性溶液1.1mL終止反應。,(4)各管分別加入0.3 4-氨基安替比林1.OmL，0.5 鐵氰化鉀2.0mL，充分混勻，放置10分鐘，以6號空白管作對照，于510nm波長處比色測定，根據(jù)酚標準曲線計算酶活性。 (5)以各管基質(zhì)濃度的倒數(shù)1/S為橫坐標，以各管吸光度的倒數(shù)或者以酶活性單位的倒數(shù)1/V作縱坐標，作圖求出Km值。,結(jié)果與計算 在37保溫15分鐘，每生成1mg酚為一個酶活性單位，以標準曲線查出釋放酚量(g)即可算出酶活性。 100mL血清中酶活性 = 釋放的酚量（1/0.1）100（1/1000）=釋放的酚量（g） （釋放酚量（g）、1/0.1-0.1為實際取血清0.1ml、100為100ml血清、1000為g變?yōu)閙g。）,注意事項 1血清取量要準確 2標準曲線必須是一條直線,（一） Km值測定的意義,1.當反應速度為最大速度一半時，Vm = 1/2 Vmax，Km = S Km是指底物的濃度，含義：Km值等于酶促反應速度為最大速度一半時的底物濃度。 2. Km值可表示酶對底物的親和力。 Km值愈小，酶與底物的親和力愈大；表示不需要很高的 底物濃度便可容易地達到最大反應速度。 3.Km值是酶的特征性常數(shù)之一，只與酶的結(jié)構(gòu)、酶所催化的底物和反應環(huán)境相關，與酶的濃度無關。 各種酶的Km值范圍很廣。大多數(shù)酶在0.01-100mmol/L間；對于同一底物，不同的酶有不同的Km值；多底物反應的酶對于不同底物也有不同的Km值。,（二）酶活性（U/L） 酶活性單位：在特定條件下，酶促反應在單位時間內(nèi)生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所需的酶量。 酶活性