離心技術(shù)20120911(2011級(jí)臨床本科).ppt

分析與檢測(cè)技術(shù),主講人：宋濤 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,以常用分析與檢測(cè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)為主線，以細(xì)胞與分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科內(nèi)容為基礎(chǔ)，使醫(yī)學(xué)生初步掌握常用分析與檢測(cè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基本知識(shí)和技能、常規(guī)儀器設(shè)備的使用和保養(yǎng)，了解現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的基本知識(shí)，熟悉各種檢測(cè)指標(biāo)的臨床意義。,主講內(nèi)容：,一、離心原理與技術(shù) 二、常用標(biāo)記技術(shù) 三、其它實(shí)驗(yàn)技術(shù),離心原理與技術(shù),離心技術(shù)是指利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的離心力，根據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差別進(jìn)行物質(zhì)的分析、分離、濃縮和提純的一種技術(shù)。,洗衣機(jī)的脫水筒,“棉花”糖的制作,汽車轉(zhuǎn)彎,應(yīng)用：分離、純化樣品及對(duì)已純化的樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析。,離心技術(shù)是指利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的離心力，根據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差別進(jìn)行物質(zhì)的分析、分離、濃縮和提純的一種技術(shù)。,離心機(jī)（centrifuge）是實(shí)施離心技術(shù)的裝置。 它主要用于將懸浮液中的固體顆粒與液體分開(kāi)；或?qū)⑷闈嵋褐袃煞N密度不同，又互不相溶的液體分開(kāi)（例如從牛奶中分離出奶油）；它也可用于排除濕固體中的液體，例如用洗衣機(jī)甩干濕衣服；特殊的超速管式分離機(jī)還可分離不同密度的氣體混合物；利用不同密度或粒度的固體顆粒在液體中沉降速度不同的特點(diǎn)，有的沉降離心機(jī)還可對(duì)固體顆粒按密度或粒度進(jìn)行分級(jí)。,離心技術(shù)的應(yīng)用 1.用于工業(yè)生產(chǎn)的，如化工、制藥、食品等 工業(yè)大型制備用的離心技術(shù)，轉(zhuǎn)速都在 每分鐘5000轉(zhuǎn)以下。 2.用于生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等實(shí)驗(yàn)室分析研究 的，轉(zhuǎn)速?gòu)拿糠昼妿浊У綆兹f(wàn)轉(zhuǎn)以上，此 類技術(shù)的使用目的在于分離和純化樣品， 以及對(duì)純化的樣品有關(guān)性能進(jìn)行研究。,內(nèi)容：,第一節(jié) 離心技術(shù)的基本原理 第二節(jié) 離心設(shè)備 第三節(jié) 常用離心方法及應(yīng)用,第一節(jié) 離心技術(shù)的基本原理,一、離心的一般原理 二、離心力和相對(duì)離心力 三、沉降速度 四、沉降系數(shù) 五、沉降時(shí)間 六、測(cè)定相對(duì)分子量,一.基本原理 1.離心力 （Centrifugal force，F(xiàn)）：是指懸浮顆粒在離心過(guò)程中所受的離開(kāi)旋轉(zhuǎn)中心軸的作用力。 F=ma=m2r F:離心力（g.cm/s2或達(dá)因） m:顆粒質(zhì)量 a:加速度 :旋轉(zhuǎn)角速度 r：旋轉(zhuǎn)體離旋轉(zhuǎn)軸的距離 n:每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù) = (rad/sec),2n,60,2.相對(duì)離心力 Relative centrifugal force (RCF) RCF 就是在離心場(chǎng)中顆粒所受的離心力相當(dāng)于它受到的地球重力的倍數(shù)，稱為重力加速度。 RCF=F離心力/F重力 =m2r/mg=2r/g g為重力加速度（980cm/sec2),RCF= 1.11910-5 n2 r RCF =1.11910-5(12000)23.8 =6123g RCF =1.11910-5(12000)28.1 =13052g,Dole&Cotzias制作了轉(zhuǎn)子速度和半徑相對(duì)應(yīng)的離心力列線圖。,dx 2r2 (p-m) V= = . 2 X dt 9 d2 (p-m) = . 2 X 18 r： 球形粒子的半徑 d：球形粒子的直徑 ：流體介質(zhì)的粘度數(shù) p：粒子的密度 m：介質(zhì)的密度,3.沉降速度 Sedimentation velocity (1)定義：指在強(qiáng)大離心作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的距離。,p-m=0 即p=m V=0 S=0 粒子平衡 p-m0 即pm V0 S0 粒子達(dá)到某一位置后就達(dá)到平衡 p-m0 即pm1 V0 S0 粒子逆著離心方向上浮,4.沉降系數(shù) Sedimentation coefficient (S) 樣品沉降率 樣品顆粒的大小 形狀 密度 溶劑的粘度、密度 離心加速度,在一般情況下，樣品的沉降特征可以用沉降系數(shù)來(lái)表示: S是指單位離心場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。 沉降速度 V S= = = 單位離心力 2 r,dx/dt,2 r,S在實(shí)際應(yīng)用時(shí)常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個(gè)Svedberg單位，簡(jiǎn)寫(xiě)S，量綱為秒。,5.沉降時(shí)間(Sedimentation Time, Ts) dx/dt S= 2X 1 dx dt= 2S X 1 lnX2/X1 積分得 t2-t1= S 2,X2為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心管底內(nèi)壁的距離; X1為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎月面之間的距離, 樣品粒子完全沉降到底管內(nèi)壁的時(shí)間(t2-t1)用Ts表示則式可改為 1 lnXmax-lnXmin Ts= S 2 Ts以小時(shí)為單位,S以Svedberg為單位。,第二節(jié) 離心設(shè)備,一、離心機(jī) 二、離心機(jī)的基本構(gòu)造 三、離心轉(zhuǎn)頭 四、離心管 五、離心機(jī)使用注意事項(xiàng),一、離心機(jī),離心機(jī)的基本構(gòu)造,驅(qū)動(dòng)電機(jī)、制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、顯示系統(tǒng)、自動(dòng)保護(hù)系統(tǒng)、控制系統(tǒng)、光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)（分析型） 必要配件：轉(zhuǎn)頭和離心管,（二）.轉(zhuǎn)子(Rotor) 固定角式轉(zhuǎn)子 水平轉(zhuǎn)子 垂直轉(zhuǎn)子 帶狀轉(zhuǎn)子 連續(xù)轉(zhuǎn)子 分析轉(zhuǎn)頭,轉(zhuǎn)子的材質(zhì)： 鋁質(zhì) 較輕,耐受強(qiáng)度較弱,適合在較低 的轉(zhuǎn)速下使用; 不銹鋼 耐受強(qiáng)度最好,但材質(zhì)本身太重； 鈦合金 耐受強(qiáng)度不錯(cuò),重量也比不銹鋼輕。,1.水平轉(zhuǎn)子 （1）轉(zhuǎn)子靜止時(shí),處在轉(zhuǎn)子中的離心管中 心線與旋轉(zhuǎn)軸平行, （2）轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)加速時(shí),離心管中心線由 行位置逐漸過(guò)渡到垂直位置,即與旋 轉(zhuǎn)軸成90角, （3）粒子的沉淀方向同旋轉(zhuǎn)半徑方向基本 一致有少量的“管壁效應(yīng)”,水平轉(zhuǎn)子的特點(diǎn)： （1）轉(zhuǎn)子的重心位置較高 （2）樣品粒子沉降穿過(guò)溶劑層的距離大于 直徑 （3）對(duì)于多種成分樣品分離特別有效 （4）常用于速率區(qū)帶離心和等密度離心,2.固定角式轉(zhuǎn)子 離心管在離心機(jī)中放置的位置與旋轉(zhuǎn)軸心形成一個(gè)固定的角度,角度變化在14-40之間。 常見(jiàn)的角度 20 28 34 40,裝入溶液的離心管與轉(zhuǎn)軸間的角度是轉(zhuǎn)子制造時(shí)形成的，永遠(yuǎn)不能改變。離心過(guò)程中離心管位置不變，樣品發(fā)生重定向，離心管與轉(zhuǎn)軸間的夾角越小，重定向的程度越打，離心的效率就越高。,角轉(zhuǎn)子的工程過(guò)程,a,b,c,d,a制備梯度，裝樣，把離心管插入轉(zhuǎn)子中； b,離心機(jī)加速過(guò)程中，梯度和樣品層發(fā)生重定向（變成徑向）； c,顆粒沉降形成區(qū)帶；d,轉(zhuǎn)子停止過(guò)程中，再次定向（變成垂直梯度）,角轉(zhuǎn)子由轉(zhuǎn)子體、轉(zhuǎn)子蓋、手提把和測(cè)速環(huán)等組成，轉(zhuǎn)字體中有離心管孔和底座軸孔。底座軸孔坐在轉(zhuǎn)子驅(qū)動(dòng)軸上，驅(qū)動(dòng)軸的軸頭插入其中。 角轉(zhuǎn)子的基本參數(shù)包括:可以容納的離心管數(shù)目、最大裝樣量、最高轉(zhuǎn)速、最大離心半徑、最小離心半徑、平均離心半徑、k系數(shù)、最大相對(duì)離心加速度、離心管與轉(zhuǎn)軸間的夾角、轉(zhuǎn)子重量以及轉(zhuǎn)子材料等。,角式轉(zhuǎn)子的特點(diǎn)： （1）重心低,轉(zhuǎn)速可較高 （2）樣品粒子穿過(guò)溶劑層的距離略大于 離心管的直徑; （3）“管壁效應(yīng)” ：,角式轉(zhuǎn)子的特點(diǎn)： （3）“管壁效應(yīng)” ： 顆粒在角轉(zhuǎn)子中沉降時(shí)，沿離心力方向先撞到管壁，然后沿管壁再滑向管底。因此，在試管的一側(cè)就會(huì)出現(xiàn)顆粒的沉積，此現(xiàn)象稱為壁效應(yīng)（wall effects）。壁效應(yīng)容易使沉降顆粒受突然變速而產(chǎn)生對(duì)流干擾，尤其在分離沉降特性相似的顆粒時(shí)更為明顯。,離心管孔的傾角對(duì)沉降分離效果的影響很大，角度大，顆粒沉降路徑長(zhǎng)，分離效果好。角度小，顆粒沉淀距離短，沉淀分離所需時(shí)間短，分離效率高。,在使用角轉(zhuǎn)子時(shí)應(yīng)注意，離心管要受到強(qiáng)大離心場(chǎng)的作用，軟質(zhì)離心管（如聚丙烯）在管子沒(méi)有裝滿液體的情況下會(huì)塌陷。硬質(zhì)離心管（如聚碳酸脂）反復(fù)使用時(shí)會(huì)破裂。,設(shè)40000rpm時(shí) R1最小、 3.8cm R2平均、 5.9cm R3最大、 8.1cm RCF值分別 67,910g 105,400g 144,700g,R1,R2,R3,在離心管的不同部位距旋轉(zhuǎn)中心軸的距離也不同,那么在一定的轉(zhuǎn)速下其RCF值也各不相同,3.垂直轉(zhuǎn)子 離心管垂直插入轉(zhuǎn)子孔內(nèi),在離心過(guò)程中始終與旋轉(zhuǎn)軸平行,而離心時(shí)液層發(fā)生90角的變化,從開(kāi)始的水平方向改成垂直方向,當(dāng)轉(zhuǎn)子降速時(shí),垂直分布的液層又逐漸趨向水平,待旋轉(zhuǎn)停止后,液面又完全恢復(fù)成水平方向。,四、離心管,材料：玻璃（低速）、塑料、不銹鋼（高速、超速）,五、離心機(jī)使用注意事項(xiàng),1、離心要平穩(wěn) 2、平衡 3、低檔啟動(dòng) 4、合適的轉(zhuǎn)頭和轉(zhuǎn)速 5、干燥清潔 6、按需選用離心管 7、低溫離心樣品需預(yù)冷 8、異常情況，停機(jī)檢查 9、校正,第三節(jié) 常用離心方法及應(yīng)用,(一).差速離心法 1、原理 利用不同的粒子在離心力場(chǎng)中沉降的差別,在同一離心條件下,沉降速度不同,通過(guò)不斷增加相對(duì)離心力,使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。 操作過(guò)程中一般是在離心后傾倒的辦法把上清液與沉淀分開(kāi),然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心,分離出第二部分沉淀,如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速,逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。,差速離心的分辨率不高,沉淀系數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種粒子不容易分開(kāi),常用于其他分離手段之前的粗制品提取。,2.注意點(diǎn)： 可用角式、水平式轉(zhuǎn)頭 可用剎車 難以獲得高純度,差速離心法原理示意圖,已破碎的細(xì)胞 500g,10分鐘 沉淀 上清液 (細(xì)胞核） 10,000g,10分鐘 沉淀 上清液 (細(xì)胞膜碎片,線粒體,) 100,000g,3小時(shí) 溶酶體 沉淀 上清液 (核糖核蛋白體） (可溶性成份),例：用差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份,（2）密度梯度離心法(又稱區(qū)帶離心法) 該法又分為速率區(qū)帶離心法和等密度區(qū)帶離心法。 樣品在一定惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉淀或沉降平衡，在一定離心力下把顆粒分配到梯度液中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。該法的優(yōu)點(diǎn)是：具有很好的分辨率，分離效果好，可一次獲得較純顆粒；適用范圍廣，既能分離沉淀系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度的顆粒；顆粒不會(huì)積壓變形，能保持顆?；钚?，并防止已形成的區(qū)帶由于對(duì)流而引起混合。缺點(diǎn)是：離心時(shí)間較長(zhǎng)；需要制備梯度液；操作嚴(yán)格，不宜掌握。,速率區(qū)帶離心法 1.原理 是根據(jù)分離的粒子在離心力作用下，在梯度液中沉降速度的不同，離心后具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)形成幾條分開(kāi)的樣品區(qū)帶，達(dá)到彼此分離的目的。,速率區(qū)帶離心示意圖,臨床常使用的分離液是聚蔗糖（Ficoll）、二氧化硅膠體Percoll及蔗糖。把靜脈血中單個(gè)核細(xì)胞分離出來(lái)，前一種分離液將血液中單個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）分為一個(gè)層，同時(shí)提出。而Percoll分離液將血中淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞分為二個(gè)梯度層，分別提取。后者分離效果優(yōu)于前者，但操作繁瑣。,梯度液在離心過(guò)程中以及離心完畢后,取樣時(shí)起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用,避免因機(jī)械振動(dòng)而引起已分層的粒子再混合。 由于pm則S0, 該離心法的離心時(shí)間要嚴(yán)格控制,即有足夠的時(shí)間使各種粒子在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶,又要控制在任一粒子達(dá)到沉淀前。 此法是一種不完全的沉降,沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大,一般是應(yīng)用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。,2.注意點(diǎn)： 嚴(yán)格控制離心時(shí)間 pm 事先配成較平緩的連續(xù)密度的梯度溶液 不能用角式轉(zhuǎn)頭、只能用水平式轉(zhuǎn)頭 不能用剎車,等密度離心法 1原理 當(dāng)不同顆粒存在浮力密度差時(shí)，在離心力場(chǎng)下，顆?；蛳蛳鲁两?，或向上浮起，一直沿梯度移動(dòng)到它們密度恰好相等的位置上（即等密度點(diǎn)）形成區(qū)帶，稱為等密度區(qū)帶離心法。 等密度區(qū)帶離心的有效分離取決于顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒的大小和形狀無(wú)關(guān)，但后兩者決定著達(dá)到平衡的速率、時(shí)間和區(qū)帶的寬度。,等密度區(qū)帶離心示意圖,特點(diǎn)： （1）與樣品粒子的密度有關(guān) （2）與樣品粒子的大小和其他參數(shù)無(wú)關(guān) （3）轉(zhuǎn)速、溫度不變,則延長(zhǎng)離心時(shí)間也 不能改變這些粒子的成帶位置。,2.注意點(diǎn)： 離心時(shí)間要長(zhǎng) 可用角式轉(zhuǎn)頭或水平式轉(zhuǎn)頭 粒子密度相近或相等時(shí)不宜用 密度梯度溶液中要包含所有粒子密度 不能用剎車,四. 梯度溶液的制備 (一).梯度材料的選擇原則: 1、與被分離的生物材料不發(fā)生反應(yīng)。 2、可達(dá)到要求的密度范圍,且在所要求的密 度范圍內(nèi),粘度低,滲透壓低,離子強(qiáng)度和 pH變化較小。 3、不會(huì)對(duì)離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。 4、容易純化,價(jià)格便宜或容易回收。 5、濃度便于測(cè)定,如具有折光率。 6、對(duì)于分析超速離心工作來(lái)說(shuō),它的物理性 質(zhì),熱力學(xué)性質(zhì)應(yīng)該是已知的。,常用的梯度材料： .糖類: 蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右 旋糖酐、糖原 無(wú)機(jī)鹽類:CsCl(氯化銫)、RbCl(氯化銣)、 NaCl、KBr等 有機(jī)碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等 硅溶膠: 如Percoll。 蛋白質(zhì):如牛血清白蛋白 重水 非水溶性有機(jī)物:如氟代碳等,(二).梯度材料的應(yīng)用范圍 1.蔗糖: 水溶性大 性質(zhì)穩(wěn)定 滲透壓較高 最高密度可達(dá)1.33g/ml, 價(jià)格低 容易制備, 常用于細(xì)胞器、病毒、RNA分離的梯度材料 有較大的滲透壓,不宜用于細(xì)胞的分離。,2.聚蔗糖: 商品名Ficoll, 滲透壓低 粘度卻特別高,為此常與泛影葡胺混合使用 以降低粘度 用于分離各種細(xì)胞包括血細(xì)胞、成纖維細(xì) 胞、腫瘤細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞,3.氯化銫: 離子性介質(zhì) 水溶性大 最高密度可達(dá)1.91g/ml 重金屬鹽類,在離心時(shí)形成的梯度有較 好的分辨率 被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋 白的分離 價(jià)格較貴,4.鹵化鹽類: KBr和NaCl可用于脂蛋白分離 KI和NaI可用于RNA分離,其分辨率高于銫鹽 NaCl梯度 可用于分離脂蛋白 NaI梯度可分離天然或變性的DNA。,5.Percoll: SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮 滲透壓低 對(duì)生物材料的影響小 顆粒穩(wěn)定 在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的 粘度高 在酸性pH和高離子強(qiáng)度下不穩(wěn)定 用于細(xì)胞、細(xì)胞器和病毒的分離,五.分析性超速離心 為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu),而不是專門(mén)收集某一特定組分。 它使用了特殊的轉(zhuǎn)子和檢測(cè)手段,以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場(chǎng)中的沉降過(guò)程。,分析性超速離心的工作原理,橢圓形的轉(zhuǎn)子 一套真空系統(tǒng) 一套光學(xué)系統(tǒng),轉(zhuǎn)子通過(guò)一個(gè)柔性的軸聯(lián)接成一個(gè)高速的驅(qū)動(dòng)裝置,這軸可使轉(zhuǎn)子在旋轉(zhuǎn)時(shí)形成自己的軸。轉(zhuǎn)子在一個(gè)冷凍的真空腔中旋轉(zhuǎn)，其容納兩個(gè)小室：分析室和配衡室。,分析室的容量一般為1ml，呈扇形排列在轉(zhuǎn)子中，其工作原理與一個(gè)普通水平轉(zhuǎn)子相同。分析室有上下兩個(gè)平面的石英窗，離心機(jī)中裝有的光學(xué)系統(tǒng)可保證在整個(gè)離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質(zhì)，可以通過(guò)對(duì)紫外光的吸收（如對(duì)蛋白質(zhì)和DNA）或折射率的不同對(duì)沉降物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在分析室中物質(zhì)沉降時(shí)重粒子和輕粒子之間形成的界面就像一個(gè)折射的透鏡，結(jié)果在檢測(cè)系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)出一個(gè)“峰”，由于沉降不斷進(jìn)行，界面向前推進(jìn)，故“峰”也在移動(dòng)，從峰移動(dòng)的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標(biāo)。,在分析室中物質(zhì)沉降時(shí)重粒子和輕粒子之間形成的界面就像一個(gè)折射的透鏡，結(jié)果在檢測(cè)系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)出一個(gè)“峰”，由于沉降不斷進(jìn)行，界面向前推進(jìn)，故“峰”也在移動(dòng)，從峰移動(dòng)的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標(biāo)。,轉(zhuǎn)子容納二個(gè)小室: 分析室 配衡室 ：經(jīng)過(guò)精密加工的金屬塊,作為分析 室的平衡用。 分析室：容量為1毫升,呈扇形排列在轉(zhuǎn)子中。其有上下二個(gè)平面的石英窗,離心機(jī)中裝有的光學(xué)系統(tǒng)可保證在整個(gè)離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質(zhì), 通過(guò)對(duì)紫外光的吸收或折射率的不同對(duì)沉降物進(jìn)行監(jiān)視。,折射率原理: 當(dāng)光線通過(guò)一個(gè)具有不同密度區(qū)的透明液時(shí),在這些區(qū)帶的界面上產(chǎn)生光的折射。 在分析室中物質(zhì)沉降時(shí)重粒子和輕粒子之間形成的界面就象一個(gè)折射的透鏡,結(jié)果在檢測(cè)系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)生一“峰”。由于沉降不斷進(jìn)行,界面向前推進(jìn),故“峰”也在移動(dòng),從峰移動(dòng)的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標(biāo)。,(二).分析性超速離心的應(yīng)用 1.測(cè)定生物大分子的相對(duì)分子重量 沉降速度 沉降平衡 接近沉降平衡 沉降速度：超速離心在高速中進(jìn)行, 使得任意分布的粒子通過(guò)溶劑從旋轉(zhuǎn)的中心輻射地向外移動(dòng),在清除了粒子的那部分溶劑和尚含有沉降物的那部分溶劑之間形成一個(gè)明顯的界面,該界面隨時(shí)間移動(dòng)而移動(dòng),這就是粒子沉降速度的一個(gè)指標(biāo),然后用照像記錄,即可求出粒子的沉降系數(shù)。,dx/dt S = 2X RTS M = D(1-) M-該分子不含水的相對(duì)分子重量; R-氣體常數(shù); T-絕對(duì)溫度; S-分子的沉降系數(shù); -分子的微分比容(當(dāng)一克溶質(zhì)加到一個(gè)大體積的溶液中所占有的體積; -溶劑的密度。,2.生物大分子的純度估計(jì) 3.分析生物大分子中的構(gòu)象變化,六、離心機(jī)的應(yīng)用和維護(hù) （1）離心方法的選擇: 選擇合適的離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間，就能達(dá)到較好的分離效果。 若樣品中存在兩種以上質(zhì)量和密度不同的樣品顆粒，可采用差速離心法。 對(duì)于有密度梯度差異的樣品介質(zhì)，可采用密度梯度離心法。 若不同樣品顆粒的密度范圍在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，離心時(shí)密度不同的物質(zhì)顆粒因浮力差異或向下沉降，或向上漂浮，一直移到它們各自密度恰好對(duì)應(yīng)的位置（等密度點(diǎn)），形成區(qū)帶?？刹捎玫让芏忍荻入x心。 （2）離心時(shí)間以及溫度和pH值的確定 （3）離心機(jī)的使用、維護(hù)： （4）離心機(jī)常見(jiàn)故障及排除方法：,（1）離心方法的選擇: （2）離心時(shí)間以及溫度和pH值的確定 離心時(shí)間：依據(jù)離心方法的不同有所差別。差速離心是指某種顆粒完全沉降到離心管底的時(shí)間。等密度梯度離心是指顆粒完全到達(dá)等密度點(diǎn)的平衡時(shí)間。密度梯度離心所需的離心時(shí)間則是指形成界限分明的區(qū)帶的時(shí)間。 溫度和pH值：為了防止欲分離物質(zhì)的凝集、變性和失活，除了在離心介質(zhì)的選擇方面加以注意外，還必須控制好溫度及介質(zhì)溶液的pH值等離心條件。離心溫度一般控制在4度左右，對(duì)于某些熱穩(wěn)定性較好的酶等，也可以在室溫下進(jìn)行。 （3）離心機(jī)的使用、維護(hù)： （4）離心機(jī)常見(jiàn)故障及排除方法：,（1）離心方法的選擇: （2）離心時(shí)間以及溫度和pH值的確定 （3）離心機(jī)的使用、維護(hù)：各類離心機(jī)因其轉(zhuǎn)速高，產(chǎn)生的離心力大，使用不當(dāng)或缺乏定期的檢修和保養(yǎng)，都可能發(fā)生嚴(yán)重事故，因此使用離心機(jī)時(shí)都必須嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。 （4）離心機(jī)常見(jiàn)故障及排除方法：,離心機(jī)的應(yīng)用和維護(hù) （1）離心方法的選擇: （2）離心時(shí)間以及溫度和pH值的確定 （3）離心機(jī)的使用、維護(hù)： （4）離心機(jī)常見(jiàn)故障及排除方法： 電機(jī)不轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)頭的損壞 機(jī)體震動(dòng)劇烈、響聲異常。有許多故障為不正確操作所致，正確操作可減少或消除故障。在工作過(guò)程中，如出現(xiàn)任何異?，F(xiàn)象均應(yīng)立即停機(jī)，檢查原因，不得強(qiáng)行運(yùn)轉(zhuǎn)，以免產(chǎn)生不必要的損失。,關(guān)于制作“棉花”糖的原理：,它的內(nèi)筒與洗衣機(jī)的脫水筒相似，里面加入白砂糖，加熱使糖熔化成糖汁。內(nèi)筒高速旋轉(zhuǎn)，黏稠的糖汁就做離心運(yùn)動(dòng)，從內(nèi)筒壁的小孔飛散出去，成為絲狀，到達(dá)溫度較低的外筒時(shí)，迅速冷卻凝固，變得纖細(xì)雪白，像一團(tuán)團(tuán)棉花。,在水平公路上行駛的汽車轉(zhuǎn)彎,三、離心運(yùn)動(dòng)的防止：,1、在水平公路上行駛的汽車轉(zhuǎn)彎時(shí),F m,r,2,F,汽車,在水平公路上行駛的汽車，轉(zhuǎn)彎時(shí)所需的向心力是由車輪與路面的靜摩擦力提供的。如果轉(zhuǎn)彎時(shí)速度過(guò)大，所需向心力F大于最大靜摩擦力Fmax，汽車將做離心運(yùn)動(dòng)而造成交通事故。因此，在公路彎道處，車輛行駛不允許超過(guò)規(guī)定的速度。,閱讀離心機(jī)使用說(shuō)明書(shū)，轉(zhuǎn)頭說(shuō)明書(shū) 說(shuō)明書(shū)應(yīng)該放置在離心機(jī)旁邊，使用前必須仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū) 防止事故發(fā)生,離心機(jī)事故,離心機(jī)高速運(yùn)轉(zhuǎn)，使用不當(dāng)或者維護(hù)不當(dāng)，會(huì)出嚴(yán)重事故 主要是轉(zhuǎn)頭事故，轉(zhuǎn)頭爆炸,離心機(jī)的安全使用,說(shuō)明書(shū)與相關(guān)資料 機(jī)器、轉(zhuǎn)頭、離心管正確使用方法 專人管理，維護(hù)保養(yǎng)，排出故障,離心基本概念,轉(zhuǎn)速 離心力和相對(duì)離心力 容量 K因子,轉(zhuǎn)速的描述,RPM 轉(zhuǎn)/分 角速度每秒轉(zhuǎn)過(guò)的弧度數(shù) 1 弧度即為弧長(zhǎng)等于半徑的圓弧所對(duì)的圓心角,“ 轉(zhuǎn)速 ” 的含義,離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速 轉(zhuǎn)頭的最高轉(zhuǎn)速 轉(zhuǎn)頭的最高允許轉(zhuǎn)速 轉(zhuǎn)頭的允許轉(zhuǎn)速,離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速,可以用于該離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭中，轉(zhuǎn)速最高的這個(gè)轉(zhuǎn)速，是離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速,轉(zhuǎn)頭的最高轉(zhuǎn)速,轉(zhuǎn)頭蓋上標(biāo)明的轉(zhuǎn)速 應(yīng)注意，同一轉(zhuǎn)頭在不同離心機(jī)中使用，不一定都能達(dá)到轉(zhuǎn)頭的最高轉(zhuǎn)速使用,轉(zhuǎn)頭的最高允許轉(zhuǎn)速,樣品密度不超過(guò)1.2克/ml的情況下，和以下因素有關(guān)： 離心機(jī)型號(hào) 離心管形狀、材料、厚度 （注意，同樣的離心管在不同轉(zhuǎn)頭中使用，最高允許轉(zhuǎn)速也可能不同） 離心管帽的材質(zhì) 離心管是否裝滿 是否用適配器 必須根據(jù)實(shí)際使用情況，從轉(zhuǎn)頭手冊(cè)和轉(zhuǎn)頭說(shuō)明書(shū)中查詢,轉(zhuǎn)頭的允許轉(zhuǎn)速,樣品密度超過(guò)了1.2克/ml的情況下： 轉(zhuǎn)頭的允許轉(zhuǎn)速=轉(zhuǎn)頭的最高允許轉(zhuǎn)速（1.2/樣品的平均密度）1/2 注意：不適用于密度梯度離心,離心力和相對(duì)離心力,“離心力是多少個(gè)g”的提法不對(duì) 離心力=粒子質(zhì)量離心加速度 （F離心力=mr 2） 相對(duì)離心力RCF= F離心力/F重力= r 2/g,RCF與RPM換算, = 2 RPM/60 = 0.10472 RPM RCF= r 2/g=（ 0.10472 RPM ）2r/g r以毫米為單位時(shí)， RCF=1.12r（RPM/1000）2 RPM=1000（RCF/1.12r）1/2 例：文獻(xiàn)給出條件為80000g， RPM=1000（80000/1.12r）1/2,轉(zhuǎn)頭的K系數(shù),什麼是轉(zhuǎn)頭的K系數(shù),K系數(shù)是轉(zhuǎn)頭的一個(gè)特性指標(biāo)，它的大小可以衡量轉(zhuǎn)頭離心效率的高低.,轉(zhuǎn)頭的K值可以查表得到,K 系數(shù)的計(jì)算,R max: 轉(zhuǎn)頭的最大半徑. R min 轉(zhuǎn)頭的最小半徑. RPM: 轉(zhuǎn)頭的轉(zhuǎn)速,在離心時(shí)，估算沉降時(shí)間 t ：離心時(shí)間（小時(shí)）。 K ：實(shí)際轉(zhuǎn)速下的轉(zhuǎn)頭K值。 S ：粒子的沉降系數(shù)。,K系數(shù)的應(yīng)用,從一個(gè)轉(zhuǎn)頭換成另一個(gè)轉(zhuǎn)頭時(shí)估算沉降時(shí)間. (即根據(jù)文獻(xiàn)資料,使用現(xiàn)有的轉(zhuǎn)頭,建立實(shí)驗(yàn)條件) 利用已知轉(zhuǎn)頭的實(shí)驗(yàn)條件,使用另一個(gè)轉(zhuǎn)頭,分離相同樣品時(shí),如何確定實(shí)驗(yàn)條件。,K值的應(yīng)用,K值的應(yīng)用,同一轉(zhuǎn)頭，改變離心轉(zhuǎn)速時(shí)，計(jì)算離心時(shí)間：,K值的應(yīng)用,K值越小，轉(zhuǎn)頭