(好資料)免疫學(xué)技術(shù)之二十八__哺乳動(dòng)物細(xì)胞總rna的分離

哺乳動(dòng)物細(xì)胞總RNA的分離哺乳動(dòng)物細(xì)胞總的分離 細(xì)胞的裂解提取步驟注意事項(xiàng)這一從培養(yǎng)的單層哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離RNA的實(shí)驗(yàn)程序系為Favaloro 等（1980）所介紹程序的改良。該程序同樣適用于從懸浮培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中或從易于分散成單個(gè)細(xì)胞的哺乳動(dòng)物組織中分離RNA。但不適用于從固體組織中提取RNA，因?yàn)橛眠@種裂解細(xì)胞的方法（在SDS存在的條件下用蛋白酶K消化）去消化組織速度很慢，導(dǎo)致內(nèi)源性RNA酶在被蛋白酶K消化或被抑制劑滅活前有時(shí)間發(fā)揮作用。原方案中（Favaloro等。1980）采用的裂解緩沖液含有0.015 （W/V）的Macaloid（硅藻土），用于吸附并滅活RNA酶。盡管現(xiàn)仍有Macaloid出售NL Chemicals）， 但氧釩核糖核苷復(fù)合物和RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑更常用。下述程序的優(yōu)點(diǎn)是速度快，并能同時(shí)處理很多樣品。一、細(xì)胞的裂解單層細(xì)胞的裂解懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或組織單細(xì)胞懸液的裂解a單層細(xì)胞的裂解a）吸出培養(yǎng)液，以7ml用冰預(yù)冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖洗細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的單層細(xì)胞，重復(fù)1次，將平板置于冰上直至所有單層細(xì)胞沖洗完畢。也可將平板放在一塊鋁板上，再將鋁板置于冰盤上。b）直徑為90mm的培養(yǎng)皿需加0.5ml RNA提取緩沖液， 并使之遍布整個(gè)平板的表面。RNA提取緩沖注液0.14mol/L NaCl1.5mmol/L MgCl210mmol/L Tris.Cl(pH8.6)0.5NP-401mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）100單位/ml胎盤RNA酶抑制劑或20mmol/L氧釩核糖核苷復(fù)合物c）加0.5ml蛋白酶消化緩沖液，用刮棒混勻粘稠狀裂解物并將其刮到平板的邊緣。蛋白酶消化緩沖液0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0)25mmol/L EDTA(pH8.0)0.3mol/L NaCl2 SDSd）用裝有21號(hào)針頭的皮下注射器抽吸細(xì)胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內(nèi)。重復(fù)34次，剪切DNA。c）加蛋白酶K至終濃度為200g/ml，充分混勻后置于37溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存液的形式保存，貯存液為20mg/ml 蛋白K溶液。 b懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或組織單細(xì)胞懸液的裂解a）于4以2000g離心5分鐘收集細(xì)胞，以10倍體積用冰預(yù)冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉淀，洗滌細(xì)胞3次，每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使其徹底分散。b）估計(jì)細(xì)胞沉淀的體積，用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。c）加入與步驟b）所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液，用振蕩器迅速混勻。用裝有21號(hào)針頭的皮下注射器抽吸細(xì)胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內(nèi)。重復(fù)34次，剪切DNA。d）加蛋白酶K至終濃度為200g/ml，充分混勻后置于37溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存的形式保存，貯存液為20g/ml蛋白酶K水溶液。二、提取步驟1）用等體積酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白質(zhì)。2）用吊桶式轉(zhuǎn)頭于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機(jī)相分相， 將水相吸至一個(gè)新的離心管內(nèi)，加2.5倍體積用冰預(yù)次序的乙醇，充分混勻， 于0放置1小時(shí)。3）于0以5000g離心10分鐘沉淀RNA，棄上清，用含0.1mol/L 乙酸鈉（pH5.2）的70乙酸洗滌沉淀，用自動(dòng)微量移液器盡可能將乙醇吸盡， 隨后于室溫放置幾分鐘，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因?yàn)楦傻暮怂岢恋砗茈y溶解。4）每個(gè)直徑為90mm的培養(yǎng)皿或每107細(xì)胞加200l 50mmol/L Tris.Cl( pH7.8)1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重溶沉淀。5）分別按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫蘇糖醇（DTT），然后分別按1000單位/或10mmol/L 的終深度加臺(tái)盤RNA酶抑制劑或氧釩核苷復(fù)合物。6）加入無RNA酶的胰DNA酶I至終濃度為2g/ml，混勻，于37溫育60分鐘。7）分別按10mmol/L和0.2的終濃度加EDTA和SDS。8）用等體積酚：氯仿抽提1次。9）于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機(jī)相分相， 將水相吸至另一個(gè)離心管內(nèi)，加3mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L，加2.5倍體積用冰預(yù)次的乙醇，充分混勻，冰浴放置2小時(shí)。10）用微量離心機(jī)于4以12 000g離心5分鐘沉淀RNA。11）吸出所有的乙醇，將打開管蓋的離心管在實(shí)驗(yàn)臺(tái)放置幾分鐘，讓最后殘存的痕量乙醇揮發(fā)干凈。12）用200l TE（pH7.6）重溶沉淀，加500l乙醇，于70 貯存?zhèn)溆谩；厥誅NA時(shí)，只須取出1小份貯存液，加入3mol/L乙酸鈉（pH5.2 ）至終濃度為0.3mol/L，充分混勻，用微量離心機(jī)于4以12 000g離心5分鐘即可。三、注意事項(xiàng)1測(cè)定最終所得溶液的OD260值可以確定RNA的濃度。取10l乙醇/TE混合液步驟13）離心沉淀RNA，以400水重溶， 測(cè)定OD260 值， OD2601的RNA溶液每毫升約含40g RNA。2.如果需要，可用oligo(dT) 纖維素層析法從所制備的細(xì)胞總RNA中純化無寡脫氧核糖核苷酸污染的mRNA或購(gòu)買試劑盒進(jìn)行mRNA的純化。3.某些情況下（例如從感染了DNA病毒或用DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中制備RNA時(shí)），必須從細(xì)胞總RNA中去除寡脫氧核核苷酸。否則，當(dāng)用這種RNA構(gòu)建cDNA庫或進(jìn)行引物延伸反應(yīng)時(shí)應(yīng)會(huì)出問題， 反轉(zhuǎn)錄過程中法染的模板DNA片段可能會(huì)與RNA雜交而充當(dāng)引物，從而導(dǎo)致物定mRNA5末端定位的錯(cuò)誤或產(chǎn)生截短的cDNA克隆。a）步驟12后，加200l 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），用自動(dòng)微量移液器反復(fù)吹吸，以重懸核酸沉淀，將懸浮液移至另一個(gè)滅菌的微量離心管內(nèi)。b）用微量離心機(jī)于室溫以12 000g離心10分鐘，RNA沉于管底，而絕大部分寡脫氧核糖核苷酸仍在上清中。c）棄上清液，用200l TE（pH7.6）重溶沉淀。加入20l 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），分混勻，加入550l用冰預(yù)冷的乙醇?；靹蛉芤?， 在冰上驟冷30分鐘。用微量離心機(jī)于4以12 000g離主10分鐘，以回收RNA。小心吸出上清。d）棄上清液，用300l TE（pH7.6）重溶沉淀，加1ml乙醇，70貯存?zhèn)溆谩；厥誖NA時(shí)，只需取出1小份貯存液，加3mol乙酸鈉（pH5.2 ）至終濃度為0.3mol/L充分