(好資料)免疫學技術之二十八__哺乳動物細胞總rna的分離

哺乳動物細胞總RNA的分離哺乳動物細胞總的分離 細胞的裂解提取步驟注意事項這一從培養(yǎng)的單層哺乳動物細胞中分離RNA的實驗程序系為Favaloro 等（1980）所介紹程序的改良。該程序同樣適用于從懸浮培養(yǎng)的哺乳動物細胞中或從易于分散成單個細胞的哺乳動物組織中分離RNA。但不適用于從固體組織中提取RNA，因為用這種裂解細胞的方法（在SDS存在的條件下用蛋白酶K消化）去消化組織速度很慢，導致內(nèi)源性RNA酶在被蛋白酶K消化或被抑制劑滅活前有時間發(fā)揮作用。原方案中（Favaloro等。1980）采用的裂解緩沖液含有0.015 （W/V）的Macaloid（硅藻土），用于吸附并滅活RNA酶。盡管現(xiàn)仍有Macaloid出售NL Chemicals）， 但氧釩核糖核苷復合物和RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑更常用。下述程序的優(yōu)點是速度快，并能同時處理很多樣品。一、細胞的裂解單層細胞的裂解懸浮培養(yǎng)的細胞或組織單細胞懸液的裂解a單層細胞的裂解a）吸出培養(yǎng)液，以7ml用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖洗細胞培養(yǎng)皿內(nèi)的單層細胞，重復1次，將平板置于冰上直至所有單層細胞沖洗完畢。也可將平板放在一塊鋁板上，再將鋁板置于冰盤上。b）直徑為90mm的培養(yǎng)皿需加0.5ml RNA提取緩沖液， 并使之遍布整個平板的表面。RNA提取緩沖注液0.14mol/L NaCl1.5mmol/L MgCl210mmol/L Tris.Cl(pH8.6)0.5NP-401mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）100單位/ml胎盤RNA酶抑制劑或20mmol/L氧釩核糖核苷復合物c）加0.5ml蛋白酶消化緩沖液，用刮棒混勻粘稠狀裂解物并將其刮到平板的邊緣。蛋白酶消化緩沖液0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0)25mmol/L EDTA(pH8.0)0.3mol/L NaCl2 SDSd）用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內(nèi)。重復34次，剪切DNA。c）加蛋白酶K至終濃度為200g/ml，充分混勻后置于37溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存液的形式保存，貯存液為20mg/ml 蛋白K溶液。 b懸浮培養(yǎng)的細胞或組織單細胞懸液的裂解a）于4以2000g離心5分鐘收集細胞，以10倍體積用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉淀，洗滌細胞3次，每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細胞沉淀，使其徹底分散。b）估計細胞沉淀的體積，用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。c）加入與步驟b）所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液，用振蕩器迅速混勻。用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內(nèi)。重復34次，剪切DNA。d）加蛋白酶K至終濃度為200g/ml，充分混勻后置于37溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存的形式保存，貯存液為20g/ml蛋白酶K水溶液。二、提取步驟1）用等體積酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白質(zhì)。2）用吊桶式轉(zhuǎn)頭于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相， 將水相吸至一個新的離心管內(nèi)，加2.5倍體積用冰預次序的乙醇，充分混勻， 于0放置1小時。3）于0以5000g離心10分鐘沉淀RNA，棄上清，用含0.1mol/L 乙酸鈉（pH5.2）的70乙酸洗滌沉淀，用自動微量移液器盡可能將乙醇吸盡， 隨后于室溫放置幾分鐘，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因為干的核酸沉淀很難溶解。4）每個直徑為90mm的培養(yǎng)皿或每107細胞加200l 50mmol/L Tris.Cl( pH7.8)1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重溶沉淀。5）分別按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫蘇糖醇（DTT），然后分別按1000單位/或10mmol/L 的終深度加臺盤RNA酶抑制劑或氧釩核苷復合物。6）加入無RNA酶的胰DNA酶I至終濃度為2g/ml，混勻，于37溫育60分鐘。7）分別按10mmol/L和0.2的終濃度加EDTA和SDS。8）用等體積酚：氯仿抽提1次。9）于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相， 將水相吸至另一個離心管內(nèi)，加3mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L，加2.5倍體積用冰預次的乙醇，充分混勻，冰浴放置2小時。10）用微量離心機于4以12 000g離心5分鐘沉淀RNA。11）吸出所有的乙醇，將打開管蓋的離心管在實驗臺放置幾分鐘，讓最后殘存的痕量乙醇揮發(fā)干凈。12）用200l TE（pH7.6）重溶沉淀，加500l乙醇，于70 貯存?zhèn)溆谩；厥誅NA時，只須取出1小份貯存液，加入3mol/L乙酸鈉（pH5.2 ）至終濃度為0.3mol/L，充分混勻，用微量離心機于4以12 000g離心5分鐘即可。三、注意事項1測定最終所得溶液的OD260值可以確定RNA的濃度。取10l乙醇/TE混合液步驟13）離心沉淀RNA，以400水重溶， 測定OD260 值， OD2601的RNA溶液每毫升約含40g RNA。2.如果需要，可用oligo(dT) 纖維素層析法從所制備的細胞總RNA中純化無寡脫氧核糖核苷酸污染的mRNA或購買試劑盒進行mRNA的純化。3.某些情況下（例如從感染了DNA病毒或用DNA轉(zhuǎn)染的細胞中制備RNA時），必須從細胞總RNA中去除寡脫氧核核苷酸。否則，當用這種RNA構建cDNA庫或進行引物延伸反應時應會出問題， 反轉(zhuǎn)錄過程中法染的模板DNA片段可能會與RNA雜交而充當引物，從而導致物定mRNA5末端定位的錯誤或產(chǎn)生截短的cDNA克隆。a）步驟12后，加200l 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），用自動微量移液器反復吹吸，以重懸核酸沉淀，將懸浮液移至另一個滅菌的微量離心管內(nèi)。b）用微量離心機于室溫以12 000g離心10分鐘，RNA沉于管底，而絕大部分寡脫氧核糖核苷酸仍在上清中。c）棄上清液，用200l TE（pH7.6）重溶沉淀。加入20l 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），分混勻，加入550l用冰預冷的乙醇?；靹蛉芤海?在冰上驟冷30分鐘。用微量離心機于4以12 000g離主10分鐘，以回收RNA。小心吸出上清。d）棄上清液，用300l TE（pH7.6）重溶沉淀，加1ml乙醇，70貯存?zhèn)溆?。回收RNA時，只需取出1小份貯存液，加3mol乙酸鈉（pH5.2 ）至終濃度為0.3mol/L充分