分子標(biāo)記SSR標(biāo)記.ppt

SSR標(biāo)記,一、簡(jiǎn)介、原理 二、多態(tài)性基礎(chǔ) 三、開發(fā)、前景,主講人： 高慧,一、SSR標(biāo)記 原理,簡(jiǎn)單序列重復(fù)(single sequence repeat）簡(jiǎn)稱SSR s)或微衛(wèi)星(m icrosatellite)序列大量地存在于大多數(shù)真核生物及部分原核生物基因組的非編碼區(qū)和編碼區(qū)中，由串聯(lián)的1- 6 個(gè)核苷酸重復(fù)片段構(gòu)成，長(zhǎng)度一般在100bp以下，具有長(zhǎng)度的超變性。 原理:與微衛(wèi)星序列相鄰的兩側(cè)區(qū)域保守性通常較高，可以在此保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)特異的PCR引物，擴(kuò)增其中的微衛(wèi)星序列，通過聚內(nèi)酞胺凝膠電泳，即可顯示出個(gè)體間在此位點(diǎn)的微衛(wèi)星序列的多態(tài)性。,二、SSR標(biāo)記 多態(tài)性基礎(chǔ),目前研究過的所有植物中均存在著SSR多態(tài)性。絕大多數(shù)作物，如大豆、水稻、小麥、玉米、大麥等中，SSR位點(diǎn)上的等位基因數(shù)目可多達(dá)十幾個(gè)乃至幾十個(gè)，個(gè)別作物多態(tài)性水平較低。和其他DNA分子標(biāo)記相比，單個(gè)SSR位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因個(gè)數(shù)和多態(tài)性指數(shù)(diversity index，用1- E可表示，其中P為某一位點(diǎn)第i個(gè)等位基因)是最高的。 對(duì)人類SSR的研究表明，核心序列的重復(fù)次數(shù)與SSR的長(zhǎng)度多態(tài)性有密切關(guān)系。重復(fù)次數(shù)增加，SSR的長(zhǎng)度多態(tài)性增高。這一趨勢(shì)也在一些作物中得到證實(shí)。不同重復(fù)類型SSR多態(tài)性水平存在差異，二核苷酸重復(fù)構(gòu)成的SSR多態(tài)性水平要高于其他類型。同一類型SSR的不同位之間，其多態(tài)性水平也不一樣。有些種類SSR位點(diǎn)其多態(tài)性水平明顯高于其它位點(diǎn).如在大豆的研究中發(fā)現(xiàn)7個(gè) (ATT) n位點(diǎn)等位基因數(shù)目可多達(dá)11-26個(gè);由AT重復(fù)構(gòu)成的SSR甚至可區(qū)分遺傳基礎(chǔ)極其狹窄的日本梗稻育成品種。 (TAA/ATT) n類型SSR是小麥基因組中最豐富、多態(tài)性最高的三核苷酸重復(fù)類型SSR。但因(AT)n類型寡聚核苷酸探針容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，降低了篩選效率，影響了這一類型SSR的分離.然而現(xiàn)有研究表明，(AT)n類型SSR仍是可以分離的。,SSR標(biāo)記的優(yōu)勢(shì),與其他分了標(biāo)記如:如RAPD ,RFLP等相比，SSR標(biāo)記具有以下的優(yōu)點(diǎn): （1）在植物基因組中大量地、隨機(jī)地分布，具有廣泛的位點(diǎn)變異，揭示比RAPD , RFLP更多的多態(tài)性. （2） SSR標(biāo)記揭示的是單個(gè)位點(diǎn)上復(fù)等位基因的信息，為共顯性標(biāo)記，能夠區(qū)分純合型和雜合型，提供完整的遺傳信息. （3）微衛(wèi)星序列多態(tài)性可以用PCR方法檢測(cè)，不需要過多的分了克隆乎段，對(duì)DNA模板的要求不高，重復(fù)性好.因此成為在植物中日前運(yùn)用最廣泛的分了標(biāo)記之一，廣泛地運(yùn)用于植物種質(zhì)鑒定、分了標(biāo)記連鎖圖的構(gòu)建和群體遺傳學(xué)等諸多領(lǐng)域. 但是微衛(wèi)星標(biāo)記存在一個(gè)重要的局限性就是微衛(wèi)星序列兩側(cè)區(qū)域在種間保守性往往較低.種間擴(kuò)增微衛(wèi)星標(biāo)記僅僅局限于同一個(gè)屬或相近的屬的不同物種間的擴(kuò)增，這大大限制了SSR標(biāo)記在其他物種中的運(yùn)用現(xiàn)在有一些從微衛(wèi)星序列衍生而來的其他分了標(biāo)記，不用分離單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)而獲得多個(gè)位點(diǎn)指紋圖譜，如LSSRs、SAM 等，但由于多位點(diǎn)微衛(wèi)星指紋圖譜帶型復(fù)雜，難以確定等位基因，大多為顯性標(biāo)記，這限制了它們的運(yùn)用的范圍,三、SSR標(biāo)記的開發(fā),傳統(tǒng)用于克隆單位點(diǎn)微衛(wèi)星序列的方法包括以下步驟: (1)構(gòu)建小片段或大片段的基因組. (2)篩選陽(yáng)性克隆.通過傳統(tǒng)的影印或挑單菌落點(diǎn)膜的方法，把克隆轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，經(jīng)過固定后，用標(biāo)記過的序列重復(fù)寡核有酸或含微衛(wèi)星序列的探針與尼龍膜上的克隆點(diǎn)雜交，篩選出其中的陽(yáng)性克隆. (3)測(cè)序、設(shè)計(jì)引物、優(yōu)化PCR反應(yīng)條件.獲得的陽(yáng)性克隆經(jīng)過確認(rèn)后，全部或經(jīng)過隨機(jī)挑選后測(cè)序，然后根據(jù)微衛(wèi)星序列兩側(cè)保守區(qū)域的序列設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化PCR擴(kuò)增的條件，獲得穩(wěn)定、可靠的SSR標(biāo)記。,微衛(wèi)星標(biāo)記分離技術(shù),為了避免篩選文庫(kù)，現(xiàn)在有一些與其他成熟技術(shù)結(jié)合的分離微衛(wèi)星標(biāo)記的方法，包括: （1）運(yùn)用RAM P和RA PD技術(shù)分離單位點(diǎn)微衛(wèi)星標(biāo)記 RAM P 利用5含有四個(gè)錨定堿基的微衛(wèi)星引物結(jié)合不同的RA PD引物在基因組DNA中擴(kuò)增，獲得片段包括兩頭帶反向微衛(wèi)星序列的擴(kuò)增片段(為USSR產(chǎn)物)、隨機(jī)擴(kuò)增的片段(RA P產(chǎn)物)、隨機(jī)引物與微衛(wèi)星基因座間的片段(SSR產(chǎn)物).用標(biāo)記的5錨定引物擴(kuò)增或經(jīng)Southern 后在用標(biāo)記的微衛(wèi)星探針與之雜交后，再經(jīng)過自顯影，可以得到只含微衛(wèi)星標(biāo)記的指紋圖譜.在RAM P和RAPD技術(shù)的基礎(chǔ)上，人們運(yùn)用RAM P技術(shù)和RA PD技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，然后用標(biāo)記的微衛(wèi)星的探針與PCR產(chǎn)物Southern雜交或用標(biāo)記微衛(wèi)星錨定引物，在PCR擴(kuò)增后膠上直接觀測(cè)，選擇陽(yáng)性條帶克隆22 i、或者首先克隆所有的PCR產(chǎn)物，制成微列陣，然后篩選克隆。 ( 2)利用1SSR技術(shù)分離單基因座微衛(wèi)星序列 1SSR是1994報(bào)道的一種方法.這種方法是用3或5端帶有1一4個(gè)錨定堿基的微衛(wèi)星引物，來擴(kuò)增基因組獲得在兩端帶有相反排列的微衛(wèi)星序列的DNA片段，經(jīng)電泳后，顯示復(fù)雜的指紋圖譜.用1SSR引物在基因組DNA中擴(kuò)增，獲得1SSR DNA片段，然后克隆，經(jīng)測(cè)序后，根據(jù)微衛(wèi)星序列間的DNA序列設(shè)計(jì)兩個(gè)巢式引物.然后運(yùn)用巢式引物用“步查”的方法在不同酶切片段的基因組文庫(kù)中擴(kuò)增，直至獲得微衛(wèi)星序列的另外一側(cè)的序列，再設(shè)計(jì)微衛(wèi)星位點(diǎn)另一端的引物。,5錨定PCR 分離SSR標(biāo)記,（3）采用5錨定PCR ( 5-anchored PCR)分離SSR標(biāo)記 采用的5帶有六個(gè)簡(jiǎn)并堿基錨定的微衛(wèi)星序列引物.這種引物錨定效果要比1SSR技術(shù)中的隨機(jī)錨定引物的特異性好，避免了引物在微衛(wèi)星序列上的滑動(dòng).然后用這個(gè)單引物在基因組DNA中擴(kuò)增，得到兩端帶有反向微衛(wèi)星序列DNA片段，用T載體克隆PCR產(chǎn)物，然后用Southern雜交的方法，在高嚴(yán)謹(jǐn)度的條件下，獲得含微衛(wèi)星序列的克隆，然后對(duì)這些陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)獲得的序列，在微衛(wèi)星序列的側(cè)翼設(shè)計(jì)引物，用5錨定簡(jiǎn)并引物結(jié)合微衛(wèi)星特異性引物，經(jīng)擴(kuò)增后獲得單位點(diǎn)的SSR標(biāo)記. 也可以通過步查獲得微衛(wèi)星序列另一側(cè)的序列，并設(shè)計(jì)另一個(gè)引物，然后用成對(duì)的特異性引物來擴(kuò)增單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn). 5錨定PCR技術(shù)有兩個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)，其一，可以簡(jiǎn)單而快捷地建立SSR富集文庫(kù).第二，對(duì)于大多數(shù)位點(diǎn)僅僅需要一個(gè)特異性引物就可以獲得位點(diǎn)特異的共顯性標(biāo)記。因此在以后開發(fā)的分離單位點(diǎn)微衛(wèi)星序列的方法中很多都運(yùn)用了這種引物.,SAM PL技術(shù)分離SSR標(biāo)記,SAMP是Witsenboer等1997創(chuàng)立的一種分離微衛(wèi)星標(biāo)記的技術(shù).它同AFLP一樣具有擇性堿基的AFLP引物接頭的連接和預(yù)擴(kuò)增的過程.但是在第二步選擇性擴(kuò)增時(shí)，運(yùn)用的是一個(gè)末端帶有3個(gè)選物和5錨定微衛(wèi)星引物的組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過電泳獲得多位點(diǎn)的微衛(wèi)星圖，通過不同的A FLP引物和5錨定引物的組合，可以揭示基因組DNA的所有微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性. 然而用這種方法獲得的大多是顯性標(biāo)記，共顯性標(biāo)記占少數(shù)，因此有必要把具有重要信息的位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為帶有有用信息的微衛(wèi)星標(biāo)記，基于這種想法H ayden Sharp( 2001)發(fā)表了一種改良SAM PL程序，獲得SAM PL圖譜，在分了標(biāo)記連鎖圖上定位SAIVI(se-ectively anplified m icnsatellite)位點(diǎn)選擇有興趣的SAP位點(diǎn)，然后有選擇的克隆、測(cè)序，根據(jù)這個(gè)微衛(wèi)星序列一側(cè)設(shè)計(jì)一個(gè)特異性引物，用與F fisher( 1996)相同的方法來獲得單位點(diǎn)的共顯性的微衛(wèi)星標(biāo)記.,構(gòu)建富集微衛(wèi)星序列的基因組文庫(kù),構(gòu)建富集微衛(wèi)星序列的基因組文庫(kù)是現(xiàn)在分離單微衛(wèi)星位點(diǎn)的主要方法，它與傳統(tǒng)方法不同在于有一個(gè)富集微衛(wèi)星序列的步驟，按照富集方法的不同，主要有兩種方法: 引物延伸反應(yīng)富集微衛(wèi)星序列 它的大致步驟為:首先建立以噬菌?；騇13噬菌體為載體的小片段基因組文庫(kù)這種文庫(kù)叫初級(jí)文庫(kù).然后用輔助噬菌體、超感染初級(jí)文庫(kù)，產(chǎn)生單鏈環(huán)狀DNA，以單鏈DNA為摸板，用微衛(wèi)星序列為引物合成雙鏈DNA，然后富集雙鏈.其卞要步驟如下: （1）經(jīng)酶切的基因組DNA與噬菌粒相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，構(gòu)建初級(jí)文庫(kù).在這種菌株.由于缺乏(IUT-P ase和UDG(尿哈陡一DNA糖基化酶)，在復(fù)制過程中(IUTP可以有效地代替cIITP摻入DNA中而不會(huì)被修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)，因此可以積累含(IUTP的DNA. （2）用M13輔助I體超感染初級(jí)文庫(kù)，產(chǎn)生富含(IUTP的單鏈環(huán)狀DNA，并分離出這種單鏈環(huán)狀DNA. （3）以單鏈環(huán)狀DNA為模板，以微衛(wèi)星序列為引物用PCR方法對(duì)含微衛(wèi)星序列的DNA進(jìn)行延仲，這樣雙鏈DNA大多數(shù)是含微衛(wèi)星序列的. （4）轉(zhuǎn)化這種反應(yīng)產(chǎn)物到(dut ung的野生型菌株，由于單鏈DNA的轉(zhuǎn)化率低，轉(zhuǎn)化得到的克隆大部分為雙鏈DNA.由于在此菌株存(IUTPase和U DG,可以利用自身的修復(fù)系統(tǒng)以雙鏈DNA n1:常鏈為模板替換另一條鏈中(IUTP替換為cITP,可以得到復(fù)制.而經(jīng)轉(zhuǎn)化而來的少量的單鏈環(huán)狀DNA由于尿哈陡一DNA糖基化酶降解cIUTP的作用，得不到有效的復(fù)制.這樣構(gòu)建出的文庫(kù)中就富集了很高比率的含微衛(wèi)星序列的克隆. 選擇雜交法富集微衛(wèi)星序列 這是現(xiàn)在很多研究人員采用的方法.它在傳統(tǒng)構(gòu)建基因組文庫(kù)的基礎(chǔ)上加上了選擇雜交富集含微衛(wèi)星序列的片段、PCR擴(kuò)增的過程.雜交的方法有兩種:1)把含有核有酸重復(fù)的探釗或寡核有酸重復(fù)序固定在尼龍膜9.2)把核有酸重復(fù)的探針1、寡核有酸重復(fù)序列的5端生物素化，然后固定在帶有鏈霉親和素的磁珠上.通過雜交、洗脫非特異雜交DNA片段后，再用PCR擴(kuò)增富集洗脫的特異雜交的片段，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建富集微衛(wèi)星序列的基因組文庫(kù)。,STMP,STMP技術(shù)一種快速、高效分離SSR標(biāo)記的技術(shù) STMP(Sequence一tagged m icnsatellite pnfiling)是H ayden ( 2001年)在Nucleic acxlresearch發(fā)表的文章中介紹的一種方法.它利用SAGE ( serial analysis of gene expressxn)原理，建立含微衛(wèi)星序列標(biāo)簽文庫(kù)，可以快速大通量(比常規(guī)高25倍)的分離單位點(diǎn)微衛(wèi)星序列.它通過擴(kuò)增含有微衛(wèi)星序列片段，再用限制性內(nèi)切酶在識(shí)別位點(diǎn)下游酶切這些片段，產(chǎn)生了標(biāo)簽序列.雖然這段序列僅有16飾但卻可以區(qū)分4 3x10倒6)個(gè)不同的微衛(wèi)星位點(diǎn)，大大超過了在植物中估計(jì)含有的微衛(wèi)星位點(diǎn)的數(shù)日.然后把這些標(biāo)簽序列連接起來形成串聯(lián)體，再把它連接到載體上，經(jīng)測(cè)序后，獲得串聯(lián)體中各個(gè)標(biāo)簽的序列.由于在一個(gè)載體上串聯(lián)有平均25個(gè)左右的標(biāo)簽，所以一個(gè)克隆就可以鑒定出多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn).在串聯(lián)體中標(biāo)簽和標(biāo)簽間由一段序列(內(nèi)切酶識(shí)別序列)來標(biāo)志，這樣就可以分辨每個(gè)標(biāo)簽和標(biāo)簽的方向.每個(gè)標(biāo)簽長(zhǎng)度足夠設(shè)計(jì)引物可以用在基因組DNA或在酶切的基因組DNA擴(kuò)增片段池中分離SSR標(biāo)記了.它包括:雙酶切、加接頭經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生帶有PstI,M seI頭的擴(kuò)增片段、用接頭引物與微衛(wèi)星錨定引物擴(kuò)增帶有微衛(wèi)星序列的片段、富積帶有微衛(wèi)星序列的擴(kuò)增片段、用且s型限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生標(biāo)簽序列(啤)、在3一端加上B sgl接頭并擴(kuò)增、用單酶切(EcoRl)在標(biāo)簽兩端產(chǎn)生粘端、連接標(biāo)簽形成串聯(lián)序列、克隆及測(cè)序.,前景計(jì)算機(jī)自動(dòng)化,以前尋找SSR的方法是通過構(gòu)建文庫(kù)，合成短重復(fù)序列分子標(biāo)記做Southem雜交，然后將SSR兩端序列測(cè)出來，再設(shè)計(jì)引物，篩選多態(tài)性，將分子標(biāo)記整合到遺傳圖譜上.周期長(zhǎng)，費(fèi)用大，所以有必要在以后基因組時(shí)代使用基于全基因組的計(jì)算機(jī)自動(dòng)化SSR標(biāo)記篩選方法。因而有必要充分的利用不斷增加的基因組序列數(shù)據(jù)資源。通過這個(gè)項(xiàng)目能夠建立一整套的SSR分析方法及軟件開發(fā)的流程，并且繪制出水稻全基因組的遺傳圖譜。SSR標(biāo)記與AFLP、RAPD等標(biāo)記均是以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，但SSR標(biāo)記的特殊之處在于其具有針對(duì)性的微衛(wèi)星結(jié)構(gòu)域，不象其他屬于隨機(jī)多態(tài)性標(biāo)記，重復(fù)率要受到影響，所以尋找SSR標(biāo)記的方法也是不一樣的。這樣就可以在進(jìn)行SSR在基因組中的分布及其與基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)化關(guān)系的研究的同時(shí)，得到一套反映等位基因片段多態(tài)性極高的SSR標(biāo)記:從另一個(gè)角度，這又為其他特異PCR標(biāo)記的研究和開發(fā)提供了許多借鑒和有價(jià)值的參考。SNP具有比SSR更高的多態(tài)性，大約高10一100倍，但尋找和研究SNP的技術(shù)和方法還在發(fā)展之中，一般需要依賴DNA芯片等設(shè)備，近階段還不能象SSR一樣在普通實(shí)驗(yàn)室中得到應(yīng)用，也不現(xiàn)實(shí).如果要完整開發(fā)、研究SNP，和STS、sCAR、Es