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SSR標記,一、簡介、原理 二、多態(tài)性基礎(chǔ) 三、開發(fā)、前景,主講人: 高慧,一、SSR標記 原理,簡單序列重復(single sequence repeat)簡稱SSR s)或微衛(wèi)星(m icrosatellite)序列大量地存在于大多數(shù)真核生物及部分原核生物基因組的非編碼區(qū)和編碼區(qū)中,由串聯(lián)的1- 6 個核苷酸重復片段構(gòu)成,長度一般在100bp以下,具有長度的超變性。 原理:與微衛(wèi)星序列相鄰的兩側(cè)區(qū)域保守性通常較高,可以在此保守區(qū)域設(shè)計一對特異的PCR引物,擴增其中的微衛(wèi)星序列,通過聚內(nèi)酞胺凝膠電泳,即可顯示出個體間在此位點的微衛(wèi)星序列的多態(tài)性。,二、SSR標記 多態(tài)性基礎(chǔ),目前研究過的所有植物中均存在著SSR多態(tài)性。絕大多數(shù)作物,如大豆、水稻、小麥、玉米、大麥等中,SSR位點上的等位基因數(shù)目可多達十幾個乃至幾十個,個別作物多態(tài)性水平較低。和其他DNA分子標記相比,單個SSR位點檢測到的等位基因個數(shù)和多態(tài)性指數(shù)(diversity index,用1- E可表示,其中P為某一位點第i個等位基因)是最高的。 對人類SSR的研究表明,核心序列的重復次數(shù)與SSR的長度多態(tài)性有密切關(guān)系。重復次數(shù)增加,SSR的長度多態(tài)性增高。這一趨勢也在一些作物中得到證實。不同重復類型SSR多態(tài)性水平存在差異,二核苷酸重復構(gòu)成的SSR多態(tài)性水平要高于其他類型。同一類型SSR的不同位之間,其多態(tài)性水平也不一樣。有些種類SSR位點其多態(tài)性水平明顯高于其它位點.如在大豆的研究中發(fā)現(xiàn)7個 (ATT) n位點等位基因數(shù)目可多達11-26個;由AT重復構(gòu)成的SSR甚至可區(qū)分遺傳基礎(chǔ)極其狹窄的日本梗稻育成品種。 (TAA/ATT) n類型SSR是小麥基因組中最豐富、多態(tài)性最高的三核苷酸重復類型SSR。但因(AT)n類型寡聚核苷酸探針容易形成二級結(jié)構(gòu),降低了篩選效率,影響了這一類型SSR的分離.然而現(xiàn)有研究表明,(AT)n類型SSR仍是可以分離的。,SSR標記的優(yōu)勢,與其他分了標記如:如RAPD ,RFLP等相比,SSR標記具有以下的優(yōu)點: (1)在植物基因組中大量地、隨機地分布,具有廣泛的位點變異,揭示比RAPD , RFLP更多的多態(tài)性. (2) SSR標記揭示的是單個位點上復等位基因的信息,為共顯性標記,能夠區(qū)分純合型和雜合型,提供完整的遺傳信息. (3)微衛(wèi)星序列多態(tài)性可以用PCR方法檢測,不需要過多的分了克隆乎段,對DNA模板的要求不高,重復性好.因此成為在植物中日前運用最廣泛的分了標記之一,廣泛地運用于植物種質(zhì)鑒定、分了標記連鎖圖的構(gòu)建和群體遺傳學等諸多領(lǐng)域. 但是微衛(wèi)星標記存在一個重要的局限性就是微衛(wèi)星序列兩側(cè)區(qū)域在種間保守性往往較低.種間擴增微衛(wèi)星標記僅僅局限于同一個屬或相近的屬的不同物種間的擴增,這大大限制了SSR標記在其他物種中的運用現(xiàn)在有一些從微衛(wèi)星序列衍生而來的其他分了標記,不用分離單個微衛(wèi)星位點而獲得多個位點指紋圖譜,如LSSRs、SAM 等,但由于多位點微衛(wèi)星指紋圖譜帶型復雜,難以確定等位基因,大多為顯性標記,這限制了它們的運用的范圍,三、SSR標記的開發(fā),傳統(tǒng)用于克隆單位點微衛(wèi)星序列的方法包括以下步驟: (1)構(gòu)建小片段或大片段的基因組. (2)篩選陽性克隆.通過傳統(tǒng)的影印或挑單菌落點膜的方法,把克隆轉(zhuǎn)移到尼龍膜上,經(jīng)過固定后,用標記過的序列重復寡核有酸或含微衛(wèi)星序列的探針與尼龍膜上的克隆點雜交,篩選出其中的陽性克隆. (3)測序、設(shè)計引物、優(yōu)化PCR反應條件.獲得的陽性克隆經(jīng)過確認后,全部或經(jīng)過隨機挑選后測序,然后根據(jù)微衛(wèi)星序列兩側(cè)保守區(qū)域的序列設(shè)計引物,優(yōu)化PCR擴增的條件,獲得穩(wěn)定、可靠的SSR標記。,微衛(wèi)星標記分離技術(shù),為了避免篩選文庫,現(xiàn)在有一些與其他成熟技術(shù)結(jié)合的分離微衛(wèi)星標記的方法,包括: (1)運用RAM P和RA PD技術(shù)分離單位點微衛(wèi)星標記 RAM P 利用5含有四個錨定堿基的微衛(wèi)星引物結(jié)合不同的RA PD引物在基因組DNA中擴增,獲得片段包括兩頭帶反向微衛(wèi)星序列的擴增片段(為USSR產(chǎn)物)、隨機擴增的片段(RA P產(chǎn)物)、隨機引物與微衛(wèi)星基因座間的片段(SSR產(chǎn)物).用標記的5錨定引物擴增或經(jīng)Southern 后在用標記的微衛(wèi)星探針與之雜交后,再經(jīng)過自顯影,可以得到只含微衛(wèi)星標記的指紋圖譜.在RAM P和RAPD技術(shù)的基礎(chǔ)上,人們運用RAM P技術(shù)和RA PD技術(shù)擴增基因組DNA,得到擴增產(chǎn)物,然后用標記的微衛(wèi)星的探針與PCR產(chǎn)物Southern雜交或用標記微衛(wèi)星錨定引物,在PCR擴增后膠上直接觀測,選擇陽性條帶克隆22 i、或者首先克隆所有的PCR產(chǎn)物,制成微列陣,然后篩選克隆。 ( 2)利用1SSR技術(shù)分離單基因座微衛(wèi)星序列 1SSR是1994報道的一種方法.這種方法是用3或5端帶有1一4個錨定堿基的微衛(wèi)星引物,來擴增基因組獲得在兩端帶有相反排列的微衛(wèi)星序列的DNA片段,經(jīng)電泳后,顯示復雜的指紋圖譜.用1SSR引物在基因組DNA中擴增,獲得1SSR DNA片段,然后克隆,經(jīng)測序后,根據(jù)微衛(wèi)星序列間的DNA序列設(shè)計兩個巢式引物.然后運用巢式引物用“步查”的方法在不同酶切片段的基因組文庫中擴增,直至獲得微衛(wèi)星序列的另外一側(cè)的序列,再設(shè)計微衛(wèi)星位點另一端的引物。,5錨定PCR 分離SSR標記,(3)采用5錨定PCR ( 5-anchored PCR)分離SSR標記 采用的5帶有六個簡并堿基錨定的微衛(wèi)星序列引物.這種引物錨定效果要比1SSR技術(shù)中的隨機錨定引物的特異性好,避免了引物在微衛(wèi)星序列上的滑動.然后用這個單引物在基因組DNA中擴增,得到兩端帶有反向微衛(wèi)星序列DNA片段,用T載體克隆PCR產(chǎn)物,然后用Southern雜交的方法,在高嚴謹度的條件下,獲得含微衛(wèi)星序列的克隆,然后對這些陽性克隆進行測序,根據(jù)獲得的序列,在微衛(wèi)星序列的側(cè)翼設(shè)計引物,用5錨定簡并引物結(jié)合微衛(wèi)星特異性引物,經(jīng)擴增后獲得單位點的SSR標記. 也可以通過步查獲得微衛(wèi)星序列另一側(cè)的序列,并設(shè)計另一個引物,然后用成對的特異性引物來擴增單個微衛(wèi)星位點. 5錨定PCR技術(shù)有兩個明顯的優(yōu)勢,其一,可以簡單而快捷地建立SSR富集文庫.第二,對于大多數(shù)位點僅僅需要一個特異性引物就可以獲得位點特異的共顯性標記。因此在以后開發(fā)的分離單位點微衛(wèi)星序列的方法中很多都運用了這種引物.,SAM PL技術(shù)分離SSR標記,SAMP是Witsenboer等1997創(chuàng)立的一種分離微衛(wèi)星標記的技術(shù).它同AFLP一樣具有擇性堿基的AFLP引物接頭的連接和預擴增的過程.但是在第二步選擇性擴增時,運用的是一個末端帶有3個選物和5錨定微衛(wèi)星引物的組合進行PCR擴增,通過電泳獲得多位點的微衛(wèi)星圖,通過不同的A FLP引物和5錨定引物的組合,可以揭示基因組DNA的所有微衛(wèi)星位點的多態(tài)性. 然而用這種方法獲得的大多是顯性標記,共顯性標記占少數(shù),因此有必要把具有重要信息的位點轉(zhuǎn)化為帶有有用信息的微衛(wèi)星標記,基于這種想法H ayden Sharp( 2001)發(fā)表了一種改良SAM PL程序,獲得SAM PL圖譜,在分了標記連鎖圖上定位SAIVI(se-ectively anplified m icnsatellite)位點選擇有興趣的SAP位點,然后有選擇的克隆、測序,根據(jù)這個微衛(wèi)星序列一側(cè)設(shè)計一個特異性引物,用與F fisher( 1996)相同的方法來獲得單位點的共顯性的微衛(wèi)星標記.,構(gòu)建富集微衛(wèi)星序列的基因組文庫,構(gòu)建富集微衛(wèi)星序列的基因組文庫是現(xiàn)在分離單微衛(wèi)星位點的主要方法,它與傳統(tǒng)方法不同在于有一個富集微衛(wèi)星序列的步驟,按照富集方法的不同,主要有兩種方法: 引物延伸反應富集微衛(wèi)星序列 它的大致步驟為:首先建立以噬菌粒或M13噬菌體為載體的小片段基因組文庫這種文庫叫初級文庫.然后用輔助噬菌體、超感染初級文庫,產(chǎn)生單鏈環(huán)狀DNA,以單鏈DNA為摸板,用微衛(wèi)星序列為引物合成雙鏈DNA,然后富集雙鏈.其卞要步驟如下: (1)經(jīng)酶切的基因組DNA與噬菌粒相連,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株,構(gòu)建初級文庫.在這種菌株.由于缺乏(IUT-P ase和UDG(尿哈陡一DNA糖基化酶),在復制過程中(IUTP可以有效地代替cIITP摻入DNA中而不會被修復系統(tǒng)修復,因此可以積累含(IUTP的DNA. (2)用M13輔助I體超感染初級文庫,產(chǎn)生富含(IUTP的單鏈環(huán)狀DNA,并分離出這種單鏈環(huán)狀DNA. (3)以單鏈環(huán)狀DNA為模板,以微衛(wèi)星序列為引物用PCR方法對含微衛(wèi)星序列的DNA進行延仲,這樣雙鏈DNA大多數(shù)是含微衛(wèi)星序列的. (4)轉(zhuǎn)化這種反應產(chǎn)物到(dut ung的野生型菌株,由于單鏈DNA的轉(zhuǎn)化率低,轉(zhuǎn)化得到的克隆大部分為雙鏈DNA.由于在此菌株存(IUTPase和U DG,可以利用自身的修復系統(tǒng)以雙鏈DNA n1:常鏈為模板替換另一條鏈中(IUTP替換為cITP,可以得到復制.而經(jīng)轉(zhuǎn)化而來的少量的單鏈環(huán)狀DNA由于尿哈陡一DNA糖基化酶降解cIUTP的作用,得不到有效的復制.這樣構(gòu)建出的文庫中就富集了很高比率的含微衛(wèi)星序列的克隆. 選擇雜交法富集微衛(wèi)星序列 這是現(xiàn)在很多研究人員采用的方法.它在傳統(tǒng)構(gòu)建基因組文庫的基礎(chǔ)上加上了選擇雜交富集含微衛(wèi)星序列的片段、PCR擴增的過程.雜交的方法有兩種:1)把含有核有酸重復的探釗或寡核有酸重復序固定在尼龍膜9.2)把核有酸重復的探針1、寡核有酸重復序列的5端生物素化,然后固定在帶有鏈霉親和素的磁珠上.通過雜交、洗脫非特異雜交DNA片段后,再用PCR擴增富集洗脫的特異雜交的片段,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌,構(gòu)建富集微衛(wèi)星序列的基因組文庫。,STMP,STMP技術(shù)一種快速、高效分離SSR標記的技術(shù) STMP(Sequence一tagged m icnsatellite pnfiling)是H ayden ( 2001年)在Nucleic acxlresearch發(fā)表的文章中介紹的一種方法.它利用SAGE ( serial analysis of gene expressxn)原理,建立含微衛(wèi)星序列標簽文庫,可以快速大通量(比常規(guī)高25倍)的分離單位點微衛(wèi)星序列.它通過擴增含有微衛(wèi)星序列片段,再用限制性內(nèi)切酶在識別位點下游酶切這些片段,產(chǎn)生了標簽序列.雖然這段序列僅有16飾但卻可以區(qū)分4 3x10倒6)個不同的微衛(wèi)星位點,大大超過了在植物中估計含有的微衛(wèi)星位點的數(shù)日.然后把這些標簽序列連接起來形成串聯(lián)體,再把它連接到載體上,經(jīng)測序后,獲得串聯(lián)體中各個標簽的序列.由于在一個載體上串聯(lián)有平均25個左右的標簽,所以一個克隆就可以鑒定出多個微衛(wèi)星位點.在串聯(lián)體中標簽和標簽間由一段序列(內(nèi)切酶識別序列)來標志,這樣就可以分辨每個標簽和標簽的方向.每個標簽長度足夠設(shè)計引物可以用在基因組DNA或在酶切的基因組DNA擴增片段池中分離SSR標記了.它包括:雙酶切、加接頭經(jīng)PCR擴增產(chǎn)生帶有PstI,M seI頭的擴增片段、用接頭引物與微衛(wèi)星錨定引物擴增帶有微衛(wèi)星序列的片段、富積帶有微衛(wèi)星序列的擴增片段、用且s型限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生標簽序列(啤)、在3一端加上B sgl接頭并擴增、用單酶切(EcoRl)在標簽兩端產(chǎn)生粘端、連接標簽形成串聯(lián)序列、克隆及測序.,前景計算機自動化,以前尋找SSR的方法是通過構(gòu)建文庫,合成短重復序列分子標記做Southem雜交,然后將SSR兩端序列測出來,再設(shè)計引物,篩選多態(tài)性,將分子標記整合到遺傳圖譜上.周期長,費用大,所以有必要在以后基因組時代使用基于全基因組的計算機自動化SSR標記篩選方法。因而有必要充分的利用不斷增加的基因組序列數(shù)據(jù)資源。通過這個項目能夠建立一整套的SSR分析方法及軟件開發(fā)的流程,并且繪制出水稻全基因組的遺傳圖譜。SSR標記與AFLP、RAPD等標記均是以PCR為基礎(chǔ)的分子標記,但SSR標記的特殊之處在于其具有針對性的微衛(wèi)星結(jié)構(gòu)域,不象其他屬于隨機多態(tài)性標記,重復率要受到影響,所以尋找SSR標記的方法也是不一樣的。這樣就可以在進行SSR在基因組中的分布及其與基因組結(jié)構(gòu)進化關(guān)系的研究的同時,得到一套反映等位基因片段多態(tài)性極高的SSR標記:從另一個角度,這又為其他特異PCR標記的研究和開發(fā)提供了許多借鑒和有價值的參考。SNP具有比SSR更高的多態(tài)性,大約高10一100倍,但尋找和研究SNP的技術(shù)和方法還在發(fā)展之中,一般需要依賴DNA芯片等設(shè)備,近階段還不能象SSR一樣在普通實驗室中得到應用,也不現(xiàn)實.如果要完整開發(fā)、研究SNP,和STS、sCAR、Es
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