烏龍茶多糖提取工藝及抗氧化作用研究.doc

烏龍茶多糖提取工藝及抗氧化作用研究2011no.8?80?serialno.233chinabrewingresearchrepo烏龍茶多糖提取工藝及抗氧化作用研究周向軍,高義霞,袁毅君?,李志剛1,張繼z(1.天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院,甘肅天水741001;2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州730070)摘要:以烏龍茶為原料,研究不同因素對烏龍茶多糖得率的影響,初步探討了烏龍茶多糖的抗氧化活性.結(jié)果表明,各因素對茶多糖得率的影響為:提取次數(shù)>提取溫度>提取時(shí)間>料液比;最佳提取工藝為提取時(shí)間80min,提取溫度80c,提取次數(shù)3次,料液比1:35.在此條件下,茶多糖得率為15.73%.體外抗氧化試驗(yàn)表明,烏龍茶多糖對羥自由基,超氧陰離子自由基,1,1-二苯基一2一苦基肼自由基均具有一定的清除效果,且清除率隨濃度的增大而增加.關(guān)鍵詞:烏龍茶;茶多糖;提取工藝;抗氧化中圖分類號:0658文獻(xiàn)標(biāo)識碼:a文章編號:02545071(2011)08008004extractiontechnologyandantioxidantactivityofpolysaccharidefromoolongteazhouxiangjun,gaoyixia,yuanvijun,lizhigang,zhangji抖(1.collegeoflifescienceandchemistry,tianshuinormaluniversio,tianshui741001,chma;2.collegeoflifescience,northwestnormaluniversi,labzholl73oo7o.china)abstract:theeffectsofdifferentfactorsontheextractionratioofteapolysaccharidefromoolongteawerestudied,andantioxidantactivityoftheextractwasinvestigated.theresultsshowedthattheinfluencingofdifferentfactorswasorderedasextractionfrequencyextractiontemperature>extractiontime>solidliquidratio.theoptimumextractionconditionsweredeterminedbyorthogonalexperimentasfollows:extractiontime8omin.extractiontemperature80c,extractionfrequency3andsolid-liquidratio1:35.undertheseconditions,theextractionratioofteapolysaccharidewas15.73%.theinvitroantioxidanttestshowedthatteapolysaccharidehadcertainscavengingactivityonhydroxylradical,superoxideanionradicalanddpphradica1.thescavengingratehaspositivecorrelationwithteapolysaccharideconcentration.keywords:oolongtea;teapolysaccharide;extractiontechnology;antioxidantactivity烏龍茶也稱為青茶.屬于半發(fā)酵茶,是我國六大茶類之一,原產(chǎn)于福建,其加工工藝一般為殺青一揉捻造型一干燥一發(fā)酵一蒸揉一成型【.藥理研究表明,烏龍茶具有降血糖,降血脂,抗衰老及預(yù)防突變等功能,其中具有藥理作用的主要成分是茶多酚,茶多糖和茶褐素等.茶多糖是茶葉中繼茶多酚之后發(fā)現(xiàn)的又一重要的生理活性物質(zhì),具有提高機(jī)體免疫力,降低血糖,降低血脂等多種生物活性作用2-.不同原料和制備方法所得的多糖生物活性存在一定差異,研究表明,茶多糖在粗老茶中含量比嫩茶中含量高m,烏龍茶的原料比紅茶,綠茶粗老,因此本試驗(yàn)以甘肅康縣烏龍茶為原料,在前期研究烏龍茶褐素的基礎(chǔ)上,研究提取溫度,時(shí)間,次數(shù)和料液比對烏龍茶多糖得率的影響,并對茶多糖抗氧化作用進(jìn)行了初步分析,為烏龍茶開發(fā)提供理論依據(jù).1材料,試劑及儀器1.1材料烏龍茶采自甘肅隴南市康縣.1.2主要試劑vc和dpph(1,1一二苯基.2.苦基肼自由基):sigma公司,nbt(氮藍(lán)四唑),l甲硫氨酸,核黃素,無水乙醇,水楊酸,feso,葸酮等均為國產(chǎn)分析純試劑.1-3主要儀器真空冷凍干燥(alpha14ld.德國);電子天平(湘儀天平儀器有限公司,bl-3200s);高速冷凍離心機(jī)(beck-mancoulter,allegra641d;分光光度計(jì)(上海欣茂儀器公司,722)等.1.4方法1.4.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作采用葸酮硫酸法對烏龍茶多糖含量進(jìn)行測定閻.分別取0.1g/l葡萄糖溶液0.05ml,0.10ml,0.20ml,0.30ml,0.40ml,0.60ml,0.80ml,用蒸餾水補(bǔ)至1.00ml;分別加入4.00ml蒽酮試劑(2g/l),迅速浸于冰水浴中冷卻,各管加完后一起浸于沸水浴中,管口加蓋玻璃球,以防蒸發(fā).白水浴重新沸騰起,準(zhǔn)確煮沸10min取出,用自來水冷卻,室溫放置lomin左右,于波長620nm處比色.以同樣處理的重蒸餾水為空白,進(jìn)行比色.以光密度為縱坐標(biāo),糖的質(zhì)量(g)為橫坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線.標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0074x.0.0012,相關(guān)系數(shù)rz=-0.9989.取一定體積的茶多糖溶液,同標(biāo)準(zhǔn)曲線操作并計(jì)算茶多糖含量.提取液茶多糖總含量(mg)=樣液茶多糖含量(mg)提取液定容體積(ml)樣液體積(ml)收稿日期:2011-04.17基金項(xiàng)目:地震災(zāi)后新農(nóng)村建設(shè)技術(shù)集成與示范(2008bar51b05);2010年甘肅省教育廳項(xiàng)目(1008b一01)作者簡介:周向軍(1980.),男,講師,研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué);張繼,研究員,通訊作者.研究報(bào)告中國釀造2011年第8期總第233期?81?茶多糖得率(%)=茶多糖總含量(nag)/茶葉重量(mg)xlo0%1_4.2茶多糖的制備烏龍茶粉碎后稱重一浸提一離心(5000r/min,20min)一濾渣重新浸提一濾液蒸發(fā)濃縮至原體積的1,43倍95%vol乙醇醇析過夜(終濃度為80%左右)一冷凍離心(5000r/rain,20min)一收集沉淀一沉淀物用無水乙醇,丙酮,乙醚交替洗滌2次一冷凍干燥至恒重.1.4.3單因素試驗(yàn)提取時(shí)間對茶多糖得率的影響:稱取1g烏龍茶,提取時(shí)間分別為30min,60min,90min,120min,150min,180min,在一定料液比,提取溫度和提取次數(shù)條件下進(jìn)行試驗(yàn),探討提取時(shí)間對茶多糖得率的影響.提取溫度對茶多糖得率的影響:稱取1g烏龍茶,提取溫度分別為35,50,65,80,95,在一定料液比,提取時(shí)間和提取次數(shù)條件下進(jìn)行試驗(yàn),探討提取溫度對茶多糖得率的影響.料液比對茶多糖得率的影響:稱取1g烏龍茶,料液比分別為l:10,1:20,1:30,1:40,1:50,在一定提取時(shí)間,提取溫度和提取次數(shù)條件下進(jìn)行試驗(yàn),探討料液比對茶多糖得率的影響.提取次數(shù)對茶多糖得率的影響:稱取1g烏龍茶,提取次數(shù)分別為1,2,3,4次,在一定提取時(shí)間,提取溫度和料液比條件下進(jìn)行試驗(yàn),探討提取次數(shù)對茶多糖得率的影響.1.4.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用spss18.0進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),以茶多糖得率為考察指標(biāo),確定烏龍茶多糖最佳工藝條件.1.4.5茶多糖抗氧化活性的研究茶多糖對羥自由基的清除:據(jù)王桃云等1刪的方法稍作修改.各試管中分別加入不同濃度的樣液2ml,9mmol/l水楊酸.乙醇2ml,9mmol/lfeso42ml,最后加入8.8mmol/lh202ml啟動(dòng)反應(yīng),37反應(yīng)30min.以蒸餾水為空白對照,在波長510nm處測量各待測液的吸光度值.考慮到樣品本身的吸光度值,以9mmol/l水楊酸.乙醇2ml,9mmol/lfeso2ml,不同濃度的樣液2ml,用雙蒸水代替h20,為茶多糖本底吸收.計(jì)算清除率并進(jìn)一步計(jì)算其ic卯值.清除率的計(jì)算公式:清除率(%)=ao-(ax-ax0)/ao100%式中:為空白對照液的吸光度值;ax為加入茶多糖后的吸光度值;a為不加h2o:的茶多糖溶液本底的吸光度值.茶多糖還原力的測定:據(jù)趙文紅等【】的方法稍作修改.各試管中依次加入o.75mlo2mol/l磷酸鹽緩沖溶液(ph6.6),0.75ml1%亞鐵氰化鉀和0.75ml茶多糖溶液,混勻,50c【=水浴20min;冰浴冷卻后,加入0.75ml10%三氯乙酸靜置30min,3000r/min,4離心15min;取上清液1.5mln入0.1%feci0.5ml及h208ml混勻后,室溫反應(yīng)10min,混勻后在波長700nm處測定提取液吸光度值為a.,a為vc吸光度值,為零管吸光度值(不加樣液,其余同上).vc的還原力=(a.a,茶多糖還原力=(.ai-a0).茶多糖對dpph自由基的清除:據(jù)汪海波等f2】的方法稍作修改.準(zhǔn)確吸取1.2ml0.1g門ldpph乙醇溶液,加入2.8ml95%vol乙醇溶液,混勻,于波長520nm處測吸光度值,自由基清除率為零.分別準(zhǔn)確量取樣品溶液0.2ml,0.4ml,0.6ml,0.8ml,1.0ml,1.2ml,1.4ml,1.6ml,分別加入1.2mldpph液,并依次加入2.6ml,2.4ml,2.2ml,2.0ml,1.8ml,1.6ml,1.4ml,1.2ml95%vol乙醇溶液混合均勻,測吸光度值為.另外分別準(zhǔn)確量取樣品溶液0.2ml,0.4ml,0.6ml,0.8ml,1.0ml,1.2ml,1.4ml,1.6ml,依次加入3.8ml,3.6ml,3.4ml,3.2ml,3.0ml,2.8ml,2.6ml,2.4ml95%vol乙醇溶液后混合均勻,測吸光度值為空白校正值.以vc作為陽性對照.按下式計(jì)算自由基清除率k,并進(jìn)一步計(jì)算其自由基清除率ic如值.k(%)=1一(ai-a?,acx100%茶多糖對超氧陰離子自由基的清除:據(jù)陳志科等13】的方法稍作修改.采用光照核黃素產(chǎn)生超氧陰離子自由基的方法.以0.05mol/l磷酸緩沖液(ph7.4)為溶劑,配制3-3xlocaol/l核黃素,0.01mol/l蛋氨酸,4.6xl0.knol/lnbt.分別取上述溶液各2ml,加入不同濃度的樣品溶液1.0ml,空白管以1.0ml緩沖液代替樣品溶液,置于光照箱中光照30min,取出后以緩沖液作對照,于波長560nm處測定溶液的吸光度值.利用測得的吸光度值計(jì)算清除率.清除率(%)=(-a)/aoxl00%式中:a.為空白的光吸收值,a羊?yàn)椴瓒嗵堑奈罩?1.5統(tǒng)計(jì)分析方差分析采用spssl8.0進(jìn)行方差分析.ic弼計(jì)算采用西北農(nóng)林科技大學(xué)李志成和岳田利老師設(shè)計(jì)開發(fā)的ic計(jì)算軟件(登記號:2009sr044013)進(jìn)行分析;p<0.05表示差異顯著.2結(jié)果與分析2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果由圖la可知,在30min90min內(nèi),茶多糖得率逐漸上升,隨后基本保持穩(wěn)定,所以提取時(shí)間以90min為宜;由圖1b可知,在料液比為1:101:40范圍內(nèi),茶多糖得率不斷增加,當(dāng)超過1:40時(shí),茶多糖得率急速下降,原因可能是其他水溶性物質(zhì)溶解性增加并開始占據(jù)優(yōu)勢14】,因此料液比以1:40為宜;由圖lc可知,在溫度35ci=80%范圍內(nèi),茶多糖得率幾乎成線性增加,并在90達(dá)到最大,當(dāng)超過90%時(shí),得率開始下降,原因可能是高溫使茶多糖降解而得率下降【伺,因此提取溫度以90%為宜;由圖ld可知,提取次數(shù)為2次或3次時(shí)茶多糖提取率接近最大,且差距不大,因此從2011no.8?82?serialno.233chinabrewingresearchrepo節(jié)約成本等綜合考慮選提取次數(shù)2次為宜.斛料僻圖1提取時(shí)間(a),料液比(b),提取溫度(c),提取次數(shù)(d)對茶多糖得率的影響figure1.effectsofextractiontime(a),solid-liquidratio(b),extractiontemperature(c)andextractionfrequency(d)onextractionratioofteapolysaccharide2.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析由表1和2可知,提取溫度和提取次數(shù)的f值為165.282和281.834,大于r曬(2,2)值19.o0,因此提取溫度和提取次數(shù)對茶多糖得率有顯著影響;提取時(shí)間的f值10.642,小于(2,2)值,因此提取時(shí)間對茶多糖得率的影響不顯著.各影響因素的順序依次為c>b>a>d,最佳組合為a.b2c,d,即最佳提取工藝為提取時(shí)間80min,提取溫度80%,提取次數(shù)3次,料液比1:35.在此條件下,重復(fù)試驗(yàn)3次,茶多糖得率平均值為15.73%,rsd為0.8932%.表1提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果table1.designandresultsoforthogonalexperimentfortheoptimizationofextractiontechnology試驗(yàn)號得11(8o)1(75)11(35)12.412l2(8o)22(40)14.06313(85)33(45)l3.9642(9o)l2314.075223l13.086231212.1373(1oo)13212.88832l315.729332111.88k.13.47713.12012.42313.42013.09314.28713.02313.303l(313.46012.62314.58313.307r0.3841.6642.160.1】7表2正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析table2.varianceanalysisoforthogonalexperimentalresults2.3抗氧化活性分析以vc為對照測定其對各自由基的清除率,結(jié)果(圖2)可知,茶多糖具有一定的還原力,其可作為電子供應(yīng)者,與自由基反應(yīng),從而轉(zhuǎn)化為較穩(wěn)定的物質(zhì),中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng).隨著茶多糖濃度的不斷升高,其還原力不斷增強(qiáng),和vc相比,茶多糖總還原力低于前者.由圖3可知,茶多糖對羥自由基具有一定的清除率,達(dá)到0.2g/l后,其清除率基本保持在60%不變.vc和茶多糖對羥自由基的ic如分別為0.0205g/l和0.1289g/l,這說明茶多糖具有較高的羥自由基清除率,雖然低于vc,但烏龍茶茶多糖與其他天然提取物相比較仍具有優(yōu)勢【峪切.由圖4可知,茶多糖對dpph自由基具有較好的清除率,to.2g/i1.og/l范圍內(nèi),對dpph自由基清除率幾乎與其濃度成線性關(guān)系.vc和茶多糖對dpph自由基的ic50分別為0.0255g/l,0.5233g/l.由圖5可知,茶多糖對超氧陰離子自由基具有一定的清除率,在0.21.og/l范圍內(nèi)隨濃度增加,其對超氧陰離子自由基清除率研究報(bào)告中國釀造2011年第8期總第233期呈不斷上升趨勢,vc和茶多糖對超氧陰離子自由基的ic卯分別為0.2287g/l0.9181g/l,與其他提取物相比較,其清除效果仍然具有一定優(yōu)勢.綜上所述,烏龍茶茶多糖對羥自由基,超氧陰離子自由基,dpph自由基均具有一定的清除效果,且成一定量效關(guān)系,抗氧化能力相對而言均弱于vc.2.0l-5j粵1.0o5世qq濃度/(mg?ml.)濃度/(mg?ml)圖2vc(a)和茶多糖(b)總還原力的測定figure2.determinationoftotalreducingpowerofvc(a)andteap0lysacchande(b)鋈料燼濃度/(mg?ml)濃度/(mg?ml)圖3vc(a)和茶多糖(b)對羥自由基的清除作用figure3.scavengingeffectsofvc(a)andteapolysaccharide(b)onhydroxylradical褂妲瓣?duì)a濃度/(mg?ml)濃度/(mg?ml)圖4vc(a)和茶多糖(b)對dpph自由基的清除作用figure4.scavengingeffectsofvc(a)andteapolysaccharide(b)ondpphradical褂煨斛蜒濃度/(mg?m)濃度/(mg?ml)圖5vc(a)和茶多糖(b)對超氧陰離子自由基的清除作用figure5.scavengingeffectsofvc(a)andteapolysaccharide(b)onsuperoxideanionmdical參考文獻(xiàn):1趙超藝,王秋霜,卓敏,等.烏龍茶審評方法研究概述j.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(12):46.48.【2】陳海霞.茶多糖對小鼠實(shí)驗(yàn)性糖尿病的防治作用j】.營養(yǎng),2002,24(1):8588.3】汪東風(fēng),楊敏.粗老茶治療糖尿病的藥理成分分析j.中草藥,1995,如如加m,0/懈妲2011no.8?84?serialno.233chinabrewingresearchrepo復(fù)合誘變選育茁霉多糖高產(chǎn)菌株馮印,蘇安祥,王玉華(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長春130118)摘要:茁霉多糖具有許多優(yōu)良的化學(xué)性質(zhì),可以作為中間體合成多種有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的工業(yè)用化合物,是一種潛在的重要化工平臺產(chǎn)品.以出芽短梗霉y為出發(fā)菌株,通過紫外2輪,亞硝基胍3輪復(fù)合誘變,高蔗糖濃度(2o%)平板篩選得到6株高產(chǎn)突變株,其中菌株n3茁霉多糖產(chǎn)量質(zhì)量濃度達(dá)1j37.84g/l,比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高71.22%.關(guān)鍵詞:茁霉多糖;紫外;亞硝基胍誘變中圖分類號:q93331文獻(xiàn)標(biāo)識碼:a文章編號:02545071(2011)08008403screeningofastrain也highpullulanproductivitybycompoundmutagenesisfengyin,suanxiang,wangyuhua(collegeoffoodscienceandengineering,jilinagdculraluniversity,changchun1301l8.china)abstract:pullulanhasmanyexcellentchemicalproperties,whichcanbeusedasanintermediatetosynthesizeavarietyofindustrialcompounds.aureobasidiumpullulanswastreatedbyuvfortwogenerationandntgforthreegenerationmutagenesis.sixmumntstainswerescreenedbyhighsucroseconcentration(20%)plate,inwhichamutantstrainn3withhighpullulanproductivitywasobtained.theproductofpullulanbythisstrainwasupt037.84g/l,whichis71.22%higherthanthatoftheparentstrain.keywords:pullulan;uv:nitrosoguanidinemutagenesis茁霉多糖是由出芽短梗霉(aureobasidiulnpullulans)合成的微生物多糖,是一種天然的水溶性中性葡聚糖,無色,無味,無毒,具有良好的耐熱,耐鹽,耐酸堿,成膜性,乳化性,可塑性,隔氧性,可以作為中間體合成多種有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的工業(yè)用化合物,因此廣泛應(yīng)用于食品,醫(yī)藥,化妝品等行業(yè),是一種潛在的重要化工平臺產(chǎn)品口-2.對茁霉多糖的性質(zhì)及應(yīng)用國內(nèi)外已做了大量深入細(xì)致的研究,與發(fā)達(dá)國家相比,我國茁霉多糖的研究及應(yīng)用情況與之差距很大,目前尚未見規(guī)?；唐飞a(chǎn)的報(bào)道,關(guān)鍵是沒有高產(chǎn)菌,本研究試圖通過物理和化學(xué)復(fù)合誘變出芽短梗霉,以期獲得茁霉多糖高產(chǎn)菌株,為茁霉多糖工業(yè)化生產(chǎn)提供具有應(yīng)用價(jià)值的菌株.本研究報(bào)道了以出芽短梗霉y為出發(fā)菌株,經(jīng)紫外2輪和亞硝基胍3輪復(fù)合誘變,篩選出一株高產(chǎn)茁霉多糖突變株的結(jié)果.1材料與方法1.1材料1.1.1菌株收稿日期:2011-03.17基金項(xiàng)目:吉林省科技廳科技支撐計(jì)劃(20080251)作者簡介:馮印(1986一),女,吉林人,在讀碩士研究生,研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c功能性食品:王玉華+,副教授,通訊作者.26(5):255257.4蕭偉祥,蕭慧.茶多糖生物活性與結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展【j】.中國茶葉,