[精品論文]一株能與盾葉薯蕷細(xì)胞共培養(yǎng)的內(nèi)生.doc

精品論文一株能與盾葉薯蕷細(xì)胞共培養(yǎng)的內(nèi)生真菌分離及其生物學(xué)特性袁麗紅陸玉婷許琳歐陽平凱*（南京工業(yè)大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院 南京 210009）摘要: 從盾葉薯蕷根狀莖中分離到一株在離體條件下與盾葉薯蕷愈傷組織協(xié)調(diào)生長的內(nèi)生真菌（re0105）。 該菌在多種培養(yǎng)基上均未見孢子產(chǎn)生。測定了該菌的 its1-5.8s rdna-its2 序列并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，在 系統(tǒng)發(fā)育樹中內(nèi)生真菌 re0105 與 libertella 屬形成一個(gè)類群，具有較近親緣關(guān)系。內(nèi)生真菌 re0105 能夠 產(chǎn)生與宿主植物相同的代謝產(chǎn)物薯蕷皂苷元。對內(nèi)生真菌 re0105 培養(yǎng)的生長特性研究表明，富含有機(jī) 營養(yǎng)的培養(yǎng)基有利于其生長；盾葉薯蕷細(xì)胞提取物可明顯刺激內(nèi)生真菌生長；20mol/l 生長素 naa 和 2,4-d 能夠促進(jìn)內(nèi)生真菌 re0105 的生長。200 mol/l 細(xì)胞分裂素 kt 和 ba 對 re0105 生長具有一定的促進(jìn)作用， 但與生長素相比，細(xì)胞分裂素對 re0105 生長的刺激作用較小。蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖和硝酸 銨是內(nèi)生真菌 re0105 生長的良好碳源和無機(jī)氮源，氯化銨和硫酸銨對內(nèi)生真菌生長具有明顯抑制作用， 并且顯著影響內(nèi)生真菌 re0105 形態(tài)特征。關(guān)鍵詞：培養(yǎng)特性；薯蕷皂苷元；離體共培養(yǎng)；its1-5.8s rdna-its2 區(qū)域；系統(tǒng)發(fā)育分析中圖分類號：q939.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：a文章編號：植物內(nèi)生真菌是生活在植物組織和細(xì)胞內(nèi)不引起宿主植物明顯感染癥狀的真菌，普遍存 在于植物體內(nèi)，從目前已研究過的植物看，未發(fā)現(xiàn)沒有分離到內(nèi)生真菌的植物（arnold et al.,2000）。盡管內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)的生物量微不足道，但其長期生活在植物體內(nèi)這一特殊環(huán) 境中，并與寄主協(xié)同進(jìn)化，二者間形成了互惠共生關(guān)系：一方面內(nèi)生真菌可以從宿主植物中 吸取營養(yǎng)，并得到保護(hù)；另一方內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)宿主植物生長發(fā)育,增強(qiáng)宿主植物對生物 脅迫(食草動物、昆蟲、病原菌)及非生物脅迫(高溫、干旱、高鹽等)的抗逆性（黎萬奎和胡 之璧，2005)。由于自然條件下內(nèi)生真菌植物所形成的共生體特征不明顯以及內(nèi)生真菌人 工接種的困難（latch g c & christensen, 1985；johnson et al.,1986; kearney et al., 1991），絕 大多數(shù)內(nèi)生真菌植物共生關(guān)系未被認(rèn)識和研究。目前有關(guān)內(nèi)生真菌與宿主植物共生關(guān)系的 研究主要 是 基于有性 世 代內(nèi)生真 菌 epichle (clavicipitaceae, ascomycota) 和無性型 neotyphodium 與兩種禾本科植物高羊茅和多年生黑麥草相互作用的研究結(jié)果。此外，在研 究內(nèi)生真菌作用機(jī)理實(shí)驗(yàn)中，研究者建立的多是實(shí)生苗“內(nèi)生真菌感染植株”和“未感染植株” 實(shí)驗(yàn)種群。從生態(tài)學(xué)角度講，任何生活在自然環(huán)境中植物體均存在內(nèi)生菌，即使是無菌苗， 進(jìn)入溫室或大田后其它微生物也會定殖于其體內(nèi)，從而無法判斷是內(nèi)生真菌作用的結(jié)果還是 來自于環(huán)境中其它生物作用的結(jié)果。因此，利用田間或溫室建立的內(nèi)生真菌宿主植物共生 體研究二者作用機(jī)理存在一定問題?；趦?nèi)生真菌在與宿主植物長期生活和協(xié)同進(jìn)化過程中二者間的互惠共生關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)室離體條件下建立內(nèi)生真菌宿主植物細(xì)胞共培養(yǎng)體系可為研究內(nèi)生真菌在與宿主植物相 互作用機(jī)理提供一種可行的研究體系。目前有關(guān)離體條件下能與宿主植物細(xì)胞共培養(yǎng)的內(nèi)生 真菌的研究尚未見報(bào)道。盾葉薯蕷(dioscorea zingiberensis c.h. wright)為薯蕷科薯蕷屬植物，是我國特有的、具基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（no. 20276030）作者簡介：袁麗紅（1965），女，教授*通訊作者：歐陽平凱，教授，博士生導(dǎo)師. e-mail: 2精品論文有重要經(jīng)濟(jì)意義的藥用植物，從其根狀莖提取的薯蕷皂苷元(diosgenin)是合成甾體激素類藥物的重要原料。提取的皂苷素也是生產(chǎn)盾葉冠心寧、地奧心血康等治療心血管疾病藥物的重 要原料。目前對盾葉薯蕷內(nèi)生真菌研究尚少見報(bào)道。本研究以盾葉薯蕷為材料，從中分離篩 選到一株能與盾葉細(xì)胞共培養(yǎng)的內(nèi)生真菌，并對其培養(yǎng)生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，為在實(shí)驗(yàn)室 離體條件下建立內(nèi)生真菌宿主植物細(xì)胞共培養(yǎng)體系以及進(jìn)一步研究二者相互作用的關(guān)系 與機(jī)理奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 供試植物 從江蘇省植物研究所采集的健康的盾葉薯蕷全株。1.2 內(nèi)生真菌的分離 用洗滌劑將盾葉薯蕷葉、莖和根狀莖清洗干凈后置于流水下沖洗過夜，于超凈工作臺上將葉、莖段和根狀莖分別用滅菌濾紙洗干水分后，依次用 75乙醇消毒 1 min、0.1升汞消毒 10 min，最后用無菌水漂洗 3 次并用滅菌濾紙吸干水分。將葉片切成 0.50.5 cm 小塊、 葉和葉柄切成 0.5 cm 長短小段、根狀莖先切成 0.5 cm 厚小片，再縱切 4 塊。將上述各組織 塊接種于 cmm 培養(yǎng)基（bacon，1990）上，于 26恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察有無菌絲 長出，待從樣品切口處有菌絲長出，轉(zhuǎn)接至新鮮 cmm 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并用菌絲頂端法純化， 純化后的菌株于 cmm 培養(yǎng)基上保存。1.3 內(nèi)生真菌與盾葉薯蕷愈傷組織共培養(yǎng)先將盾葉薯蕷愈傷組織接種于 ms 培養(yǎng)基上（其中附加 naa 2.0 mg/l, ba 0.2 mg/l, 蔗 糖 30 g/l，ph5.8），再將直徑 6 mm 菌塊靠近愈傷組織塊接種于 ms 培養(yǎng)基中，于 26黑 暗條件下培養(yǎng)并觀察愈傷組織和真菌生長情況。1.4 內(nèi)生真菌菌體特征和菌落特征觀察采用三點(diǎn)接種法挑取少量菌絲接種于 pda 平板培養(yǎng)基上，于 26黑暗條件下培養(yǎng) 21d， 觀察菌落和菌體特征。1.5 內(nèi)生真菌分子鑒定菌絲體總 dna 提取采用氯化芐法（朱衡等，1994）。選用引物對 its4 和 its5（white et al.，1990）擴(kuò)增 its1-5.8s-its2 區(qū)域。pcr 反應(yīng)體系組成為 5 l 10buffer、1 l dntp、引 物各 1 l、1 l taq 酶、3 l 模板、38 l ddh20，反應(yīng)體系總體積 50 l。pcr 反應(yīng)條件 為 95 變性 3 min，然后于 94 變性 40 s，52 退火 50 s，72 延伸 1 min，循環(huán) 35 次， 最后于 72 延伸 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用 0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。用大連寶生物有限公司 膠回收試劑盒回收純化 pcr 產(chǎn)物，具體步驟按操作手冊進(jìn)行，用 0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測 膠回收產(chǎn)物，送交上海英駿生物技術(shù)公司測序。以測得的序列作為查詢序列，在 genbank 數(shù)據(jù)庫作 blast 比較，從得到的相似序列中選擇部分已知分類地位的序列，用 clustal x 軟件進(jìn)行序列對準(zhǔn)，對長短不一的兩端進(jìn)行人工調(diào)整。用 mega version4 軟件構(gòu)建 maximumparsomony 進(jìn)化樹，并進(jìn)行 bootstrap 驗(yàn)證評價(jià)進(jìn)化樹可靠性，設(shè) 1000 次重復(fù) (tamura et al.，2007)。1.6 內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)及其水解產(chǎn)物提取和分析將生長于 cmm 培養(yǎng)基上的菌絲塊 20 塊（直徑 6mm）接種于 100 ml pd 液體培養(yǎng)基中，26振蕩培養(yǎng) 35d，轉(zhuǎn)速 120 r/min，收集菌體再接入 100 ml sm（bacon，1990）培養(yǎng)基中 繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 10d，收獲菌體。稱取內(nèi)生真菌培養(yǎng)物 10 g，置于磨口三角瓶內(nèi)，加入 1.5 mol/l h2so4-70%異丙醇溶液 30 ml，沸水浴回流提取 8 h，冷卻、抽濾，在濾液中加入等體積的 蒸餾水，用等體積的正己烷萃取三次，合并后用 1% naoh 洗至無色，再用蒸餾水洗至中性，50下減壓蒸干，所得物質(zhì)用無水乙醇洗出、蒸干，用甲醇溶解并定容至 5 ml，進(jìn)行 hplc/ms 分析。色譜條件為：kromasil c18 反相色譜柱（4.6mm250mm，5），流動相為 純甲醇，流速 1.0 ml/min，檢測波長 208 nm。1.7 盾葉薯蕷內(nèi)生真菌培養(yǎng)生長特性1.7.1 不同培養(yǎng)基對內(nèi)生真菌生長影響供試培養(yǎng)基分別為 cmm、m102（bacon，1990）、pda、ms、查氏(czapek)培養(yǎng)基。 將直徑 6 mm 菌絲塊分別接種于待測培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)基上，每皿接 4 塊，接 5 皿。于 26 黑暗下培養(yǎng)，每 7d 測量菌落直徑。1.7.2 盾葉薯蕷細(xì)胞提取物對內(nèi)生真菌生長影響分別稱取 10、20、30、40 g 盾葉薯蕷鮮細(xì)胞，研磨、抽濾，將濾液加入到 100 ml 查氏 培養(yǎng)基中。接種、培養(yǎng)及測定方法同 2.7.1。1.7.3 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對內(nèi)生真菌生長的影響 供試的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)分別為生長素（naa、2,4-d）和細(xì)胞分裂素（ba、kt）。以查氏培養(yǎng)基（未加盾葉薯蕷細(xì)胞提取物）為基本培養(yǎng)基。供試各激素濃度均選擇三個(gè)水平：0.2、20、200 mol/l。接種、培養(yǎng)及測定方法同 .4 不同碳源對內(nèi)生真菌生長影響 以查氏培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基（其中添加盾葉薯蕷細(xì)胞提取物，100 ml 培養(yǎng)基加入 30 g細(xì)胞提取物）。供試碳源分別為蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、鼠李糖。在基本培養(yǎng)基中分別加入單一的供試碳源，碳源用量均為 30 g/l。接種、培養(yǎng)及測定方法同 2.7.1。1.7.5 不同氮源對內(nèi)生真菌生長影響 供試氮源為無機(jī)氮源，分別為硝酸鈉、硝酸鉀、氯化銨、磷酸氫二銨、硫酸銨、硝酸銨。以查氏培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，其中添加盾葉薯蕷細(xì)胞提取物，加量同 2.7.4。在基本培養(yǎng)基中分別加入單一的供試無機(jī)氮源，濃度均為 35 mmol/l。接種、培養(yǎng)及測定方法同 2.7.1。122 結(jié)果與分析2.1 能與盾葉薯蕷細(xì)胞共培養(yǎng)的內(nèi)生真菌分離盾葉薯蕷組織塊培養(yǎng) 28 周后，從組織塊切口處開始有菌絲生長出來。將長出來的菌 絲重新接種到新鮮 cmm 培養(yǎng)基上，并采用菌絲頂端純化法進(jìn)行純化。先后從盾葉薯蕷不同 組織部位分離到 6 株具有不同培養(yǎng)特征的真菌分離物，其中從根狀莖分離出 2 株、葉片分離 出 3 株、莖分離出 1 株。分別將分離得到的真菌分離物與盾葉薯蕷愈傷組織共培養(yǎng)。結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，培養(yǎng) 30 天只有分離自根狀莖的真菌分離物 re0105 能與愈傷組織形成協(xié)調(diào)生長關(guān)系， 二者之間具有親和性（圖 1），而其它真菌分離物生長較快，覆蓋整個(gè)愈傷組織，或被侵染 的愈傷組織在共培養(yǎng) 520 天后褐化而逐漸死亡。因此，從真菌與宿主間親和性的角度，認(rèn) 為真菌分離物 re0105 是一株能夠與宿主細(xì)胞協(xié)調(diào)生長或具有互惠共生關(guān)系的內(nèi)生真菌。圖 1 內(nèi)生真菌 re0105 與盾葉薯蕷愈傷組織共培養(yǎng)fig. 1. in vitro co-cultivation of endophytic fungus re0105 and d. zingiberensis calli2.2 內(nèi)生真菌 re0105 形態(tài)特征在 pda 培養(yǎng)基上內(nèi)生真菌 re0105 生長非常緩慢，菌落隆起、致密、不規(guī)則，正面灰 色，背面黑色（圖 2）。形成氣生菌絲和基內(nèi)菌絲，氣生菌絲絨毛短。培養(yǎng) 21 天的菌體在顯 微鏡下觀察，基內(nèi)菌絲較粗、分枝少、有隔膜，氣生菌絲較粗、具分枝，隔膜少，未見孢子 產(chǎn)生（圖 3）。在 mea、cmm、m102、查氏等培養(yǎng)基上培養(yǎng)也均未產(chǎn)生孢子。圖 2 在 pda 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 21 天的內(nèi)生真菌 re0105 菌落特征fig.2 21-day-old cultures of endophytic fungus re0105 grown on pda medium圖 3 內(nèi)生真菌 re0105 菌體特征a. 基內(nèi)菌絲b. 氣生菌絲fig.3 microscopic view of endophytic fungus re0105 a. substrate hyphab. aerial hypha2.3 內(nèi)生真菌 re0105 分子鑒定利用 its4 和 its5 引物對擴(kuò)增出一段長度為 576 bp 的 dna 序列（genbank accessiondq778612），其序列特征為 144 bp 為 18s rdna 部分序列，45218 bp 為 its1 序列，219373 bp 為 5.8s rdna 序列，374517 bp 為 its2 序列，518576 bp 為 28s rdna 部分序列。 將 its1-5.8s rdna-its2 區(qū)域的序列在 genbank 中進(jìn)行 blast 比較，并從相似序列中選出 libertella sp.等 19 株分類地位已知的真菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。圖 4 顯示內(nèi)生真菌 re0105 與 libertella sp.形成一個(gè)類群，支持強(qiáng)度為 82%, 說明內(nèi)生真菌 re0105 與 libertella sp.真菌具有較近親緣關(guān)系。47929786439938826041426810099709897pleopsidium flavum (dq525521) pleopsidium gobiense (dq525494) pleopsidium chlorophanum (dq525524) acarospora peliscypha (dq374132) acarospora sp. nimis 4255 (dq525528) sarea sp. bc16 (dq317349)helotiales sp. bjelland 61 (ay011014) botryosphaeria eucalypticola (dq131571) libertella sp. exp0557f (dq914681) re0105coniosporium apollinis (aj244271) helicosporium guianense (ay916487)tubeufia cerea (helicosporium vegetum) (ay916488) cryomyces promontorium (dq028270)buellia sp. kolri udo-13 (ay762037) biatora helvola (aj247557)biatora pseudohelvola (aj247571) biatora meiocarpa (am292667) biatora subduple (aj247540) peltaster sp. p6 (ay598891)圖 4 基于 its1-5.8s rdna-its2 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹fig.4 phylogenetic tree based on its1-5.8s rdna-its2 sequence of fungus re0105 and 19 reference strains(numbers in parentheses represent the sequences accession number in genbank)2.4 內(nèi)生真菌 re0105 發(fā)酵產(chǎn)物分析采用兩步培養(yǎng)法，首先將內(nèi)生真菌 re0105 在 pd 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 35d，在轉(zhuǎn)入 sm培養(yǎng)基中培養(yǎng) 10d，對其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行 hplc/ms 分析，結(jié)果見圖 5。可見，內(nèi)生真菌 re0105 發(fā)酵產(chǎn)物出現(xiàn)了薯蕷皂苷元（diosgenin）的波峰（圖 5a）。薯蕷皂苷元分子量為 414，圖 5b 中 m/z 415.4 為分子離子鋒m+h+，說明內(nèi)生直接 re0105 能夠產(chǎn)生薯蕷皂苷元。圖 5 內(nèi)生真菌 re0105 合成產(chǎn)物的高效液相圖譜(a)和合成的薯蕷皂苷元的電噴霧質(zhì)譜圖(b)fig. 5. hplc(a) and electrospray mass spectrum(b) of diosgenin synthesized by fungus re01052.5 內(nèi)生真菌 re0105 培養(yǎng)生物學(xué)特性2.5.1 不同培養(yǎng)基對內(nèi)生真菌 re0105 生長的影響32 m1 0 2cmm 28 pda ms colony diameter / mm24 cz a p e k20 16 12 840 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0in cu ba tion tim e /d圖 6 不同培養(yǎng)基對內(nèi)生真菌 re0105 生長的影響fig.6 effects of media on the growth of endophytic fungus re0105圖 6 結(jié)果表明，內(nèi)生真菌 re0105 在 m102、cmm、pda、ms 和 czapek 等 5 種不同 培養(yǎng)基上的生長速度具明顯差異。在 cmm 培養(yǎng)基上生長最佳，其次是 m102，再次是 pda； 在查氏培養(yǎng)基上未見明顯生長；在植物細(xì)胞培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基 ms 上也表現(xiàn)出一定的生長。 可見，內(nèi)生真菌的活體依賴性決定其離體培養(yǎng)時(shí)對有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)的需要，培養(yǎng)基中有機(jī)物質(zhì) 越豐富，越有利于內(nèi)生真菌生長。2.5.2 盾葉薯蕷細(xì)胞提取物和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對內(nèi)生真菌 re0105 生長的影響內(nèi)生真菌生活在植物體內(nèi)，二者在長期共同生活中形成了密切的關(guān)系，宿主植物為內(nèi)生 真菌提供養(yǎng)分。為此，研究了盾葉薯蕷細(xì)胞提取物和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對內(nèi)生真菌 re0105生長的影響。colony diameter / mm24 c z ap ek 22 c z ap ek+ 1 0g 20c z ap ek+ 2 0g c z ap ek+ 3 0g 18 c z ap ek+ 4 0g 16 14 12 10 8640 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0in c u b a tio n tim e /d圖 7 盾葉薯蕷細(xì)胞提取物對內(nèi)生真菌 re0105 生長的影響fig.7 effects of cell extracts on the growth of endophytic fungus re0105圖 7 結(jié)果表明，盾葉薯蕷細(xì)胞提取物能明顯刺激內(nèi)生真菌 re0105 生長，并且細(xì)胞提取 物的添加量對 re0105 生長的影響具有一定差異。在 100 ml 查氏培養(yǎng)基中加入 30 g 盾葉薯 蕷鮮細(xì)胞提取物時(shí)內(nèi)生真菌 re0105 生長最快，但是當(dāng)細(xì)胞提取物加入量過高時(shí)內(nèi)生真菌生 長速率有所下降。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對盾葉薯蕷細(xì)胞提取物對內(nèi)生真菌 re0105 生長影響進(jìn)行了研究。一是在100ml 蒸餾水中只加細(xì)胞提取物，而不加碳氮源等其它營養(yǎng)物質(zhì)；二是在 ms 固體培養(yǎng)基（其中蔗糖濃度為 30 g/l）中同時(shí)接種盾葉薯蕷愈傷組織（細(xì)胞接種量為 1.5 g/瓶，100 ml 三角瓶分裝 30ml 培養(yǎng)基）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖 8）內(nèi)生真菌 re0105 也表現(xiàn)出較高生長速率。這 一結(jié)果說明雖然盾葉薯蕷細(xì)胞提取物中含有可供內(nèi)生真菌 re0105 生長的碳源、氮源等營養(yǎng) 物質(zhì)，但細(xì)胞提取物對內(nèi)生真菌生長的刺激作用并不是由于提取物添加而增加營養(yǎng)物質(zhì)濃度 的結(jié)果，而是細(xì)胞提取物為內(nèi)生真菌提供某種或某些生長因子，但有關(guān)生長因子的本質(zhì)有待 進(jìn)一步研究。20 30g ce ll e xtracts18 ms + live c a llicolony diameter / mm16 14 12 10 8640 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0in c u ba tion tim e / d圖 8 盾葉薯蕷細(xì)胞和細(xì)胞提取物對內(nèi)生真菌 re0105 生長的影響fig.8 effects of d. zingiberensis cells and cell extracts on the growth of endophytic fungus re010516 2,4-d 0.2 mo l/l2,4-d 20 mo l/l14 2,4-d 200 mo l/l n a a 0.2 mo l/ln aa 2 0 mo l/lcolony diameter / mm12 n aa 2 0 0 mo l/l10 8640 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0inc u bation tim e /d圖 9 生長素及其濃度對內(nèi)生真菌 re0105 生長的影響fig.9 effects of auxins and their concentrartions on the growth of endophytic fungus re0105圖 9 顯示生長素 naa 和 2,4-d 對內(nèi)生真菌 re0105 生長的影響。在培養(yǎng)基中加入適宜 濃度（20 mol/l）生長素能夠促進(jìn)內(nèi)生真菌的生長，但生長素濃度過高 (200 mol/l）時(shí) 對內(nèi)生真菌生長刺激作用較小。naa 對內(nèi)生真菌 re0105 的刺激作用大于 2,4-d。圖 10 顯示細(xì)胞分裂素 ba 和 kt 對內(nèi)生真菌 re0105 生長的影響。與生長素相比，細(xì)胞 分裂素對內(nèi)生真菌 re0105 生長的促進(jìn)作用較小，只有在高濃度（200 mol/l）下才有一定的效果，同時(shí)也發(fā)現(xiàn) kt 刺激作用略大于 ba。14 ba 0 .2 mo l/l ba 2 0 mo l/l12 ba 2 0 0 mo l/lkt 0 .2 mo l/l kt 2 0 mo l/l10 kt 2 0 0 mo l/l8colony diameter / mm640 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0in c u b a tio n tim e /d圖 10 細(xì)胞分裂素及其濃度對內(nèi)生真菌 re0105 生長的影響fig.10 effects of cytokinins and their concentrartions on the growth of endophytic fungus re01052.5.3 碳源對內(nèi)生真菌 re0105 生長的影響22 20rh a m n o s exylo s e18la ctos ega la c to s ecolony diameter16 fru c to s e14g luc os esu c ro s e12 10 86401 02 03 04 05 0in c u b a tio n tim e / d圖 11 碳源對內(nèi)生真菌 re0105 生長的影響fig.11 effects of carbon sources on the growth of endophytic fungus re0105圖 11 結(jié)果顯示內(nèi)生真菌 re0105 可以利用多種簡單碳源，但是對不同碳源利用能力表現(xiàn)出一定差異。蔗糖、葡萄糖、果糖和乳糖是內(nèi)生真菌 re0105 生長的良好碳源；木糖也是 其生長的較好碳源，內(nèi)生真菌 re0105 具有降解和利用 5c 糖的能力；在含有半乳糖培養(yǎng)基 上內(nèi)生真菌生長略差；內(nèi)生真菌 re0105 不能利用氨基糖鼠李糖。2.5.4 無機(jī)氮源對內(nèi)生真菌 re0105 生長的影響圖 12 顯示無機(jī)氮源對內(nèi)生真菌 re0105 生長的影響。在培養(yǎng)前期（21d 前）無機(jī)氮源種 類對 re0105 生長的影響差異不大，但 21d 后對 re0105 生長的影響表現(xiàn)出明顯不同。既為 氨態(tài)氮又為硝態(tài)氮的硝酸銨更有利于內(nèi)生真菌生長；其次為硝酸鈉和磷酸氫二銨，說明單獨(dú) 以氨態(tài)氮或硝態(tài)氮為氮源對 re0105 生長影響差異不大；但氯化銨和硫酸銨為氮源不利于 re0105 生長，即使在培養(yǎng)基中添加薯蕷細(xì)胞提取物，re0105 生長也受到明顯抑制。此外， 實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌 re0105 在以氯化銨或硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)約 80 天時(shí)，在其 菌落表面形成一些白色結(jié)構(gòu)（圖 13a），鏡檢發(fā)現(xiàn)是大量圓形囊狀結(jié)構(gòu)聚集體（圖 13b），該 結(jié)構(gòu)是否為其繁殖方式有待進(jìn)一步研究。同時(shí) re0105 菌絲結(jié)構(gòu)也發(fā)生明顯變化，在菌絲頂 端或中間形成大量的膨大細(xì)胞（圖 13c）。322 na no 20 kn o 3colony diameter / mm18nh 4cl (nh 4)2hp o 44 2416 (nh ) so 14 nh 4no 312 10 8640 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0in cu bation tim e /d圖 12 無機(jī)氮源對內(nèi)生真菌 re0105 生長的影響fig.12 effects of inorganic nitrogen sources on the growth of endophytic fungus re0105圖 13 內(nèi)生真菌 re0105 在 nh4cl 為氮源的 czapek 培養(yǎng)基上的形態(tài)特征a 形成的白色結(jié)構(gòu); b 白色結(jié)構(gòu)的顯微觀察; c 菌絲上形成的膨大細(xì)胞fig.13 morphological characteristics of fungus re0105 grown on czapek mediuma. some white agglomerates on the surface of the colony after about 80 days of incubation. b. microscopic view of white agglomerates. c. apical and intercalary swollen cells formed in hypha3 討論本研究從盾葉薯蕷根狀莖、莖和葉中共分離出 6 株具有不同培養(yǎng)特征的內(nèi)生真菌。與盾 葉薯蕷愈傷組織共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)只有分離自根狀莖的真菌分離物 re0105 能與盾葉薯蕷愈傷組 織形成協(xié)調(diào)生長關(guān)系。這說明生活在植物體內(nèi)的真菌與宿主植物間的關(guān)系較為復(fù)雜，一些可 能為互惠共生關(guān)系，一些可能為偏利共生關(guān)系。對內(nèi)生真菌 re0105 菌體特征研究發(fā)現(xiàn)該內(nèi)生真菌在多種培養(yǎng)基上均不能產(chǎn)生孢子，這 一結(jié)果與許多文獻(xiàn)對內(nèi)生真菌的研究報(bào)道相似。例如，guo et al.(2000)從棕櫚中分離到 778 株真菌分離物，其中 128 株（約占 16.5）不產(chǎn)孢子。fisher et al. (1994)從瑞士 quercusilex 的枝條中分離到的內(nèi)生真菌高達(dá) 54為無孢菌群，葉片中有 18分離物不產(chǎn)孢子。可見， 不產(chǎn)孢或較難產(chǎn)孢是內(nèi)生真菌的一個(gè)普遍特征，這可能是由于內(nèi)生真菌在與宿主植物長期共 生生長中逐步喪失了產(chǎn)孢能力。雖然富含有機(jī)營養(yǎng)的培養(yǎng)基有利于內(nèi)生真菌 re0105 生長， 但與多數(shù)真菌相比，內(nèi)生真菌 re0105 生長緩慢，在 cmm 和 pda 上培養(yǎng) 50 天菌落直徑凈 增長分別為 23.6mm 和 12.5mm。moon et al. (2002)報(bào)道分離自禾草的內(nèi)生真菌 neotyphodium aotearoae, n. australiense 和 n. melicicola 生長速度緩慢，在 pda 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 5 周，菌落大 小分別為 411mm、1319mm 和 1019mm。產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌 taxomyces andreanae 和 periconia sp.培養(yǎng)周期也較長，達(dá) 21 天 (stierle et al. 1993, li et al. 1998)?？梢姡L緩慢 可能也是內(nèi)生真菌的一個(gè)普遍特征。經(jīng)典的真菌分類鑒定以形態(tài)結(jié)構(gòu)為主要依據(jù)，包括有性繁殖和無性繁殖結(jié)構(gòu)特征、有性 孢子和無性孢子形狀、顏色和大小、菌絲或細(xì)胞結(jié)構(gòu)等。研究表明，在已研究的內(nèi)生真菌中 有相當(dāng)一部分內(nèi)生真菌不產(chǎn)孢或難于產(chǎn)孢。因此，利用經(jīng)典分類方法鑒定內(nèi)生真菌具有一定 困難。隨著 dna 序列分析技術(shù)的日益成熟，rdna 及其轉(zhuǎn)錄間區(qū)（its）的序列分析愈來愈 多被用于真菌分類鑒定和分子系統(tǒng)學(xué)研究中。鑒于內(nèi)生真菌 re0105 在多種培養(yǎng)基上培養(yǎng)不 產(chǎn)孢，本研究對其 its1-5.8sits2 區(qū)域的堿基序列進(jìn)行了測定并選擇 libertella sp 等 19 株 參考菌株進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌 re0105 與 libertella sp 具有較近親緣關(guān)系， 二者堿基相似性為 76.1，但是否為 libertella 屬尚有待進(jìn)一步確證。libertella（盤針孢菌 屬）是引起楊樹腐爛和油杉枝銹病的病原菌。若內(nèi)生真菌 re0105 為 libertella 屬真菌，則 說明 libertella 與不同宿主植物之間表現(xiàn)出不同關(guān)系，在一種宿主上可能為共生關(guān)系，而在 另一種宿主上為寄生關(guān)系。通過對內(nèi)生真菌 re0105 液體發(fā)酵培養(yǎng)和合成產(chǎn)物的 hpls/ms 分析，首次發(fā)現(xiàn)分離自 盾葉薯蕷根狀莖的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生薯蕷皂苷元，再一次為內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)與宿主植物相同 或相似代謝產(chǎn)物提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。同時(shí)這一結(jié)果也為今后用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)薯蕷皂苷元提 供了一條新途徑，具有實(shí)際應(yīng)用意義。本文從內(nèi)生真菌 re0105 利用多種營養(yǎng)的情況可以看出，re1005 可利用的碳源較為廣 泛，無機(jī)氮源中既為氨態(tài)氮又為硝態(tài)氮的硝酸銨較有利于 re0105 生長。但由于自然條件下 內(nèi)生真菌所處的特殊的生長環(huán)境，內(nèi)生真菌對活體的依賴性決定了其對有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)的需要。研究發(fā)現(xiàn)富含有機(jī)營養(yǎng)的培養(yǎng)基和盾葉薯蕷細(xì)胞提取物對內(nèi)生真菌生長具有明顯刺激作用，但細(xì)胞提取物對內(nèi)生真菌生長刺激作用是否具有特異性，即其它種類植物細(xì)胞提取物對 該內(nèi)生真菌生長是否具有刺激作用以及刺激效果如何尚有待進(jìn)一步研究。同時(shí)還首次發(fā)現(xiàn)適 宜濃度（20mol/l）生長素（naa、2，4d）能明顯促進(jìn) re0105 生長。上述結(jié)果為今 后進(jìn)一步研究內(nèi)生真菌和內(nèi)生真菌與宿主植物相互作用的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。references1. arnold ae, maynard z, gilbert gs. 2000. are tropical fungal endophytes hyperdiverse? ecology letters 3:2672742. bacon cw. 1990. isolation, culture and maintenance of endophytic fungi of grasses. in labeda dp (ed) isolation of biotechnological organisms from nature. mcgraw-hill company. p265, p2723. fisher pj, petrini o, petrini le. 1994. fungal endophytes from the leaves and twigs of quercus ilex l. fromengland, marjorca and switzerland. new phytol 127: 1331374. guo ld, hyde kd, liew ecy. 2000. identification of endophytic fungi from livistona chinensis based on morphology and rdna sequences. new phytol 147: 6176305. johnson mc, bush lp, siegel mr. 1986. infecction of tall fescue with acremonium coenphialum by means of callus culture. plant disease 70: 3803826. kearney jf, parrot wa, hill ns.1991. infection of somatic embryos of tall fescue with acremonium coenophialum. crop science 31: 9799847. latch gc, christensen mj.1985. artifical infection of grasses with endophytes. annals of applied biology107: 17248. li jy, sidhu rs, ford ej, long dm, hess wm, strobel ga. 1998. the induction of taxol production in the endophytic fungus-periconia sp from torreya grandifolia. journal of industrial microbiology & biotechnology 20: 2592649. li wk, hu zb. 2005. endophytes and natural medicines. chin j nat med. 3: 193199 (in chinese)10. moon cd, miles co, jarlfors u, schardl cl. 2002. the evolutionary origins of three new neotyphodiumendophyte species from grasses indigenous to the southern hemisphere. mycologia 94: 69471111. stierle a, strobel g, stierle d. 1993. taxol and taxane production by taxomyces andreanae, an endophytic fungus of pacific yew. science 260: 21421612. tamura k, dudley j, nei m, kumar s. 2007. mega4: molecular evolutionary genetics analysis (mega)software version 4.0. molecular biology and evolution 24:1596159913. white tj, bruns td, lee s, taylor jw. 1990. amplification and direct sequencing of fungal ribosomal rna genes for phylogenetics. in innis ma, gelfand h, sninsky js, white tj (eds.) pcr protocols: a guide to methods and applications. academic press, new york. 31532214. zhu h, qu f, zhu lh. 1994. isolation of genomic dnas from fungi using benzyl chloride.mycosystema 13: 3440 (in chinese)參考文獻(xiàn)黎萬奎，胡之璧. 2005. 內(nèi)生菌與天然藥物，中國天然藥物，3: 193199朱衡，瞿峰，朱立煌.1994. 利用氯化芐提取適于分子生物學(xué)分析的真菌dna，菌物系統(tǒng)，13: 3440isolation and characteristics of an endophytic fungus fromdioscorea zingiberensis c. h. wright co-cultivated with host calliyuan li-hong,lu yu-ting,xu lin,ouyang ping-kai*( college of life science and pharmaceutical engineering