[地方標準]-DB33T 473-2004 β-內(nèi)酰胺類、磺胺類和氨基糖苷類注鏈霉素型藥物殘留量的測定 注放射免疫快速檢測法1.doc

db33/t 2003浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布2004-03-04實施2004-02-04發(fā)布-內(nèi)酰胺類、磺胺類和氨基糖苷類鏈霉素型藥物殘留量的測定 放射免疫快速檢測法determination of beta-lactam,sulfa drugs and aminoglycoside-st residues-radioimmunoassaydb33/t 4732004db33浙江省地方標準ics 07.100.30c 53備案號：14979-20041db33/t 4732004前 言本標準由杭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局、杭州市農(nóng)業(yè)局共同提出。本標準由杭州市農(nóng)產(chǎn)品檢測站負責(zé)起草。本標準由浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院、華粵行儀器有限公司參加起草。本標準主要起草人：胡學(xué)肖、楊華、周方、袁謙、方維煥、鄒黎明、李容、姚建紅。i-內(nèi)酰胺類、磺胺類和氨基糖苷類鏈霉素型藥物殘留量的測定 放射免疫快速檢測法1 范圍本標準規(guī)定了-內(nèi)酰胺類、磺胺類和氨基糖苷類鏈霉素型藥物殘留量的測定方法。本標準適用于牛乳及其制品（生鮮乳、滅菌乳、乳粉等）和畜、禽等動物肌肉及內(nèi)臟中-內(nèi)酰胺類和磺胺類藥物殘留的測定，以及牛乳及其制品中氨基糖苷類鏈霉素型藥物（鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素）殘留的測定。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注明日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。gb/t 6682 分析實驗用水規(guī)格和試驗方法3 原理樣品中殘留的藥物和藥片中標記了14c或3h的藥物競爭結(jié)合其特異性受體，經(jīng)免疫競爭反應(yīng)后離心，取沉淀物加入閃爍液，在液體閃爍計數(shù)器中計數(shù)1分鐘，將計數(shù)值與標準溶液測定的計數(shù)值進行比較，計算待測樣品中藥物的殘留量。4 試劑和溶液4.1 水應(yīng)符合gb/t 6682二級用水要求。4.2 閃爍液由放射免疫試劑盒公司提供。4.3 牛乳及其制品測定用charm ii放射免疫試劑盒或其它公司同類產(chǎn)品4.3.1 牛乳及其制品中-內(nèi)酰胺類藥物測定用放射免疫試劑盒。包括：綠色和黃色藥片、牛乳陰性對照濃縮干粉、青霉素g標準干粉等。4.3.2 牛乳及其制品中磺胺類藥物測定用放射免疫試劑盒。包括：白色和粉紅色藥片、牛乳陰性對照濃縮干粉、磺胺二甲嘧啶標準干粉等。4.3.3 牛乳及其制品中氨基糖苷類鏈霉素型藥物測定用放射免疫試劑盒。包括：白色和綠色藥片、牛乳陰性對照濃縮干粉、鏈霉素標準干粉等。4.3.4 牛乳陰性對照液配制：取出待測藥物試劑盒中的牛乳陰性對照濃縮干粉瓶，加入100ml 40 oc左右的水，震蕩混勻，冷卻至07oc，備用。4.4 動物組織測定用charm ii放射免疫試劑盒或其它公司同類產(chǎn)品4.4.1 動物組織中-內(nèi)酰胺類藥物測定用放射免疫試劑盒。包括：綠色和黃色藥片、組織陰性對照濃縮干粉、青霉素g標準干粉、萃取緩沖液干粉和m2緩沖液干粉等。4.4.2 動物組織中磺胺類藥物測定用放射免疫試劑盒。包括：白色和粉紅色藥片、組織陰性對照濃縮干粉、磺胺二甲嘧啶標準干粉、萃取緩沖液干粉和m2緩沖液干粉等。4.4.3 萃取緩沖液配制：取出待測藥物試劑盒中的萃取緩沖液干粉瓶，將瓶中干粉全部轉(zhuǎn)移入1000ml容量瓶中，用水定容至刻度，震蕩混勻，備用。4.4.4 m2緩沖液配制：取出待測藥物試劑盒中的m2緩沖液干粉瓶，加入50ml水，震蕩混勻，備用。4.4.5 組織陰性對照液配制：取出待測藥物試劑盒中的組織陰性對照濃縮干粉瓶，加入10ml水，震蕩混勻，將其全部加入30.0ml萃取緩沖液（4.4.3）中，在錐形瓶中混合均勻，備用。4.5 青霉素g標準溶液和陽性對照液配制4.5.1 青霉素g標準溶液配制4.5.1.1 青霉素g標準貯備液：濃度為1000ng/ml。取出-內(nèi)酰胺類藥物試劑盒（4.3.1或4.4.1）中的青霉素g標準干粉瓶，準確加入10ml水，震蕩混勻，備用。4.5.1.2 牛乳及其制品測定用青霉素g標準中間工作液：濃度為50ng/ml。吸取2.0ml青霉素g標準貯備液（4.5.1.1）和38.0ml牛乳陰性對照液（4.3.4），在錐形瓶中混合均勻，備用。4.5.1.3 牛乳及其制品測定用青霉素g標準工作液 吸取1.5ml、2.5ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml青霉素g標準中間工作液（4.5.1.2），分別移至25ml容量瓶中，用牛乳陰性對照液（4.3.4）稀釋定容至刻度，混合均勻，配制成3，5，10，15，20ng/ml的標準系列。4.5.1.4 動物組織測定用青霉素g標準中間工作液：濃度為50ng/ml。吸取3.0ml青霉素g標準貯備液（4.5.1.1）、27.0ml組織陰性對照液（4.4.5）和30ml萃取緩沖液（4.4.3），在錐形瓶中混合均勻，備用。4.5.1.5 動物組織測定用青霉素g標準工作液吸取5.0ml、7.5ml、10.0ml、12.5ml、15.0ml青霉素g標準中間工作液（4.5.1.4），分別移至25ml容量瓶中，用萃取緩沖液（4.4.3）稀釋定容至刻度，混合均勻，配制成10，15，20，25，30ng/ml的標準系列。4.5.2 青霉素g陽性對照液配制 4.5.2.1 牛乳及其制品測定用青霉素g陽性對照液：濃度為5ng/ml。吸取1.0ml青霉素g標準中間工作液（4.5.1.2）和9ml牛乳陰性對照液（4.3.4），在小燒杯中混合均勻。4.5.2.2 動物組織測定用青霉素g陽性對照液：濃度為12.5ng/ml。吸取0.3ml青霉素g標準貯備液（4.5.1.1），加入到5.7ml組織陰性對照溶液（4.4.5）中，在小燒杯中混合均勻，然后從中吸取2.0ml混合溶液，加入到6.0ml萃取緩沖液（4.4.3）中，在小燒杯中混合均勻。4.6 磺胺二甲嘧啶標準溶液和陽性對照液配制4.6.1 磺胺二甲嘧啶標準溶液配制4.6.1.1 磺胺二甲嘧啶標準貯備液：濃度為1000ng/ml。取出磺胺類藥物試劑盒（4.3.2或4.4.2）中的磺胺二甲嘧啶標準干粉瓶，準確加入10ml水，震蕩混勻，備用。4.6.1.2 牛乳及其制品測定用磺胺二甲嘧啶標準中間工作液：濃度為50ng/ml。吸取3.0ml磺胺二甲嘧啶標準貯備液（4.6.1.1）和57.0ml牛乳陰性對照液（4.3.4），在錐形瓶中混合均勻，備用。4.6.1.3 牛乳及其制品測定用磺胺二甲嘧啶標準工作液 吸取5.0ml、7.5ml、10.0ml、12.5ml、15.0ml磺胺二甲嘧啶標準中間工作液（4.6.1.2），分別移至25ml容量瓶中，用牛乳陰性對照液（4.3.4）稀釋定容至刻度，混合均勻，配制成10，15，20，25，30ng/ml的標準系列。4.6.1.4 動物組織測定用磺胺二甲嘧啶標準中間工作液：濃度為50ng/ml。吸取3.0ml磺胺二甲嘧啶標準貯備液（4.6.1.1）、27.0ml組織陰性對照液（4.4.5）和30ml萃取緩沖液（4.4.3），在錐形瓶中混合均勻，備用。4.6.1.5 動物組織測定用磺胺二甲嘧啶標準工作液吸取5.0ml、7.5ml、10.0ml、12.5ml、15.0ml磺胺二甲嘧啶標準中間工作液（4.6.1.4），分別移至25ml容量瓶中，用萃取緩沖液（4.4.3）稀釋定容至刻度，混合均勻，配制成10，15，20，25，30ng/ml的標準系列。4.6.2 磺胺二甲嘧啶陽性對照液配制 4.6.2.1 牛乳及其制品測定用磺胺二甲嘧啶陽性對照液：濃度為10ng/ml。吸取2.0ml磺胺二甲嘧啶標準中間工作液（4.6.1.2）和8ml牛乳陰性對照液（4.3.4），在小燒杯中混合均勻。4.6.2.2 動物組織測定用磺胺二甲嘧啶陽性對照液：濃度為12.5ng/ml。吸取0.3ml磺胺二甲嘧啶標準貯備液（4.6.1.1），加入到5.7ml組織陰性對照溶液（4.4.5）中，在小燒杯中混合均勻，然后從中吸取2.0ml混合溶液，加入到6.0ml萃取緩沖液（4.4.3）中，在小燒杯中混合均勻。4.7 鏈霉素標準溶液和陽性對照液配制4.7.1 鏈霉素標準溶液配制4.7.1.1 鏈霉素標準貯備液：濃度為10000ng/ml。取出氨基糖苷類鏈霉素型藥物試劑盒（4.3.3）中的鏈霉素標準干粉瓶，準確加入10ml水，震蕩混勻，備用。4.7.1.2 牛乳及其制品測定用鏈霉素標準中間工作液：濃度為100ng/ml。吸取0.5ml鏈霉素標準貯備液（4.7.1.1），加入到50ml容量瓶中，用牛乳陰性對照液（4.3.4）稀釋定容至刻度，混合均勻，備用。4.7.1.3 牛乳及其制品測定用鏈霉素標準工作液 吸取2.5ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml、12.5ml鏈霉素標準中間工作液（4.7.1.2），分別移至25ml容量瓶中，用牛乳陰性對照液（4.3.4）稀釋定容至刻度，混合均勻，配制成10，20，30，40，50ng/ml的標準系列。4.7.2 鏈霉素陽性對照液配制4.7.2.1 牛乳及其制品測定用鏈霉素陽性對照液：濃度為25ng/ml。吸取2.0ml鏈霉素標準中間工作液（4.7.1.2）和6ml牛乳陰性對照液（4.3.4），在小燒杯中混合均勻。5 儀器和設(shè)備5.1 charm ii 6600/7600分析儀或其它同類產(chǎn)品。5.2 分析天平：最小感量為0.01g。5.3 可調(diào)溫加熱器或水浴鍋：20 oc100 oc（溫度精度0.1oc）。5.4 離心機：轉(zhuǎn)速不低于3300轉(zhuǎn)/分。5.5 高速組織分散機：轉(zhuǎn)速不低于10000轉(zhuǎn)/分。5.6 旋渦混合器。5.7 普通冰箱：帶冷凍室。5.8 冰袋5.9 連續(xù)可調(diào)移液器及配套吸頭：200l1000l、1ml5ml。5.10 專用試管及配套蓋子：13mm100mm，與分析儀配套。5.11 脫脂棉簽。5.12 實驗室常規(guī)玻璃器皿。6 分析步驟6.1 樣品制備6.1.1 液態(tài)牛乳：采取具有代表性的液態(tài)牛乳（生鮮乳、滅菌乳等）1000ml，放入冰箱中冷卻至07oc，密封保存，備用。生鮮乳保存期不超過5天，滅菌乳保存期不超過其規(guī)定時間。6.1.2 乳粉：采取具有代表性的樣品1kg，用四分法縮減至約250g，混勻，裝入樣品瓶內(nèi)室溫下密封保存，備用。6.1.3 動物組織：采取具有代表性的樣品1kg，放冰箱冷藏室中保存（5天內(nèi)不測定的樣品須冷凍保存），備用。6.2 提取6.2.1 液態(tài)牛乳：將待測牛乳混勻，取20ml，測定前在3300rpm的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，去除上層脂肪，下層牛乳樣品直接用于藥物殘留測定。6.2.2 乳粉：稱取2g待測乳粉，加入20ml水，溶解混勻，冷卻至07oc，備用。全脂乳粉溶解混勻后，先在3300rpm的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，去除上層脂肪。6.2.3 動物組織：切下約50g全精肌肉或內(nèi)臟，將其剁碎或絞碎，稱取10g樣品加入到50ml離心管中，同時加萃取緩沖液（4.4.3）至40ml刻度處。將離心管中的組織和緩沖液全部倒入小燒杯中，用高速組織分散機均質(zhì)1分鐘（處理不同樣品時必須用水清洗分散頭以避免交叉污染）。將均質(zhì)物搖勻后倒回原來的離心管中，將離心管放置在802oc的加熱器中恒溫規(guī)定時間（-內(nèi)酰胺類藥物30分鐘，磺胺類藥物45分鐘），取出后放置在冰水浴中冷卻10分鐘。將混合物在3300rpm的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，取上清液，用m2緩沖液（4.4.4）將ph值調(diào)至7.5左右，備用。6.3 免疫競爭反應(yīng)將含有待測藥物特異性受體的藥片（顏色見表1）放入到空試管（5.9）中，加300l水，旋渦混合約10秒鐘。加入規(guī)定體積（體積見表1）的試液（陰性對照液、陽性對照液、標準工作液、牛乳及其制品或動物組織樣液），旋渦混合約10秒鐘，立即加入含有14c或3h同位素的藥片（顏色見表1），在旋渦混合器上混合約15秒鐘；在規(guī)定溫度（溫度見表1）下加熱3分鐘，在3300rpm的轉(zhuǎn)速下離心3分鐘。取出試管，棄去上清液，并用脫脂棉簽擦去殘留在試管壁上的脂肪和液滴（注意不要接觸到沉淀物）。加300l水，在旋渦混合器上將沉淀物打碎；最后加入3.0ml閃爍液，旋渦混合約10秒鐘，并在試管上加上配套蓋子，備用。表1 免疫競爭反應(yīng)條件藥物類型試液類別受體藥片的顏色同位素藥片的顏色試液體積加熱溫度-內(nèi)酰胺類牛乳及其制品綠色黃色5.0ml85 1oc動物組織綠色黃色2.0ml55 1oc磺胺類牛乳及其制品白色粉紅色5.0ml85 1oc動物組織白色粉紅色4.0ml65 1oc氨基糖苷類鏈霉素型牛乳及其制品白色綠色5.0ml35 1oc6.4 測定6.4.1 試劑和儀器有效性確認檢測陰性對照液和陽性對照液各3次，求出其每分鐘液體閃爍次數(shù)（cpm值）的平均值，與試劑盒出廠計數(shù)單對比，陽性對照cpm平均值除以陰性對照cpm平均值應(yīng)與出廠計數(shù)單上的比值相近，允許偏差為0.1，但不能超過0.7（如超出允許范圍，應(yīng)重做或者與廠家聯(lián)系）。6.4.2 測定將標準工作液和待測樣液依次在charm ii 6600/7600分析儀或其它同類產(chǎn)品上進行60秒鐘的讀數(shù)，各讀三次，分別記錄每次的cpm值。測定-內(nèi)酰胺類藥物時，讀取14c頻道上的cpm值；測定磺胺類和氨基糖苷類鏈霉素型藥物時，讀取3h頻道上的cpm值。7 分析結(jié)果計算和表述7.1 標準工作曲線繪制以待測藥物標準工作液的濃度值（cs）為橫坐標，對應(yīng)的cpm值（cpms）為縱坐標，繪制標準工作曲線。7.2 結(jié)果計算 樣品中待測藥物