[精品論文]胰腺癌細(xì)胞中 MEK1 和 MEK2 的差異功能.doc

精品論文胰腺癌細(xì)胞中 mek1 和 mek2 的差異功能解析譚曉冬，周磊，王懷濤，朱海軍，張峻，李捍司，王兆平，孫楊，楊一帆5（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院胰腺甲狀腺外科，沈陽(yáng) 110004） 摘要：絲裂原活化蛋白激酶激酶 1/2（mitoge-activated protein kinase kinase 1/2, mek1/2）信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有重要作用。能夠抑制 mek1/2 活化的小分子化合物可成為抗 腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的靶點(diǎn)。但 mek1 和 mek2 在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚未清楚。為了 探究胰腺癌細(xì)胞系中 mek1 和 mek2 的不同功能，我們利用基因敲減技術(shù)分別抑制 mek110和 mek2 的 mrna 合成。我們對(duì) mek1 及 mek2 基因敲減的胰腺癌細(xì)胞系 pc-1.0 進(jìn)行細(xì) 胞形態(tài)學(xué)、增殖、有絲分裂阻滯（mitotic arrest）和體外侵襲能力實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示 mek1 表 達(dá)的抑制能夠特異性抑制細(xì)胞增殖和 g0/g1 轉(zhuǎn)化。而 mek2 表達(dá)的抑制特異改變細(xì)胞形態(tài) 及抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力。在胰腺癌細(xì)胞系中 mek1 和 mek2 調(diào)控不同的生物學(xué)反應(yīng)。 在胰腺癌治療中，mek1 和 mek2 可成為抑制特異細(xì)胞功能的不同靶點(diǎn)。15關(guān)鍵詞：胰腺癌；mek1；mek2；基因干擾；功能調(diào)節(jié)中圖分類號(hào)：r735.9mek1 and mek2 isoforms regulate distinct functions in pancreatic cancer cells20tan xiaodong, zhou lei, wang huaitao, zhu haijun, zhang jun, li hansi,wang zhaoping, sun yang, yang yifan(department of pancreatic and thyroid surgery, shengjing hospital, china medical university,shenyang 110004)abstract: the mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 (mek1/2) signalling pathway plays a25central role in tumour progression. small molecules that inhibitor mek1/2 are therefore considered attractive candidates for anti-cancer drugs. however, the exact contributions of mek1and mek2 to the development of pancreatic cancer remain to be established. to differentiate the functions of mek1 and mek2 in a cultured pancreatic cancer cell line, we utilised shrna-mediated knockdown of their two mrnas individually. we studied the effects of mek130and mek2 knockdown on cell morphology, proliferation, mitotic arrest, and in vitro invasion capability in pc-1.0 cells. the results showed that inhibition of mek1 expression was an effective and specific approach to inhibit cell proliferation and induce g0/g1 arrest. on the other hand, mek2 knockdown specially altered cell morphology and inhibited the invasive ability of pancreatic cancer cells. therefore, mek1 and mek2 mediate different biological responses in35cultured pancreatic cancer cells. these proteins could become distinct targets for the inhibition of specific cellular functions in the treatment of pancreatic cancer.keywords: pancreatic cancer; mek1; mek2; rnai; function regulation0引言40胰腺癌常伴隨廣泛的侵襲和/或轉(zhuǎn)移，無(wú)法進(jìn)行治療性外科手術(shù)治療。以侵襲/轉(zhuǎn)移相關(guān) 因子為靶點(diǎn)的分子治療方法的發(fā)展為提高胰腺癌患者預(yù)后提供了新途徑。但胰腺癌侵襲/轉(zhuǎn) 移的細(xì)胞及分子機(jī)制尚不清楚。利用 bop 誘導(dǎo)的敘利亞倉(cāng)鼠實(shí)驗(yàn)性胰腺癌模型，經(jīng)胰腺內(nèi)移植（intra-pancreatic transplantation）后，建立兩種胰腺癌細(xì)胞系 pc-1（非解離型低轉(zhuǎn)移株）和 pc-1.0（解離型基金項(xiàng)目：高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20092104120014）作者簡(jiǎn)介：譚曉冬，（1971-），男，教授，主任醫(yī)師，主要研究方向：胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。e-mail:- 9 -45高轉(zhuǎn)移株），具有了不同的侵襲和轉(zhuǎn)移的潛能1-3。前期研究中我們利用表達(dá)差異分析方法（representational difference analysis, rda）發(fā)現(xiàn) pc-1.0 和 pc-1 細(xì)胞的基因表達(dá)存在差異。 mek2 是與 pc-1.0 和 pc-1 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的因子4。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) mek2 參 與調(diào)控倉(cāng)鼠及人胰腺癌細(xì)胞的侵襲/轉(zhuǎn)移5。mek2 作為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, mapk）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通50路中的重要激酶之一，參與了較多細(xì)胞生化過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化，細(xì)胞分裂，應(yīng)激和 細(xì)胞凋亡6-9。mapk 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路幾乎存在于所有真核生物細(xì)胞中，可分為三種激酶體系： mapk，絲裂原活化蛋白激酶激活劑（map kinase kinase，mkk 或 mek）和絲裂原活化蛋 白激酶激酶激活劑（map kinase kinase activator，mapkkk）10。mek1 和 mek2 是 mek 家族的兩種同分異構(gòu)體，通常表達(dá)為 mek1/2。二者擁有 85%相同的氨基酸序列，并在細(xì)胞55系及組織中特異表達(dá)。二者通常被認(rèn)為具有相同的功能，但是有文獻(xiàn)報(bào)道二者可能通過(guò)不同 途徑調(diào)控并產(chǎn)生不同的功能11-13。迄今 mek1 和 mek2 在胰腺癌細(xì)胞中的作用尚未清楚。 為進(jìn)一步闡明 mek1 和 mek2 在胰腺癌細(xì)胞中的不同功能調(diào)控機(jī)制，我們利用逆轉(zhuǎn)錄 病毒，通過(guò)短發(fā)卡 rna（short-hairpin rnas, shrnas）技術(shù)分別沉默解離型高轉(zhuǎn)移株胰腺癌細(xì)胞 pc-1.0 細(xì)胞中 mek1 和 mek2 的基因表達(dá)，并進(jìn)一步檢測(cè)相應(yīng)基因功能。601材料和方法1.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)采用倉(cāng)鼠非解離型低轉(zhuǎn)移株胰腺癌細(xì)胞系 pc-1 細(xì)胞和解離型高轉(zhuǎn)移株胰腺癌細(xì)胞系 pc-1.0 細(xì)胞。pc-1 細(xì)胞系是利用 bop 誘導(dǎo)的敘利亞倉(cāng)鼠實(shí)驗(yàn)性胰腺癌模型建立1。pc-1.0 細(xì)胞系是由同系倉(cāng)鼠皮下接種 pc-1 細(xì)胞后產(chǎn)生的腫瘤而建立2。上述兩種細(xì)胞系呈不同形65態(tài)學(xué)方式生長(zhǎng)。pc-1 細(xì)胞呈島樣細(xì)胞克隆方式生長(zhǎng)，pc-1.0 細(xì)胞主要呈單個(gè)細(xì)胞方式生長(zhǎng)3。采用 pc-1.0 細(xì)胞的亞克隆表達(dá) mek1 或 mek2 的 shrna。采用 gp2-293 包裝細(xì)胞復(fù) 制逆轉(zhuǎn)錄病毒。上述細(xì)胞系均以 rpmi-1640 培養(yǎng)液（gibco-brl, grand island, ny）培養(yǎng)，并加 10胎70牛血清（bioserum, victoria, australia）、100 u /ml 青霉素 g 和 100 g /ml 鏈霉素，于含 5co2 37孵箱內(nèi)培養(yǎng)。上述細(xì)胞在進(jìn)行免疫細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)前無(wú)血清培養(yǎng)。1.2 抗體本實(shí)驗(yàn)中利用兔抗人的 mek1、mek2 及 -actin 多克隆抗體（santa cruz biotechnology, santa cruz, ca）作為一抗。利用辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗體和 fitc 標(biāo)記的熒光抗體（santa75cruz biotechnology, santa cruz, ca）作為第二抗體。1.3 抗 mek1 和抗 mek2 的 rnai 序列設(shè)計(jì)和 shrna 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)和分布 mek1 和 mek2 特異性靶點(diǎn)序列根據(jù)在/rnaidesigner上的綜合 網(wǎng)站上（comprehensive online）rnai 工具（clontech laboratories, inc., ca, usa），利用 mek1(gene bank accession no. nm_002755) 和 mek2 （ gene bank accession no.80nm_030662 ） 相 關(guān) 序 列 設(shè) 計(jì) 而 建 立 。 mek1shrna標(biāo) 記mrna（5-ggagaagcacaagaucaug-3 ）的 nt 為 614-632 ，mek2 shrna 標(biāo)記 mrna（5-ccuggacuauauugugaac-3）的 nt 為 1216-1234，二者根據(jù)之前設(shè)計(jì)經(jīng)過(guò)化學(xué)合859095100105110115120成并克隆進(jìn)入逆轉(zhuǎn)錄病毒 psiren-retroq-zsgreen14。利用 bigdye terminator sequencing kit 的 abi prism 3100 genetic analyzer 檢測(cè)病毒帶菌體的序列確認(rèn) shrna 的插入（applied biosystems, ca, usa）。1.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒的生產(chǎn)和感染應(yīng)用 lipofectamine 2000 (invitrogen, carlsbad, ca, usa)試劑盒將 gp2-293 細(xì)胞（8105） 與包裝帶菌體（packaging vector）pvsv-g 和含有 mek1 或 mek2 shrna 插入序列(clontech laboratories, inc., ca, usa)的 rnai-ready psiren-retroq-zsgreen 帶菌體共同轉(zhuǎn)染。對(duì)照細(xì) 胞系由 gp2-293 細(xì)胞與相應(yīng)的空白帶菌體（rnai-ready psiren-retroq-zsgreen 和 pvsv-g） 感染而來(lái)。轉(zhuǎn)染后上述細(xì)胞系在 rpmi 1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng) 48 小時(shí)。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn) 染和表達(dá)用戶手冊(cè)（pt3132, clontech laboratories, inc., ca, usa），將含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì) 胞上清液過(guò)濾并感染 pc-1.0 細(xì)胞。為了得到 mek1 和 mek2 沉默的細(xì)胞株，我們利用免疫 熒光顯微鏡進(jìn)行克隆篩選，并分別進(jìn)行培養(yǎng)和進(jìn)一步功能分析。1.5 應(yīng)用 rt-pcr 對(duì) mek1 和 mek2 mrna 表達(dá)的分析總 rna 由 mek1 或 mek2 shrna 表達(dá)和感染空白帶菌體的 pc-1.0 細(xì)胞分離提取。利 用 superscript ii 試劑盒（life technologies, inc.），從每個(gè)樣本中取 1 g 反轉(zhuǎn)錄成 cdna5。 mek1、mek2 和 -actin 的特異 pcr 引物序列如下：mek1：5-attattgttcccctaagtggattg-3（forward）5-ttacaacagcattggtacttggat-3（reverse）；mek2：5-gcagtcggacatctggagca-3（forward）5-caccgttgggcagcttagga-3（reverse）；-actin：5-gtggggcgccccaggcacca-3（forward）5-ctccttaagtcacgcacgattcc-3（reverse）；-actin 作為標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照（normalising control）。經(jīng)最初 95變性 5 分鐘后，按照 94 30 秒、55 30 秒、72 1 分鐘進(jìn)行 pcr 30 個(gè)循環(huán)，最后經(jīng) 72延伸 7 分鐘。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重 復(fù)三次。為了進(jìn)行 mrna 定量，樣本均與標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照即 -actin mrna 的表達(dá)進(jìn)行比較，并 應(yīng)用 genesnap 和 genetools 軟件（syngene, cambridge uk）進(jìn)行結(jié)果分析。1.6 應(yīng)用 western blotting 對(duì) mek1 和 mek2 蛋白水平表達(dá)的分析于直徑 90mm 培養(yǎng)皿中加入含 10%小牛血清的 rpmi 1640 培養(yǎng)液 10ml，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。 應(yīng)用 1ml 預(yù)冷的 ripa 裂解液（50mm tris，150ml nacl，1% np-40，0.5% 脫氧膽酸鈉，0.1% sds，ph 7.5 1mm 苯甲磺酰氟，使用前加入 1mg/ml leupeptin 和 1mg/ml aprotinin）冰上裂解 細(xì)胞 15 分鐘。經(jīng) 4 5000 rpm 5 分鐘離心后，取上清液并分裝貯存于-80冰箱備用。-actin 作為內(nèi)參。western blot 方法同前15。即將總蛋白質(zhì)含量相同的不同樣本（20 g）利用聚丙烯酰胺 平板凝膠電泳按分子量分離，后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到 pvdf 膜（bio-rad, anaheim, usa）上。 然后，將 pvdf 膜與 0.1% tween-20/pbs 稀釋的一抗共同于 4下孵育過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物 酶標(biāo)記的二抗以 0.1% tween-20/pbs 按 1：5000 稀釋，并與一抗孵育后的膜共同孵育。柯 達(dá)膠片(eastman kodak company, rochester, ny) 加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑（santa cruz biotechnology, santa cruz, ca）以探測(cè)收集蛋白條帶光信號(hào)。1251301351401451501551.7 體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)我們將 mek1 基因敲減、mek2 基因敲減及空白對(duì)照的 pc-1.0 細(xì)胞分別以 5000 個(gè)/孔 的密度接種于 96 孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入含 10% fbs 的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng) 3 天后，按照 產(chǎn)品說(shuō)明應(yīng)用 cck-8 試劑盒（cell counting kit 8, dojindo co., kumamoto, japan）對(duì)有活力 的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。該試劑為一種四唑鹽復(fù)合物（wst-8），與活細(xì)胞內(nèi)特異物質(zhì)反應(yīng)形成一 種有顏色物質(zhì)并在 450nm 有吸收高峰，即 450nm 時(shí)該物質(zhì)的量直接反映了培養(yǎng)基中活細(xì)胞 的數(shù)量。各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)接種于 3 個(gè)孔中。1.8 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 pi（propidium iodide）對(duì) dna 染色以分析細(xì)胞周期和有絲分裂阻滯的變化。細(xì)胞 經(jīng)胰酶消化、沉淀，再用預(yù)冷的 pbs（phosphate-buffered saline）制成細(xì)胞懸液。將預(yù)冷的95%乙醇 three volume 緩慢加入此細(xì)胞懸液并輕輕震蕩。預(yù)冷試劑和緩慢加入乙醇的目的在 于減少細(xì)胞聚集后沉淀。用等量的 pi 溶液（30 g/ml，溶于 pbs）和 rnase a 溶液（100 g/ml， 溶于 pbs）再次制成細(xì)胞懸液。已染色的細(xì)胞在 4下避光保存過(guò)夜。應(yīng)用 facscan 流式 細(xì)胞儀（becton dickinson, san jose, ca）對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析，觀察細(xì)胞處于 g1 期、g2 期 和 s 期的比例。1.9 體外侵襲實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 invasion chambers（becton dickinson labware, bedford, ma）進(jìn)行體外侵襲實(shí)驗(yàn)。1ml 含 10fbs 的 rpmi-1640 培養(yǎng)液作為化學(xué)誘導(dǎo)物、相同劑量 balb/3t3 細(xì)胞的無(wú)血清 條件培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)板孔中。將 mek1 基因敲減、mek2 基因敲減和空白對(duì)照的 pc-1.0 細(xì)胞的細(xì)胞懸液（1x105/ml）約 500l 以及等量的相應(yīng)實(shí)驗(yàn)原料一起加入到 transwell 的內(nèi)室 中。上述細(xì)胞 37培養(yǎng) 12 小時(shí)后，用棉拭子擦去濾膜上表面的殘留細(xì)胞，對(duì)已遷移到濾膜 下表面的細(xì)胞進(jìn)行固定并應(yīng)用 diff-quik 試劑（dade behring, dugen, switzerland）染色，之 后在 1mm2 網(wǎng)格上計(jì)數(shù)細(xì)胞核數(shù)目以確定濾膜下表面遷移細(xì)胞的數(shù)目（x100 倍放大）。1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以平均值標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。通過(guò) stat view 計(jì)算機(jī)軟件（sas institute，inc.，cary，nc）利用非配對(duì) students t 檢驗(yàn)評(píng)估每個(gè)分組之間的差異。p0.05 認(rèn)為差異具有顯著性。2結(jié)果2.1 mek1 shrna 和 mek2 shrna 質(zhì)粒的建立為進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用含有 mek1 或 mek2 shrna 的 psiren-retroq-zsgreen 帶 菌體阻滯 mek1 或 mek2 的表達(dá)。經(jīng)空白對(duì)照反轉(zhuǎn)錄病毒感染的 pc-1.0 細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、 細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和體外侵襲實(shí)驗(yàn)方面與未感染的 pc-1.0 細(xì)胞進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)空白質(zhì)粒 本身不影響 pc-1.0 細(xì)胞的生物功能（數(shù)據(jù)未給出）。為了阻滯內(nèi)源性 mek1 或 mek2，我 們?cè)?rnai-ready psiren-retroq-zsgreen 上對(duì)兩個(gè)基因各選擇了三種 shrna 序列。我們發(fā) 現(xiàn)所選擇的 shrna 均分別降低內(nèi)源性 mek1 或 mek2 mrna 的表達(dá)，其中減少最多的分 別是 mek1 shrna 3（98.4%）和 mek2 shrna 3（77.5%）（圖 1）。與空白質(zhì)粒組比較， mek1 shrna 3 和 mek2 shrna 3 作用后明顯抑制 mek1 和 mek2 的蛋白表達(dá)（圖 2）。 故篩選出這兩種帶菌體進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。160165圖 1 經(jīng) shrna 基因敲減調(diào)節(jié)后 pc-1.0 細(xì)胞中 mek1 和 mek2 mrna 表達(dá)變化；與對(duì)照組相比，表達(dá)mek1 shrna 的 pc-1.0 細(xì)胞中 mek1 mrna 表達(dá)水平顯著降低，而 mek2 表達(dá)沒(méi)有變化。同樣，mek2 shrna 顯著降低 mek2 mrna 表達(dá)水平而 mek1 表達(dá)無(wú)明顯變化。-actin 為標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照。圖 2 經(jīng) mek1 或 mek2 基因敲減后 pc-1.0 細(xì)胞中 mek1 或 mek2 的蛋白表達(dá)變化；與對(duì)照組相比，有 mek1 shrna 表達(dá)的 pc-1.0 細(xì)胞中 mek1 蛋白表達(dá)水平顯著降低，而 mek2 沒(méi)有變化。mek2 shrna 顯 著降低 mek2 蛋白表達(dá)水平而對(duì) mek1 表達(dá)沒(méi)有作用。-actin 作為內(nèi)參。2.2 mek1 和 mek2 基因敲減的 pc-1.0 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生長(zhǎng)方式變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 mek2 基因敲減的 pc-1.0 細(xì)胞以克隆方式生長(zhǎng)。而 mek1 基因敲減的細(xì) 胞在細(xì)胞生長(zhǎng)方式方面與空白質(zhì)粒感染的 pc-1.0 細(xì)胞沒(méi)有變化（圖 3）。170175180185圖 3 mek1 和 mek2 基因敲減后 pc-1.0 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；與對(duì)照組（a）相比，mek2 基因敲減顯著 誘導(dǎo)了 pc-1.0 細(xì)胞（c）的細(xì)胞集聚。而經(jīng) mek1 基因敲減 pc-1.0 細(xì)胞（b）未表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞生長(zhǎng)方 式變化。免疫熒光圖像顯示了對(duì)照組（d）、mek1-shrna 組（e）和 mek2-shrna 組（f）細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn) 染情況。2.3 mek1 和 mek2 基因敲減的 pc-1.0 細(xì)胞的增殖變化對(duì) mek1 和 mek2 基因敲減的 pc-1.0 胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖進(jìn)一步進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā) 現(xiàn) mek1 基因表達(dá)下調(diào)抑制 pc-1.0 細(xì)胞的增殖（圖 4）。尤其在培養(yǎng) 48 小時(shí)和 72 小時(shí)以 后，pc-1.0 細(xì)胞增殖活動(dòng)顯著減低，與空白對(duì)照細(xì)胞相比抑制率分別為 62.0%和 60.5%（p0.05）。圖 4 mek1 和 mek2 基因敲減后 pc-1.0 細(xì)胞的增殖變化；pc-1.0 細(xì)胞經(jīng) mek1 基因敲減后在培養(yǎng) 48 小 時(shí)和 72 小時(shí)后表現(xiàn)出明顯的抗增殖作用。而 mek2 基因敲減在細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的抑制方面沒(méi)有明顯作用。1901952.4 mek1 和 mek2 基因敲減的 pc-1.0 細(xì)胞的細(xì)胞周期變化我們應(yīng)用 facscan 流式細(xì)胞儀對(duì) mek1 和 mek2 基因敲減的 pc-1.0 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周 期分布分析。在 mek1 基因敲減細(xì)胞中只有 8.1%0.7%的細(xì)胞處于有絲分裂的 s 期。而空 白對(duì)照 pc -1.0 細(xì)胞中有 26.6%5.4%的細(xì)胞處于 s 期（p 0.05，圖 5）。圖 5 mek1 和 mek2 基因敲減后 pc-1.0 細(xì)胞的有絲分裂阻滯變化；mek1 基因敲減減少了處于 s 期 pc-1.0 細(xì)胞的百分比，而 mek2 基因敲減后 pc-1.0 的細(xì)胞周期沒(méi)有明顯變化。黑色條帶，含有空白質(zhì)粒的對(duì)照 pc-1.0 細(xì)胞；斑點(diǎn)條帶，mek1 基因敲減的 pc-1.0 細(xì)胞；白色條帶，mek2 基因敲減的 pc-1.0 細(xì)胞。s， 顯著；ns，不顯著。2002052.5 mek1 和 mek2 基因敲減的 pc-1.0 細(xì)胞的體外侵襲能力變化如圖 6，空白對(duì)照細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵襲能力（侵襲細(xì)胞數(shù)=52.65.8）。而與空白對(duì)照 細(xì)胞相比，mek2 基因敲除顯著抑制了 pc-1.0 細(xì)胞的侵襲能力（侵襲細(xì)胞數(shù)=20.13.1, p 0.05）。圖 6 mek1 和 mek2 基因敲減后 pc-1.0 細(xì)胞的侵襲能力變化；與含有空白質(zhì)粒的對(duì)照 pc-1.0 細(xì)胞相比， mek2 基因敲減顯著抑制了 pc-1.0 細(xì)胞的侵襲能力。而 mek1 基因敲減后并沒(méi)有影響細(xì)胞的侵襲能力。s， 顯著；ns，不顯著。精品論文2102152202252302352402452502553討論mek 蛋白家族包含多個(gè)調(diào)節(jié)位點(diǎn)，多種信號(hào)分子能與這些位點(diǎn)結(jié)合。mek1 和 mek2 在兩個(gè)部位存在較大的不同：氮端的 erk 結(jié)合位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)，可與幾種其他信號(hào)蛋白 結(jié)合。mek1 和 mek2 在重要位點(diǎn)上的差異提示二者可能具有不完全相同的功能。有研究 利用基因敲除大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指出 mek1 和 mek2 蛋白存在功能差異，支持以上假說(shuō)12, 16。 另?yè)?jù)文獻(xiàn)指出 mek1 和 mek2 在肝細(xì)胞中表現(xiàn)出特異的功能。mek2 調(diào)節(jié)細(xì)胞生存，而 mek1 參與細(xì)胞增殖17。在近期的研究中，將 mek1 和 mek2 基因從胰腺癌細(xì)胞中敲減以 研究二者的功能變化。一些 mek1/2 的小分子抑制劑（如 u0126）已成為癌癥分子靶向治療 的候選分子5, 18，但大部分抑制劑同時(shí)阻滯 mek1 和 mek219。因此這些抑制劑缺乏特異 性。而 rnai 被認(rèn)為是檢測(cè)基因功能的強(qiáng)大工具，并在治療癌癥等疾病方面作為經(jīng)典治療方 法20。4結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞中 mek1 和 mek2 調(diào)節(jié)不同的生物功能。mek1 而不是 mek2 的表達(dá)抑制是抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo) g0/g1 阻滯的特異且有效的方法。而 mek2 mrna 特異 性改變細(xì)胞形態(tài)和抑制細(xì)胞侵襲能力。總之，表達(dá) mek1 和 mek2 shrna 的重組逆轉(zhuǎn)錄病 毒在胰腺癌治療方面可作為一種值得探索的手段。參考文獻(xiàn) (references)1 egami h, takiyama y, cano m, houser wh, pour pm. establishment of hamster pancreatic ductal carcinoma cell line (pc-1) producing blood group-related antigensj. carcinogenesis 1989; 10: 861-869.2 egami h, tomioka t, tempero m, kay d, pour pm. development of intrapancreatic transplantable model of pancreatic duct adenocarcinoma in syrian golden hamstersj. am j pathol 1991; 138: 557-561.3 pour pm, egami h, takiyama y. patterns of growth and metastases of induced pancreatic cancer in relation to the prognosis and its clinical implicationsj. gastroenterology 1991; 100: 529-536.4 ishikawa s, egami h, kurizaki t, akagi j, tamori y, yoshida n, tan x, hayashi n, ogawa m. identificationof genes related to invasion and metastasis in pancreatic cancer by cdna representational 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