發(fā)酵工程余龍江版第4章發(fā)酵工業(yè)無菌技術(shù).ppt

第四章,發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù),本章內(nèi)容,一、概念 二、發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略 三、發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù) 四、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌 五、空氣除菌,一、概念:滅菌、消毒、除菌、防腐,滅菌(sterilization):用化學(xué)或物理方法殺死物料或設(shè)備中所有有生命物質(zhì)的過程。 消毒(disinfection):用物理或化學(xué)方法殺死空氣、地表以及容器和器具表面的微生物。 除菌(degermation): 用過濾方法除去空氣或液體中的微生物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化學(xué)方法殺死或抑制微生物的生長和繁殖 。 消毒與滅菌的區(qū)別 消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用,二、發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略,（一）污染的危害 （二）污染的防治,1.染菌的不良后果,消耗營養(yǎng) 合成新產(chǎn)物；菌體自溶、發(fā)粘等造成分離困難 改變pH 分解產(chǎn)物 噬菌體破壞極大,2.染菌危害的具體分析 （1）染菌對不同菌種發(fā)酵的影響,A細(xì)菌 谷氨酸：發(fā)酵周期短，培養(yǎng)基不太豐富，較少染雜菌，但噬菌體威脅大。 肌苷：缺陷型生產(chǎn)菌，培養(yǎng)基豐富，易染菌，營養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴(yán)重抑制菌生長和合成代謝產(chǎn)物。,B. 霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破壞，發(fā)酵一無所獲。 檸檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。 C. 酵母菌: 易污染細(xì)菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：無論污染的是活菌、死菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。,（1）染菌對不同菌種發(fā)酵的影響,（2）染菌種類對發(fā)酵的影響,青霉素：怕染細(xì)短產(chǎn)氣桿菌 鏈霉素：怕染細(xì)短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌 四環(huán)素：怕染雙球菌、芽孢桿菌和莢膜桿菌 檸檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢桿菌 谷氨酸：怕染噬菌體，易造成連續(xù)污染,（3）不同發(fā)酵時期染菌對發(fā)酵的影響,種子擴(kuò)大時期染菌: 發(fā)酵前期染菌： 發(fā)酵中期染菌：挽救困難，應(yīng)早發(fā)現(xiàn)，快處理 ，處理方法應(yīng)根據(jù)各種發(fā)酵的特點和具體情況來決定 抗生素發(fā)酵 檸檬酸發(fā)酵 a. 污染細(xì)菌：加大通風(fēng)，加速產(chǎn)酸，調(diào)pH3.0，抑制細(xì)菌 b. 污染酵母：加入0.0250.035g/L CuSO4抑制酵母；通風(fēng)加大，加速產(chǎn)酸。,滅菌后棄去,應(yīng)迅速重新滅菌，補(bǔ)充必要的營養(yǎng)成分，重新接種,（3）不同發(fā)酵時期染菌對發(fā)酵的影響,檸檬酸發(fā)酵 c.染黃曲霉：加入另一罐將近發(fā)酵成熟的醪液，pH下降，黃曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能夠生長。提前放罐。 發(fā)酵后期污染 染菌量不太多，可繼續(xù)發(fā)酵 污染嚴(yán)重，則提前放罐 殺菌劑的添加：前期無必要，增加成本； 發(fā)現(xiàn)后加入，效果要具體評價,（4）雜菌污染對發(fā)酵產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響,絲狀菌發(fā)酵被產(chǎn)酸菌污染：pH不斷下降，菌絲大量自溶，發(fā)酵液粘度增加，過濾困難 處理方法：將發(fā)酵液加熱后再加助濾劑；先加絮凝劑使蛋白質(zhì)凝聚后沉淀 雜菌分泌較多蛋白質(zhì)雜質(zhì)時，對發(fā)酵后處理過程中采用溶媒萃取的提取工藝非常不利，使水相和溶媒之間極易發(fā)生乳化,1. 染菌的檢查與判斷,顯微鏡檢查法 鏡檢出雜菌需要一定時間 平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法：菌落 噬菌體檢查可采用雙層平板法：噬菌斑 肉湯培養(yǎng)檢查法 發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象判斷 DO2水平異常變化 pH異常變化 尾氣CO2異常變化,1,2,2. 污染原因分析,主要原因： 種子帶菌 無菌空氣帶菌 設(shè)備滲漏 滅菌不徹底 操作失誤 技術(shù)管理不善,從污染時間看：早期污染可能與接種操作不當(dāng)有關(guān)；后期污染可能與及中間補(bǔ)料有關(guān)。 從雜菌種類看： 耐熱芽孢桿菌：與有關(guān) 球菌、無芽孢桿菌：與 有關(guān) 淺綠色菌落的雜菌：與水有關(guān)，即冷卻盤管滲漏 霉菌：與有關(guān)，即無菌室滅菌不徹底或操作問題 酵母菌：糖液滅菌不徹底或放置時間較長 從染菌幅度看：各個發(fā)酵罐或多數(shù)發(fā)酵罐染菌，且所污染的是同一種雜菌，一般是空氣系統(tǒng)問題，若個別罐連續(xù)染菌，一般是設(shè)備問題。,2. 污染原因分析,3. 預(yù)防,種子帶菌的防治 滅菌徹底 接種可靠：無菌室及設(shè)備可靠，無菌操作可靠 保藏可靠 過濾空氣帶菌的防治 設(shè)備的滲漏或“死角”造成的染菌及其防治,“死角”,發(fā)酵罐的“死角” 法蘭、內(nèi)襯、接口、表頭、罐內(nèi)部件及其支撐件如攪拌軸拉桿、聯(lián)軸器、冷卻盤管、擋板、空氣分布管及其支撐件 口：人孔（或手孔）、排風(fēng)管接口、燈孔、視鏡口、進(jìn)料管口 發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角” 消除方法：加強(qiáng)清洗并定期鏟除污垢；安裝放汽邊閥 管道安裝不當(dāng)或配置不合理形成的“死角”,發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角”,法蘭連接不當(dāng)造成的“死角”,滅菌時蒸汽不易通達(dá)的“死角”及其消除方法,培養(yǎng)基與設(shè)備滅菌不徹底的防治 原料性狀：大顆粒的原料過篩除去。 實罐滅菌時要充分排除罐內(nèi)冷空氣。 滅菌過程中產(chǎn)生的泡沫造成染菌：添加消泡劑 防止泡沫升頂 連消不徹底 ：最好采用自動控制裝置 滅菌后期罐壓驟變 死角 操作不當(dāng)造成染菌 噬菌體染菌及其防治,3. 預(yù)防,采取哪些措施能夠保持無菌發(fā)酵？,物料、培養(yǎng)基、中間補(bǔ)料要滅菌； 發(fā)酵設(shè)備及輔助設(shè)備（空氣過濾裝置、各種發(fā)酵罐進(jìn)出口連接裝置）和管道要滅菌； 好氣發(fā)酵通入的空氣要除菌； 種子無污染；接種無菌操作過關(guān)； 為了保持發(fā)酵的長期無菌狀態(tài)，需維持正壓。,三、發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)滅菌方法,干熱滅菌法 濕熱滅菌法 射線滅菌法 化學(xué)藥劑滅菌法 過濾除菌法 火焰滅菌法,四、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌,（一）濕熱滅菌原理 （二）分批滅菌（實罐滅菌） （三）連續(xù)滅菌（連消） （四）分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較,1. 熱阻 2. 微生物熱死定律：對數(shù)殘留定律 3.滅菌溫度和時間的選擇 4. 影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素,（一）濕熱滅菌原理,1. 熱阻,定義：微生物對熱的抵抗力稱為熱阻，可用比死亡速率常數(shù)k來表示 。 k，熱阻, t,當(dāng)溫度T一定時，k隨微生物不同而不同，具體計算時，可取細(xì)菌芽孢的k值為標(biāo)準(zhǔn)。 當(dāng) T 變化時，k有很大變化，其變化遵從阿累尼烏斯定律 k=Aexp(- E/RT) k與微生物活化能及T有關(guān),1. 熱阻,大腸桿菌在不同溫度下 的殘留曲線,嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線,2. 微生物熱死定律： (1) 對數(shù)殘留定律,在一定溫度下，微生物受熱致死遵循分子反應(yīng)速度理論，微生物受熱死亡的速率-dN/dt與任何瞬間殘留的活菌數(shù)N成正比，即 當(dāng)Nt=0時， t=， 既無意義，也不可能。 一般采用Nt=0.001，即1000次滅菌中只有一次失敗。,(2) 非對數(shù)殘留定律,某些微生物受熱死亡的速率不符合對數(shù)殘留定律：如一些微生物芽孢。 kR ks NR Ns ND dNR/dt=-kR NR dNs/dt =kR NR -ks Ns Nt/N0=KR/(kR-kS) ekst-ks/kR e-kRt 式中NR：耐熱性活芽孢數(shù)；Ns：敏感性活芽孢數(shù) ND：死亡的芽孢數(shù)；kR：耐熱性芽孢的比死亡速率； ks：敏感性芽孢的比死亡速率； N0：初始活芽孢數(shù)。,培養(yǎng)基中含有大量的不耐熱的微生物和相當(dāng)數(shù)量的耐熱性微生物時的滅菌殘留曲線 在T相同時，對數(shù)與非對數(shù)定律的滅菌時間t不同。,3. 滅菌溫度和時間的選擇,培養(yǎng)物質(zhì)受熱破壞也可看作一級反應(yīng)： 式中C：對熱不穩(wěn)定物質(zhì)的濃度；k：分解速度常數(shù)； k的變化也遵循阿累尼烏斯方程：,都與相應(yīng)的活化能及T有關(guān),當(dāng)T1 T2 (k2/k1)/(k2/k1)=E/E1 (EE) 隨著T上升，菌死亡速率增加倍數(shù)大于培養(yǎng)基成分分解速率增加倍數(shù)，故一般選擇高溫快速滅菌 。,3. 滅菌溫度和時間的選擇,4. 影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素,培養(yǎng)基成分 油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)、高濃度有機(jī)物等增加微生物的耐熱性 低濃度（1%-2%）NaCl對微生物有保護(hù)作用，隨著濃度增加，保護(hù)作用減弱，當(dāng)濃度達(dá)8%-10%以上，則減弱微生物的耐熱性。,pH：pH6.0-8.0，微生物最耐熱，pH6.0，H+易滲入微生物細(xì)胞內(nèi)，改變細(xì)胞的生理反應(yīng)促使其死亡。培養(yǎng)基pH愈低，滅菌所需時間愈短。 培養(yǎng)基的物理狀態(tài) 泡沫：泡沫中的空氣形成隔熱層，對滅菌極為不利，可加入少量消泡劑 。 培養(yǎng)基中的微生物數(shù)量,4. 影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素,分空氣過濾器滅菌 并用空氣吹干,夾套或蛇管排冷水，開啟排氣管閥，空氣管通蒸汽，也可夾套內(nèi)通蒸汽,達(dá)70左右,取樣管,放料管,通蒸汽,120，1105pa,保溫,保溫階段，凡液面以下各管道都應(yīng)通蒸汽，液面上其余各管道則應(yīng)排蒸汽，不留死角，維持壓力、溫度恒定,罐壓接近空氣壓力,向罐內(nèi)通無菌空氣,保溫結(jié)束，依次關(guān)閉各排汽、進(jìn)汽閥門,夾套或蛇管中通冷水 培養(yǎng)基降溫到所需溫度,（二）分批滅菌（實罐滅菌） 1.滅菌工藝過程,升溫、冷卻兩階段也有一定的滅菌效果，考慮到滅菌的可靠性主要在保溫階段進(jìn)行，故可以簡單地利用式 (N/N0) =-kt 來粗略估算滅菌所需時間。,2. 滅菌時間的估算,2. 滅菌時間的估算,例1：有一發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，在1210C溫度下實罐滅菌，原污染程度為每1ml有2105個耐熱細(xì)菌芽孢，已知1210C時滅菌速度常數(shù)k=1.8min-1，求滅菌失敗機(jī)率為0.001時所需時間。 解：N0=401062105=81012(個) Nt=0.001(個) k=1.8(min-1) (Nt/N0)=-kt t=2.303/klg(N0/Nt)=2.303/1.8lg(81015) =20.34(min) 由于升溫階段就有部分菌被殺滅，特別是當(dāng)培 養(yǎng)基加熱至1000C以上，這個作用較為顯著， 故實際保溫階段時間比計算值要短。,（三）連續(xù)滅菌（連消）,工藝流程 噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程 噴射加熱連續(xù)滅菌流程 薄板式換熱器連續(xù)滅菌流程 滅菌時間的計算 (Ct/C0)=kt t=2.303/klg(C0/Ct) 式中：C0、Ct分別為單位體積培養(yǎng)基滅菌前、后 的含菌數(shù)。,例2某發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，采用連續(xù)滅菌，滅菌溫度為1310C，原污染程度為每1ml含有2105個雜菌，已知1310C時滅菌速度常數(shù)為15min-1，求滅菌所需的維持時間。,連續(xù)滅菌時間的估算,解：C0=2105(個/ml) Ct=0.001/(40106)=2.510-11(個/ml) t=2.303/klg(C0/Ct)=2.303/15lg(2105)/(2.510-11) =2.37 min,噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程,分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較,連續(xù)滅菌的優(yōu)點：（適用于大型罐） 可采用高溫短時滅菌，營養(yǎng)成分破壞少，有利于提高發(fā)酵產(chǎn)率； 發(fā)酵罐利用率高； 蒸汽負(fù)荷均衡； 采用板式換熱器時，可節(jié)約大量能量； 適宜采用自動控制，勞動強(qiáng)度??； 可實現(xiàn)將耐熱性物料和不耐熱性物料在不同溫度下分開滅菌，減少營養(yǎng)成分的破壞。,缺點： 對小型罐無優(yōu)勢，不方便，對設(shè)備要求高； 蒸汽波動時滅菌不徹底； 當(dāng)培養(yǎng)基中含有固體顆?；蛴休^多泡沫時，以分批滅菌好，防止滅菌不徹底。,分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較,五、空氣除菌,（一）概述 （二）空氣過濾除菌流程 （三）空氣預(yù)處理 （四）空氣預(yù)處理流程設(shè)計應(yīng)用舉例 （五）空氣過濾介質(zhì) （六）空氣過濾除菌原理 （七）提高過濾除菌效率的措施,（一）概述,空氣除菌的必要性 以一個50m3的發(fā)酵罐為例，若裝料系數(shù)為0.7，要求每立方米發(fā)酵液每分鐘通氣0.8m3，培養(yǎng)周期170h，那么每個周期需通氣量2.86105 m3(500.7 0.8 170 60)，而每立方米大氣中約有103-104個微生物。,空氣除菌方法 輻射殺菌：超聲波、高能陰極射線，x射線、射線、射線、紫外線(2265 3287 ) 加熱殺菌：加熱方法可用蒸汽、電和空氣壓縮機(jī)產(chǎn)生的熱量 靜電除菌 ：常用于潔凈工作臺、潔凈工作室所需無菌無塵空氣的第一次除塵，配合高效過濾器使用。 過濾除菌：采用定期滅菌的介質(zhì)來阻截流過的空氣所含的微生物而取得無菌空氣。常用的過濾介質(zhì)有棉花、活性炭、玻璃纖維、有機(jī)合成纖維、有機(jī)和無機(jī)燒結(jié)材料等等。,（一）概述,1. 對空氣過濾除菌流程的要求,流程主要設(shè)備：空氣壓縮機(jī) 、空氣過濾器 附屬設(shè)備：粗過濾器、氣液分離器、空氣貯罐、空氣冷卻器,流程的制定應(yīng)根據(jù)所在地的地理、氣候環(huán)境和設(shè)備條件綜合考慮 環(huán)境污染比較嚴(yán)重的地方，要考慮改變吸風(fēng)的條件； 在溫暖潮濕的南方，要加強(qiáng)除水設(shè)施 ； 壓縮機(jī)耗油嚴(yán)重的設(shè)備流程中則要加強(qiáng)消除油霧的污染 ，也可采用無油潤滑的往復(fù)式壓縮機(jī)； 往復(fù)式壓縮機(jī)，要配備前置粗過濾器及空氣貯罐。 通常要求壓縮空氣的相對濕度=50%60%時通過過濾器為好。,1. 對空氣過濾除菌流程的要求,2. 空氣除菌流程的分析,空氣除菌系統(tǒng)包括：冷卻、分離油水、加熱、 過濾 幾種典型的設(shè)備流程 兩級冷卻、加熱除菌流程 冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程 高效前置過濾空氣除菌流程 將空氣冷卻至露點以上的流程 利用熱空氣加熱冷空氣流程 一次冷卻和析水的空氣過濾流程,（三）空氣預(yù)處理,1. 原理： 除塵(外源空氣的前處理)：防塞，提高過濾效率和濾器壽命； 降溫：防燒傷介質(zhì)及水分蒸發(fā)嚴(yán)重，對發(fā)酵不利 除油、除水：防塞（因油膜堵），防止過濾器長菌堵塞（因水滴） 加熱：保持相對濕度 穩(wěn)壓：防止壓力波動，貯罐 2. 預(yù)處理流程設(shè)計的簡繁關(guān)鍵：去濕問題,措施：建吸風(fēng)塔、粗過濾器（布袋過濾器、,填料過濾器、油浴洗滌和水霧除塵裝置等）、高效前置過濾器,兩級冷卻、加熱除菌流程圖 1-粗過濾器；2-空壓機(jī)；3-貯罐；4，6-冷卻器；5-旋風(fēng)分離器；7-絲網(wǎng)分離器； 8-加熱器；9-過濾器,冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程圖 1-粗過濾器；2-壓縮機(jī)；3-貯罐；4-冷卻器；5-絲網(wǎng)分離器；6-過濾器,利用熱空氣加熱冷空氣的流程示意圖 1-高空采風(fēng)；2-粗過濾器；3-壓縮機(jī)；4-熱交換器；5-冷卻器；6，7-析水器；8-空氣總過濾器；9-空氣分過濾器,將空氣冷卻至露點以上的流程 1高空采風(fēng)；2粗過濾器；3壓縮機(jī)；4冷卻器；5冷卻器；6空氣總過濾器；7空氣分過濾器,高效前置過濾空氣除菌流程圖 1高效前置過濾器；2壓縮機(jī)；3貯罐；4冷卻器；5絲網(wǎng)分離器；6加熱器；7過濾器,一次冷卻和析水的空氣過濾流程示意圖 1高空采風(fēng)；2粗過濾器；3壓縮機(jī)；4冷卻器；5，6析水器；7貯罐；8加熱器；9空氣總過濾器；10空氣分過濾器,空氣壓縮和壓縮空氣的冷卻,空氣的壓縮過程可看作絕熱過程，故壓縮后的空氣溫度與被壓縮的程度有關(guān)： T2=T1(P2/P1)(k-1)/k 式中 T1,T2壓縮前后空氣的絕對溫度，K P1,P2 壓縮前后空氣的絕對壓強(qiáng)，Pa k絕熱指數(shù)，空氣為1.4 若壓縮為多變過程，則可用多變指數(shù)m（對于 空氣m=1.2-1.3）代替絕熱指數(shù)k。,例3：20oC的大氣被壓縮至表壓 2.5kg/cm2時溫度是多少？ 解：T1=20+273=293k P2/P1=（2.5+1.033）/1.033=3.42 m=1.3 T2=T1(P2/P1)(m-1)/m=2933.420.3/1.3=389k t2=389-273=116oC,空氣預(yù)處理流程設(shè)計,3. 幾個概念,空氣的絕對濕度：1m3 濕空氣中含有的水蒸氣絕對量(kg) 空氣的相對濕度（）：空氣的絕對濕度與同溫度下飽 和絕對濕度之比值或者空氣中水蒸汽分壓與同溫度時的 飽和水蒸汽壓之比值，稱為空氣的相對濕度。 =Pw/Ps 式中 Pw空氣中水蒸氣分壓， Pa Ps同溫度下水的飽和蒸氣壓，Pa， 它可由各類手 冊中查到。 空氣的濕含量（X）：1kg干空氣中含有的水汽量 （kg/kg干空氣）,空氣的濕含量（X）,設(shè)Gg kg干空氣中含Gw kg水蒸汽時，則 X=Gw/Gg 又Pw/Pg=nw/ng=(Gw/Mw)/(Gg/Mg) =(Gw/Gg)(Mg/Mw) （Mw，Mg分別為水和空氣的分子量） X=Gw/Gg=(PwMw)/(PgMg)=(18/28.94)(Pw/Pg) =0.622Pw/(P-Pw) （4-1）,（1）與X的關(guān)系,將Ps=Pw代入式4-1中得 X=0.622Ps/（P-Ps） 所以，已知某一溫度T時值，便可求得X。 當(dāng)X一定時，T1T2，導(dǎo)致12 ，則 X1=0.6221Ps1/(P1-1Ps1) X2=0.6222Ps2/(P2-2Ps2) X1=X2 2=1(PS1/PS2)(P2/P1) （式4-2）,當(dāng)X發(fā)生變化，即有水析出時，X降低，此時2=100%， 定義：當(dāng)=1時，空氣中水蒸氣已飽和，此時溫度稱為露點Td。 當(dāng)TTd時，有水析出，X 。 當(dāng)X=0時，壓縮過程中，隨著T，Ps，P，； 降溫過程中，隨著T ，Ps ，P一定， 。,（1）與X的關(guān)系,思考題,壓縮空氣的露點比原始空氣的露點更高，即更易析出水分，且壓縮比愈大，露點愈高，為什么？,思考題答案： 由 可知當(dāng) 1時，求出 Ps2 對應(yīng) Td Ps2 愈高， Td 愈高 而 壓縮空氣的露點 比原始空氣 高( P2P1) 壓縮比 愈大，露點愈高,加熱后空氣的溫度,設(shè)析出水后，在升溫階段X=0，根據(jù)式4-2可以求出析水后應(yīng)升溫到多少度才能滿足相對濕度保持50-60%。 后= dPsd/Ps后 Ps后= dPsd/ 后 Ps后T后,例4：溫度20、=85%的空氣，當(dāng)壓縮至2.0kg/cm2時，溫度為120，求此時空氣相對濕度是多少？若在壓力不變的情況下將溫度冷卻至40后，相對濕度又是多少？ 已知：20時，Ps1=0.0238 kg/cm2,120時，Ps2=2.025 kg/cm2 ，40時，Ps3=0.0752