GB5413.10-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中維生素K1的測(cè)定.pdf

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.102010中 華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實(shí)施食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素 K1的測(cè)定 National food safety standard Determination of vitamin K1 in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.102010 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)等同采用國(guó)際分析家學(xué)會(huì)（AOAC）AOAC 999.15 Vitamin K in Milk and Infant Formulas Liquid Chromatographic Method。 本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 5413.10-1997嬰幼兒配方食品和乳粉 維生素K1的測(cè)定。 本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 5413.10-1997相比，主要變化如下： 標(biāo)準(zhǔn)名稱改為嬰幼兒食品和乳品中維生素K1的測(cè)定； 試樣處理改為試樣經(jīng)酶水解后，用NaOH皂化，用正己烷萃??； 測(cè)定改為用高效液相色譜柱后還原熒光法定量測(cè)定維生素 K1； 儀器中將“高壓液相色譜儀帶紫外檢測(cè)器”修改為“高效液相色譜儀，帶熒光檢測(cè)器”。 本標(biāo)準(zhǔn)附錄 A、附錄 B 和附錄 C 均為資料性附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為： GB 5413-1985、GB/T 5413.10-1997。 GB 5413.102010 1 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素 K1的測(cè)定 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中維生素 K1的測(cè)定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒食品和乳品中維生素 K1的測(cè)定。 2 規(guī)范性引用文件 本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 3 原理 用脂肪酶降解試樣中的脂肪和不飽和脂肪酸， 對(duì)于含淀粉試樣需先用淀粉酶降解試樣中的淀粉， 經(jīng)堿皂化后，用正己烷提取維生素 K1。通過(guò)液相色譜法分離，柱后還原維生素 K1，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。 4.1 氫氧化鈉溶液（10 mol/L）：臨用前配制。 4.2 95 %乙醇。 4.3 飽和氯化鈉溶液。 4.4 正己烷：色譜純。 4.5 無(wú)水硫酸鈉。 4.6 甲醇：色譜純。 4.7 二氯甲烷：色譜純。 4.8 冰醋酸。 4.9 氯化鋅。 4.10 無(wú)水乙酸鈉。 4.11 流動(dòng)相：甲醇（4.6）900 mL，二氯甲烷（4.7）100 mL，冰醋酸（4.8）0.3 mL，氯化鋅（4.9）1.5 g，無(wú)水乙酸鈉（4.10）0.5 g，溶解后用 0.45 m 濾膜過(guò)濾。 4.12 淀粉酶：酶活力1.5 U/mg。 GB 5413.102010 2 4.13 脂肪酶：酶活力700 U/mg。 4.14 鋅粉：粒度 50 m70 m。 4.15 維生素 K1標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度校正方法參見(jiàn)附錄 A。 4.15.1 維生素 K1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（2 mg/mL）：稱取 0.05 g 維生素 K1標(biāo)準(zhǔn)品（精確到 0.1 mg），于 25 mL容量瓶中，用正己烷溶解定容。 4.15.2 維生素 K1標(biāo)準(zhǔn)中間液（20 g/mL）：取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（4.15.1）1 mL 加正己烷定容至 100 mL。 5 儀器和設(shè)備 5.1 高效液相色譜儀，帶有熒光檢測(cè)器。 5.2 天平：感量為 0.1 mg。 5.3 分液漏斗：250 mL。 5.4 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。 5.5 恒溫空氣浴振蕩器。 5.6 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速3000 轉(zhuǎn)/分鐘。 5.7 氮吹儀。 6 分析步驟 6.1 試樣處理 6.1.1 含淀粉的試樣 稱取混合均勻的固體試樣約 2.5 g 或液體試樣約 10 g（精確到 0.1 mg）于三角瓶中，加入 0.5 g 淀粉酶（4.12），用 30 mL 溫水溶解。 6.1.2 不含淀粉的試樣 稱取混合均勻的固體試樣約2.5 g或液體試樣約10 g（精確到0.1 mg）于三角瓶中，用30 mL溫水溶解。 6.2 測(cè)定液的制備 向上述處理過(guò)的試樣溶液中加入 1 g 脂肪酶（4.13），于 37 5 恒溫空氣浴振蕩器中振蕩過(guò)夜，使其充分酶解。取出酶解好的試樣，加入 2 mL 氫氧化鈉溶液（4.1），用 50 mL 乙醇（4.2）將溶液轉(zhuǎn)入 250 mL 的分液漏斗中， 充分混勻 （必要時(shí)加少量飽和氯化鈉溶液 （4.3） ） 。 加入 50 mL 正己烷 （4.4） 。充分振搖 2 min，靜置分層。放出下層水相于另一個(gè) 250 mL 分液漏斗中，留下有機(jī)相。 向水相中再次加入 50 mL 正己烷再次萃取。 合并有機(jī)相。 用適量蒸餾水洗有機(jī)相兩次。 將有機(jī)相通過(guò)無(wú)水硫酸鈉 （4.5）脫水過(guò)濾到一個(gè) 500 mL 的燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上于 40 2 下蒸發(fā)至近干。用正己烷（4.4）轉(zhuǎn)移殘留物到一個(gè) 10 mL 試管中，置氮吹儀上于 40 2 下吹干，準(zhǔn)確加入 1 mL 正己烷（4.4），充分振蕩溶解殘留物。將試管放入冰箱中在 0 以下冷凍 1 h 備用。 6.3 測(cè)定 6.3.1 色譜參考條件 GB 5413.102010 3 色譜柱：C18色譜柱，150 mm 4.6 mm，5 m，或具同等性能的色譜柱； 鋅還原柱： 4.6 mm 50 mm（參見(jiàn)附錄 B） ； 檢測(cè)波長(zhǎng)： 激發(fā)波長(zhǎng)為 243 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 430 nm； 流動(dòng)相：甲醇（4.6）900 mL，二氯甲烷（4.7）100 mL，冰醋酸（4.8）0.3 mL，氯化鋅（4.9）1.5 g，無(wú)水乙酸鈉（4.10）0.5 g，溶解后用 0.45 m 濾膜過(guò)濾； 流速：1 mL/min； 進(jìn)樣量：10 L。 6.3.2 維生素 K1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液（4.15.2）0.0 mL，0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，2.5 mL加正己烷定容至25 mL，此標(biāo)準(zhǔn)系列工作液維生素K1濃度分別為0.00 g/mL，0.40 g/mL，0.80 g/mL，1.20 g/mL，1.60 g/mL，2.00 g/mL。 將系列標(biāo)準(zhǔn)維生素K1工作液分別注入高效液相色譜儀中，測(cè)定相應(yīng)的峰面積或峰高，以峰面積或峰高為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 6.3.3 測(cè)定液的測(cè)定 將制備好的測(cè)定液（6.2）在暗處放至室溫，于離心機(jī)中在 3000 轉(zhuǎn)/分鐘下離心 5 min，吸取上清液注入高效液相色譜儀中，測(cè)定相應(yīng)的峰面積或峰高（標(biāo)準(zhǔn)色譜圖參見(jiàn)附錄 C） 。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得試樣溶液中維生素 K1的濃度或通過(guò)回歸方程計(jì)算出試樣溶液中維生素 K1的濃度（g/mL） 。 7 分析結(jié)果的表述 試樣中維生素 K1的含量按式（1）計(jì)算： 100=iiimnVCX（1） 式中： X維生素 K1的含量，單位為微克每百克（g/100 g） ； Ci試樣溶液的濃度，單位為微克每毫升（g/mL） ； Vi試樣溶液的體積，單位為毫升（mL） ； mi試樣的質(zhì)量，單位為克（g）； n 樣液稀釋倍數(shù)。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后一位。 8 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10 %。 9 其他 9.1 由于維生素 K1遇光易分解，整個(gè)操作應(yīng)避光。 9.2 本標(biāo)準(zhǔn)檢出限為 1 g/100 g。 GB 5413.102010 4 附錄 A （資料性附錄） 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度校正方法 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制后需要對(duì)所配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正，具體操作如下： 維生素K1標(biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)定：取維生素K1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按給定波長(zhǎng)測(cè)定各維生素的吸光值，用比吸光系數(shù)計(jì)算出該維生素K1的濃度。測(cè)定條件見(jiàn)表A.1。 表A.1 維生素K1吸光值的測(cè)定條件 標(biāo)準(zhǔn) 比吸光系數(shù) %1cmE 波長(zhǎng) （nm） 維生素K1 422 248 濃度按式(2)計(jì)算： C1=1001EA(2) 式中： C1維生素K1濃度，單位為克每毫升（g/mL）； A維生素K1的平均紫外吸光值； E維生素K1 1 %比色光系數(shù)。 GB 5413.102010 5 附錄 B （資料性附錄） 鋅還原柱填裝方法 將鋅粉（4.14）密集裝入還原柱（4.6 mm 50 mm，不銹鋼材質(zhì)）中。裝柱時(shí)，應(yīng)連續(xù)少量多次將鋅粉裝入柱中，邊裝邊輕輕拍打，以使裝入的鋅粉緊密。 GB 5413.102010 6 附錄 C