GB5413.16-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測(cè)定.pdf

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.162010中 華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實(shí)施食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測(cè)定 National food safety standard Determination of folic acid (folate activity) in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.162010 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB/T 5413.16-1997嬰幼兒配方食品和乳粉 葉酸（葉酸鹽活性）測(cè)定 。 本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 5413.16-1997相比，主要變化如下： 對(duì)磷酸鹽緩沖液作了調(diào)整； 增加了米粉的處理方法； 增加了光密度法測(cè)定步驟。 本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為： GB 5413-1985、GB/T 5413.16-1997。 GB 5413.162010 1 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測(cè)定 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測(cè)定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測(cè)定。 2 規(guī)范性引用文件 本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 3 原理 利用干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）ATCC 7469 對(duì)葉酸的特異性，在含有葉酸的樣品中生長(zhǎng)產(chǎn)生的酸度和形成的光密度來(lái)測(cè)定葉酸的含量。 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的二級(jí)水。 4.1 雞胰腺： 稱取 100 mg 干燥的雞胰腺， 加 20 mL 蒸餾水， 攪拌 15 min， 離心 10 min （3000 轉(zhuǎn)/分鐘） ，取上清液，臨用前配制。 4.2 0.9 %生理鹽水：稱取 9.0 g 氯化鈉溶解于 1000 mL 水中，分裝于具塞試管中，每管 10 mL，121滅菌 15 min。每周準(zhǔn)備一次。 4.3 磷酸鹽緩沖液 4.3.1 磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L）：稱取 5.85 g 磷酸二氫鉀，1.22 g 磷酸氫二鉀，用 1000 mL 水溶解。臨用前按 0.5 g/100 mL 加入抗壞血酸。 4.3.2 磷酸鹽緩沖液（用于谷物及谷物制品前處理）：稱取 14.2 g 磷酸氫二鈉，用 1000 mL 水溶解。臨用前按 1.0 g/100 mL 加入抗壞血酸，用氫氧化鈉溶液 A（4.16）調(diào) pH 至 7.80.1。 4.3.3 磷酸鹽緩沖液 III（用于谷物及谷物制品測(cè)試）：稱取 14.2 g 磷酸氫二鈉，用 1000 mL 水溶解。臨用前按 1.0 g/100 mL 加入抗壞血酸，用氫氧化鈉溶液 A（4.16）調(diào) pH 至 6.80.1。 4.3.4 磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L）（用于谷物及谷物制品標(biāo)準(zhǔn)溶液制備）：溶解 13.61 g 磷酸二氫鉀于水中稀釋到 1000 mL。用氫氧化鉀溶液（4.10）調(diào) pH 至 7.00.1。 4.4 葉酸標(biāo)準(zhǔn)品。 4.5 氨水（10.8 %）。 4.6 甲苯（C7H8）。 4.7 抗壞血酸（C6H8O6）。 4.8 菌株：干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）ATCC 7469。 GB 5413.162010 2 4.9 培養(yǎng)基 4.9.1 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：胨化乳 15 g，酵母浸膏 5 g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀2 g， 聚山梨糖單油酸酯 1 g， 瓊脂 10 g， 加蒸餾水至 1000 mL， 調(diào) pH 至 6.8 0.2 （20 25 ） 。 121高壓滅菌 15min，備用。 4.9.2 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基：胨化乳 15 g，酵母浸膏 5 g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀2 g，聚山梨糖單油酸酯 1 g，加蒸餾水至 1000 mL，調(diào) pH 至 6.8 0.2（20 25 ）。121高壓滅菌 15min，備用。 4.9.3 葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基：酪蛋白胨 10 g，葡萄糖 40 g，乙酸鈉 40 g，磷酸氫二鉀 1 g，磷酸二氫鉀 1 g，DL-色氨酸 0.2 g，L-天門冬氨酸 0.6 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.5 g，硫酸腺嘌呤 10 mg，鹽酸鳥(niǎo)嘌呤 10 mg，尿嘧啶 10 mg，黃嘌呤 20 mg，聚山梨糖 0.1 g，谷光甘肽 5 mg，硫酸鎂 0.4 g，氯化鈉 20 mg，硫酸亞鐵 20 mg，硫酸錳 15 mg，核黃素 1 mg，p-氨基苯甲酸 2 mg，維生素 B6 4mg，鹽酸硫胺素 400 g，泛酸鈣 800 g，煙酸 800 g，生物素 20 g，加蒸餾水至 1000 mL，調(diào) pH 至 6.7 0.1（20 25 ）。 注：市售商業(yè)化合成培養(yǎng)基效果更穩(wěn)定。 4.10 氫氧化鉀溶液（4 mol/L）：稱取 224 g 氫氧化鉀于 1000 mL 燒杯中，用 400 mL 水溶解，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至 1000 mL 容量瓶中，用水定容。 4.11 木瓜蛋白酶溶液：1 g 蛋白酶（活力6000 U/mg，pH 6.0 0.1，40 ）溶于 100 mL 磷酸鹽緩沖液（4.3.1）中。臨用前配制。 4.12 -淀粉酶溶液：1 g -淀粉酶（1.5 U/mg）溶于 100 mL 磷酸鹽緩沖液（4.3.1）中。臨用前配制。 4.13 0.22 m 滅菌濾膜。 4.14 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 4.14.1 葉酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液（500 g/mL）：稱取 55 mg56 mg（精確至 0.1 mg）葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（4.4），用50 mL 蒸餾水轉(zhuǎn)入 100 mL 容量瓶中，加 2 mL 氨水（4.5）。溶液制備后，按式（1）計(jì)算溶液的體積，要求貯備液中葉酸鹽的濃度為 500 g/mL： 貯備液體積（mL）=5001001000cm 或簡(jiǎn)化為： 貯備液體積（mL）=50cm (1) 式中： m葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，單位為毫克（mg） ； c葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度，單位為克每百克（g/100 g） 。 用水稀釋溶液至刻度，用吸管加水至計(jì)算要求的體積，充分混合，放入棕色試劑瓶中 2 4 冰箱冷藏，保存期為 4 個(gè)月。 4.14.2 葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液（50 g/mL）：吸取 10 mL 葉酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液（4.14.1）于 100 mL 棕色容量瓶中，用水定容至刻度，充分混勻，2 4 冰箱冷藏，保存期為 1 個(gè)月。 4.14.3 葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.05 ng/mL，0.1 ng/mL）：吸取 1 mL 葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液（4.14.2）于 100 mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，混合。再吸該液 1 mL 于 100 mL 棕色容量瓶中，定容，混合。 從上液中分別吸取 5 mL 于 250 mL 和 500 mL 棕色容量瓶中， 用磷酸鹽緩沖液 （4.3.1） 定容到刻度， 混勻，即為高濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.1 ng/mL）和低濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.05 ng/mL）。臨用前配制。 4.15 鹽酸（1 mol/L）：量取 83.0 mL 鹽酸溶于水中，冷卻后定容至 1000 mL。 GB 5413.162010 3 4.16 氫氧化鈉溶液 A（4 mol/L）：稱取 160 g 氫氧化鈉于 1000 mL 燒杯中，用 400 mL 水溶解，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至 1000 mL 容量瓶中，用水定容。 4.17 氫氧化鈉溶液 B（0.1 mol/L）：吸取 2.5 mL 氫氧化鈉溶液 A（4.16）轉(zhuǎn)移至 100 mL 容量瓶中用水定容。 4.18 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.1 mol/L 0.0002 mol/L）：稱取 4 g（精確至 0.0001 g）氫氧化鈉用水稀釋至 1000 mL，用鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定。保存此溶液的容器要密封，以防二氧化碳滲入。 4.18.1 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定：稱取約 0.18 g（精確至 0.0001 g）于 105 110 烘至恒重的鄰苯二甲酸氫鉀，用 50 mL 除二氧化碳的水溶于錐形瓶中，加兩滴 5 g/L 的酚酞指示劑，用配好的氫氧化鈉溶液滴定至粉紅色，同時(shí)作空白實(shí)驗(yàn)。按式（2）計(jì)算氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度： c=2042. 0)(m21VV(2) 式中： c氫氧化鈉的濃度，單位為摩爾每升（mol/L） ； m稱取的鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量，單位為克（g） ； V1氫氧化鈉溶液的用量，單位為毫升（mL） ； V2空白試驗(yàn)氫氧化鈉溶液的用量，單位為毫升（mL） 。 4.18.2 酚酞溶液：取 0.5 g 酚酞溶于 75 mL 體積分?jǐn)?shù)為 95 %的乙醇中，加入 20 mL 水，再加入氫氧化鈉溶液（4.18），直至加入一滴立即變成粉紅色，再用水定容至 100 mL。 4.19 溴麝香草酚藍(lán)指示劑：稱取 0.1 g 溴麝香草酚藍(lán)于研缽中，加入 1.6 mL 氫氧化鈉溶液 B（4.17）研磨，加少許水至完全溶解，轉(zhuǎn)移至 250 mL 容量瓶中用水定容。 5 儀器和設(shè)備 5.1 pH 計(jì)：精度為 0.01。 5.2 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速2000 轉(zhuǎn)/分鐘。 5.3 分光光度儀。 5.4 天平：感量為 0.1 mg。 5.5 生化培養(yǎng)箱：36 1 5.6 滴定管：分刻度值為 0.1 mL。 5.7 渦旋振蕩器。 6 分析步驟 6.1 測(cè)試菌液的制備 6.1.1 干酪乳桿菌 （Lactobacillus casei） ATCC 7469 凍干菌粉轉(zhuǎn)入乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基 （4.9.2） 中， 36 1 培養(yǎng) 24 h 后，轉(zhuǎn)接至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（4.9.1）試管中，再 36 1 培養(yǎng) 24 h。培養(yǎng)好的乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（4.9.1）試管的培養(yǎng)物作為貯備菌種。 GB 5413.162010 4 6.1.2 從貯備菌種培養(yǎng)基上分別轉(zhuǎn)接到三個(gè)乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 （4.9.1） 試管中， 放入培養(yǎng)箱中 36 1 培養(yǎng) 24 h。每月轉(zhuǎn)接一次，作為月接種管貯于冰箱中。每月定期從月接種管中重新接種 3 個(gè)轉(zhuǎn)接管保存新菌株。 6.1.3 從月接種的培養(yǎng)管中的一支再接種一支乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 （4.9.1） 試管， 36 1 培養(yǎng) 24 h，作為日接種管每日測(cè)定用。 6.1.4 從日接種管中接種一管乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（4.9.2），36 1 培養(yǎng) 24 h。在無(wú)菌條件下離心該培養(yǎng)液 10 min （2000 轉(zhuǎn)/分鐘） ， 棄去上清液。 用 10 mL 生理鹽水 （4.2） 振蕩洗滌菌體， 離心 10 min（2000 轉(zhuǎn)/分鐘），棄去上清液，用 10 mL 生理鹽水（4.2）振蕩清洗。如前離心操作，棄去上清液。再加 10 mL 生理鹽水（4.2），混勻。吸 1 mL 該菌懸液于 10 mL 生理鹽水（4.2）中，混勻制成測(cè)試菌液。 6.1.5 以生理鹽水（4.2）做對(duì)照，用分光光度計(jì)，于 550 nm 波長(zhǎng)下，測(cè)測(cè)試菌液（6.1.4）的光密度值，此值應(yīng)在 60 %80 %之間。 6.2 試樣的制備 6.2.1 乳制品 稱取 2 g（精確至 0.0001 g）試樣（約含葉酸 5 g）于 100 mL 燒杯中，用 25 mL30 mL 水復(fù)原樣品，轉(zhuǎn)入 100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，溶液中葉酸的質(zhì)量濃度大約為 0.05 g/mL。吸取 1 mL該樣液和 1 mL 雞胰腺（4.1）于一個(gè) 180 mm15 mm 的帶螺旋蓋的試管中，充分混合。加 18 mL 含抗壞血酸的磷酸緩沖液（4.3.1） ，再加 1 mL 甲苯（4.6） 。同時(shí)制備空白對(duì)照管，吸 1 mL 蒸餾水和 1 mL雞胰腺（4.1）于空白管中，加 18 mL 含抗壞血酸的磷酸緩沖液（4.3.1）及 1 mL 甲苯（4.6） 。在 37 下，樣品管和空白管保溫 16 h 后，于 100 水浴加熱 5 min。用磷酸鹽緩沖液（4.3.1）作適當(dāng)稀釋，得到濃度約為 0.1 ng/mL 的葉酸鹽溶液。 若確定樣品中強(qiáng)化葉酸與原生葉酸相比所占比例很大， 則可以用 1 mL 樣液加 19 mL 含抗壞血酸的磷酸緩沖液（4.3.1）于 100 水浴加熱 5 min，再用磷酸鹽緩沖液（4.3.1）稀釋，得到濃度約為 0.1 ng/mL 的葉酸鹽溶液。 6.2.2 谷物及谷物制品 稱取大約含 1 g 葉酸的試樣于 150 mL 三角燒瓶中。加 20 mL pH 7.8 磷酸緩沖溶液（4.3.2） ，混勻后加 50 mL 水和 1.0 mL 甲苯（4.6） 。加蓋后 121 15 min 滅菌，然后迅速冷卻。加 1 mL 木瓜蛋白酶溶液（4.11） ，于 36 1 保溫 3h 后 100 加熱 3 min，冷卻。加 1 mL -淀粉酶溶液（4.12） ，36 1 保溫 2 h 后加 4 mL 雞胰腺 （4.1） ， 加蓋， 36 1保溫 16 h 后 100 加熱 3 min， 冷卻。 用 1 mol/L鹽酸（4.15）調(diào) pH 至 4.5，用水稀釋定容到 100 mL。過(guò)濾得到澄清濾液，然后吸取 1 mL 澄清濾液用磷酸鹽緩沖液 III（4.3.3）定容至 100 mL，得到濃度約為 0.1 ng/mL 的葉酸鹽溶液。 若確定樣品中強(qiáng)化葉酸與原生葉酸相比所占比例很大則可以直接在樣品中加 20 mL 0.05 mol/L 含抗壞血酸的磷酸緩沖液（4.3.2）和 50 mL 水，于 121 滅菌 15 min，然后吸取 1mL 澄清濾液，再用0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液 III（4.3.3）稀釋，得到濃度約為 0.1 ng/mL 的葉酸鹽溶液。 6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制作 按表 1 順序加入蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)工作液（4.14.3） （測(cè)定谷物及谷物制品的標(biāo)準(zhǔn)溶液用磷酸鹽緩沖液（4.3.4）代替磷酸鹽緩沖液（4.3.1） ）和葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基（4.9.3）于培養(yǎng)管中。表 1 中每一編號(hào)需制作 3 管。試管 S2 至 S10 中，相當(dāng)葉酸含量為 0.00 ng、0.05 ng、0.10 ng、0.15 ng 、0.20 ng、0.25 ng、0.30 ng、0.40 ng、0.50 ng。 GB 5413.162010 5 表 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制作 試管號(hào) S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 蒸餾水（mL） 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 標(biāo)準(zhǔn)溶液（mL） 0 0 1 2 3 4 5 3 4 5 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 注 1：試管 S3S7 中加低濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液。 注 2：試管 S8S10 中加高濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液。 6.4 試樣管的制作 按表 2 順序加入蒸餾水、試樣和葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基于試管中，表中每一編號(hào)需制作 3 管。 表 2 試樣管的制作 試管號(hào) 1 2 3 4 蒸餾水（mL） 4 3 2 1 樣 品（mL） 1 2 3 4 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 6.5 滅菌 將標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管 121 滅菌 5 min，迅速冷卻到室溫（商品化培養(yǎng)基按標(biāo)簽說(shuō)明進(jìn)行滅菌)。 注：保證加熱和冷卻過(guò)程中條件均勻，滅菌管數(shù)過(guò)多或距離太近，在滅菌鍋中都可產(chǎn)生不良影響。 6.6 接種 無(wú)菌條件下每管中均加入一滴（約 50 L）菌懸液（6.1.4） ，加蓋，充分振蕩混勻所有試管（標(biāo)準(zhǔn)曲線未接種空白管 S1 除外） 。 6.7 培養(yǎng) 6.7.1 酸度法：36 1 培養(yǎng) 72 h。對(duì)每支試管進(jìn)行目測(cè)檢查，未接種管內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管中培養(yǎng)液的濁度應(yīng)有梯度。未接種管中若出現(xiàn)混濁，則測(cè)定無(wú)效。 6.7.2 光密度法：在 36 1 ，培養(yǎng) 16 h24 h。其他同 6.7.1。 6.8 測(cè)定 6.8.1 酸度法 6.8.1.1 用 10 mL 水將未接種空白管 S1 和接種空白管 S2 的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至三角燒瓶中， 以溴麝香草酚藍(lán)（4.19）作指示劑，或用 pH 計(jì)以 pH 6.8 0.2 為滴定終點(diǎn)用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（4.18）滴定標(biāo)準(zhǔn)曲線未接種空白管 S 1 和接種空白管 S 2。記錄下消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積。 注： 如果接種空白滴定反應(yīng)消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積數(shù)等于或高于未接種空白水平的 1.5 mL， 則測(cè)定結(jié)果無(wú)效。 6.8.1.2 用 10 mL 水將標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至三角燒瓶中，以溴麝香草酚藍(lán)（4.19）作指示劑，或用 pH 計(jì)以 pH 6.8 0.2 為滴定終點(diǎn)用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（4.18.1）滴定標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管的培養(yǎng)物。記錄下消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積。 注：通常標(biāo)準(zhǔn)曲線管 S7 消耗的 0.1 mol/L 的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)