GB5009.261-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)貝類中神經(jīng)性貝類毒素的測(cè)定.pdf

中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B5 0 0 9.2 6 12 0 1 6食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)貝類中神經(jīng)性貝類毒素的測(cè)定2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)國(guó) 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B5 0 0 9.2 6 12 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替S N/T1 5 7 32 0 1 3 出口貝類中神經(jīng)性貝類毒素檢驗(yàn)方法 小鼠生物法 。本標(biāo)準(zhǔn)與S N/T1 5 7 32 0 1 3相比, 主要變化如下: 標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“ 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 貝類中神經(jīng)性貝類毒素的測(cè)定” 。G B5 0 0 9.2 6 12 0 1 61 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)貝類中神經(jīng)性貝類毒素的測(cè)定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了貝類中神經(jīng)性貝類毒素(N S P) 檢測(cè)的小鼠生物測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于貝類及制品中神經(jīng)性貝類毒素(N S P) 的檢測(cè)。2 原理用乙醚提取貝類中神經(jīng)性貝類毒素, 提取物經(jīng)減壓蒸干后, 再以1%吐溫- 6 0生理鹽水為分散介質(zhì),制備N S P - 1%吐溫- 6 0生理鹽水混懸液, 將該混懸液注射入腹腔, 觀察小鼠存活情況, 計(jì)算其毒力。3 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級(jí)水。3.1 試劑3.1.1 鹽酸(HC l) 。3.1.2 無水乙醚(C4H1 0O) 。3.1.3 吐溫- 6 0(C6 4H1 2 6O2 6) 。3.1.4 氯化鈉(N a C l) 。3.1.5 次氯酸鈉(N a C l O) 。3.2 試劑配制3.2.1 氯化鈉溶液(0.8 5%) : 稱取0.8 5gN a C l, 加水溶解并定容至1 0 0m L。3.2.2 1%吐溫- 6 0: 稱取1.0g吐溫- 6 0, 用0.8 5%氯化鈉溶液溶解并定容至1 0 0m L。3.2.3 次氯酸鈉溶液(5%) : 稱取次氯酸鈉5 0g, 用水溶解, 并稀釋至10 0 0m L。3.3 標(biāo)準(zhǔn)品短裸甲藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品(b r e v e t o x i n - 2) , 純度9 0%。3.4 材料小白鼠: 體重為1 9g 2 1g的健康I C R品系雄性小鼠。4 儀器和設(shè)備4.1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。4.2 均質(zhì)器。G B5 0 0 9.2 6 12 0 1 62 4.3 天平: 感量為0.1g。4.4 分液漏斗。4.5 圓底燒瓶。4.6 布氏漏斗。4.7 一次性注射器:1m L。4.8 離心機(jī): 轉(zhuǎn)速60 0 0r/m i n。4.9 金屬篩網(wǎng): 孔徑約2mm。5 分析步驟注:橡膠手套、 玻璃制品等用過的器材, 以及廢棄的提取液應(yīng)在次氯酸鈉溶液(5%) 中浸泡1h以上, 以使毒素分解。5.1 試樣制備5.1.1 樣品采集每個(gè)分析樣品至少要取1 0個(gè)以上貝類, 并使貝肉達(dá)2 0 0g以上。冷凍樣品置于保溫盒中冷凍送檢, 或保證其處于低溫狀態(tài)(0 1 0 ) 送檢。如為帶殼樣品, 應(yīng)開殼去除水分后冷凍送檢。5.1.2 試樣制備5.1.2.1 生鮮帶殼樣品用清水將貝殼外表徹底洗凈, 切斷閉殼肌, 開殼, 用水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他外來物。將閉殼肌和連接在膠合部的組織分開, 取出貝肉, 切勿割破肉體。開殼前不要加熱或用麻醉劑。收集2 0 0g貝肉放在孔徑約2mm的金屬篩網(wǎng)上瀝水5m i n, 撿出碎殼等雜物, 將貝肉均質(zhì), 備用。5.1.2.2 冷凍樣品在室溫下, 使冷凍樣品呈半冷凍狀態(tài)。帶殼冷凍樣品, 按5.1.2.1方法清洗、 開殼、 淋洗取肉, 除去貝肉外部附著的冰片, 抹去水分后, 室溫緩化。收集2 0 0g貝肉放在孔徑約2mm的金屬篩網(wǎng)上瀝水5m i n,將貝肉均質(zhì), 備用。5.1.2.3 貝類罐頭將罐頭內(nèi)容物瀝干水分, 倒入均質(zhì)器充分均質(zhì), 備用。5.1.2.4 貝肉干制品稱取1 0 0g干制品放入足量清水中浸泡2 4h4 8h(4冷藏) , 瀝干、 均質(zhì)、 備用。5.1.2.5 鹽漬品用清水洗滌, 流水脫鹽,瀝干, 均質(zhì)、 備用。5.2 試樣提取取1 0 0g試樣到5 0 0m L燒杯中, 加入5g氯化鈉和1m L濃鹽酸。攪拌均勻。邊攪拌邊加熱混合物至沸騰, 文火煮5m i n, 冷卻至室溫。將混合物移至5 0 0m L離心管中, 用5 0m L乙醚沖洗燒杯, 將沖洗液一同移到離心管中。向離心管G B5 0 0 9.2 6 12 0 1 63 中再加入1 0 0m L乙醚, 蓋塞, 充分振搖。60 0 0r/m i n離心1 5m i n。離心后小心倒出醚層( 上層) 溶液至10 0 0m L分液漏斗中, 用乙醚重復(fù)三次抽提離心管中的沉淀,三次抽提用總量為2 5 0m L乙醚, 轉(zhuǎn)移醚層液體至分液漏斗中。輕輕振蕩( 不能生成乳濁液) , 靜置分層后去除水層( 下層) 及貝肉碎片。將乙醚層移入5 0 0m L的圓底燒瓶中, 減壓濃縮( 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,3 51) 去除乙醚。用1%吐溫- 6 0生理鹽水將濃縮物在刻度試管中稀釋到1 0m L, 充分振搖, 制成均勻N S P - 1%吐溫-6 0生理鹽水混懸液。此時(shí)1m L液量相當(dāng)于預(yù)先測(cè)定的1 0g去殼貝肉的重量, 以此懸浮液作為試驗(yàn)原液進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。5.3 小白鼠試驗(yàn)選擇體重為1 9g 2 1g的健康I C R品系雄性小鼠6只, 隨機(jī)分2組: 檢測(cè)樣品組和空白對(duì)照組(1%吐溫- 6 0生理鹽水) ,3只/組。分別取1m L待測(cè)液或1%吐溫- 6 0生理鹽水腹腔注射。注射時(shí)若有提取液溢出, 須將該只小鼠丟棄, 并重新注射一只小鼠。記錄注射完畢時(shí)間和小鼠停止呼吸時(shí)的死亡時(shí)間, 連續(xù)觀測(cè)9 3 0m i n。若小鼠的中位數(shù)死亡時(shí)間在2h以內(nèi), 則要用1%吐溫- 6 0生理鹽水對(duì)待測(cè)液進(jìn)行稀釋后重新注射, 直到小鼠的死亡時(shí)間在2h6h內(nèi)。6 分析結(jié)果的表述6.1 待測(cè)樣品校正鼠單位(CMU) 的確定根據(jù)待測(cè)樣品的小鼠死亡時(shí)間( 見表A.1) 查出相應(yīng)的鼠單位數(shù)MU;根據(jù)小鼠的重量( 見表A.2)查出其對(duì)應(yīng)的體重校正系數(shù)。同一只小鼠的鼠單位與體重校正系數(shù)相乘, 即得該只小鼠的CMU。選取檢測(cè)樣品受試組中3只小鼠C MU的中位數(shù), 即為該樣品受試組的中位數(shù)C MU, 以此值進(jìn)行6 .2的計(jì)算。6.2 毒素毒力的計(jì)算與結(jié)果表述6.2.1 N S P毒力的計(jì)算試樣中N S P毒力按式(1) 計(jì)算:X=CMU1 01 0 0D F(1) 式中:X 試樣中N S P毒力, 單位為鼠單位每克(MU/g) ;CMU 檢測(cè)樣品受試組小鼠的中位數(shù)校正鼠單位, 單位為鼠單位每毫升(MU/m L) ;D F 稀釋倍數(shù)。注:1 0單位為毫升;1 0 0單位為克。6.2.2 結(jié)果表述在空白對(duì)照組小鼠正常的情況下進(jìn)行如下判斷和表述:若小鼠的死亡時(shí)間等于3 6 0m i n, 則待測(cè)樣品的N S P毒力即相當(dāng)于0.2MU/g。若實(shí)驗(yàn)組中位數(shù)死亡時(shí)間小于1 2 0m i n, 則應(yīng)對(duì)樣品提取液進(jìn)行稀釋, 再選取3只小鼠進(jìn)行試驗(yàn),直至得到中位數(shù)死亡時(shí)間為1 2 0m i n 3 6 0m i n為止, 根據(jù)最后的稀釋液實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算樣品的鼠單位毒力, 報(bào)告該樣品的N S P毒力為:MU/g。若實(shí)驗(yàn)組中位數(shù)死亡時(shí)間大于3 6 0m i n, 則直接計(jì)算確定樣品鼠單位毒力, 報(bào)告該樣品的N S P毒力為:MU/g。若實(shí)驗(yàn)組中所有小鼠在觀察9 3 0m i n內(nèi)均不死亡, 則也可報(bào)告該樣品的N S P毒力小于0.1MU/g。G B5 0 0 9.2 6 12 0 1 64 附 錄 A小鼠死亡時(shí)間與鼠單位換算關(guān)系 小鼠死亡時(shí)間與鼠單位換算關(guān)系見表A.1。表A.1 小鼠死亡時(shí)間與鼠單位換算關(guān)系死亡時(shí)間/m i n鼠單位/MU81 0.01 09.01 28.01 47.01 66.01 85.02 04.53 04.03 83.84 53.66 03.48 33.21 0 53.01 4 02.81 8 02.62 3 42.43 0 02.23 6 02.04 3 51.85 4 01.66 4 51.47 8 01