GB15193.5-2014食品安全國家標準哺乳動物紅細胞微核試驗.pdf

書 書 書中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準犌犅 食品安全國家標準哺乳動物紅細胞微核試驗 發(fā)布 實施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā) 布書 書 書犌犅 前言本標準代替 骨髓細胞微核試驗 。本標準與 相比，主要變化如下： 標準名稱修改為“食品安全國家標準哺乳動物紅細胞微核試驗” ； 修改了范圍； 增加了術語和定義； 增加了試驗報告； 增加了試驗的解釋； 修改了試驗目的和原理； 修改了實驗動物； 修改了給予程序； 修改了標本制作； 修改了閱片的內容。犌犅 食品安全國家標準哺乳動物紅細胞微核試驗范圍本標準規(guī)定了哺乳動物紅細胞微核試驗的基本試驗方法和技術要求。本標準適用于評價受試物的遺傳毒性作用。術語和定義 微核細胞有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進入子細胞形成細胞核時，仍留在細胞質中的整條染色單體或染色體的無著絲斷片或環(huán)。在末期單獨形成一個或幾個規(guī)則的次核，被包含在細胞的胞質內而形成。 著絲粒在細胞分裂期染色體與紡錘體纖維連接的區(qū)域，以使子染色體有序移動到子細胞兩極。 正染紅細胞成熟的紅細胞，其缺乏核糖體并可用選擇性核糖體染料與未成熟的嗜多染紅細胞區(qū)分。 嗜多染紅細胞未成熟的紅細胞處于發(fā)育的中間期，仍含有核糖體，故可用選擇性核糖體染料與成熟的正染紅細胞區(qū)分。 總紅細胞正染紅細胞和嗜多染紅細胞的總和。試驗目的和原理哺乳動物紅細胞微核試驗通過分析動物骨髓和（或）外周血紅細胞，用于檢測受試物引起的成熟紅細胞染色體損傷或有絲分裂裝置損傷，導致形成含有遲滯的染色體斷片或整條染色體的微核。這種情況的出現通常是受到染色體斷裂劑作用的結果。此外也可能在受到紡錘體毒物的作用時，主核未能形成代之以一組小核，此時小核比一般典型的微核稍大。儀器和試劑 儀器解剖器械、生物顯微鏡、載玻片等。犌犅 試劑注：全部試劑除注明外均為分析純，試驗用水為蒸餾水。 小牛血清：小牛血清濾菌后放入 恒溫水浴保溫進行滅活。通常儲存于冰箱里。亦可用大、小鼠血清代替。 染液：稱取 染料 ，加入 甲醇研磨，待完全溶解后，再加入 甘油。置 恒溫箱保溫 ，期間振搖數次，取出過濾，兩周后可用。 應用液：取一份 染液與份磷酸鹽緩沖液混合而成?，F用現配。 磷酸鹽緩沖液（ ） ：磷酸二氫鉀（） 磷酸氫二鈉（ ） 加蒸餾水至 甲醇。試驗方法 受試物 受試物的配制：應將受試物溶解或懸浮于合適的溶媒中，首選溶媒為水、不溶于水的受試物可使用植物油（如橄欖油、玉米油等） ，不溶于水或油的受試物亦可使用羧甲基纖維素、淀粉等配成混懸液或糊狀物等。受試物應現用現配，有資料表明其溶液或混懸液儲存穩(wěn)定者除外。 給予途徑：應采用灌胃法。陽性對照物也可采用腹腔注射的方法。灌胃體積一般不超過 體重，如為水溶液時，最大灌胃體積可達 體重；如為油性液體，灌胃體積應不超過 體重；各組灌胃體積一致。 實驗動物 動物種、系選擇：在利用骨髓時，推薦使用小鼠或大鼠。利用外周血時，推薦用小鼠。如果已經證實某品系動物脾臟不清除有微核的嗜多染紅細胞，或對引起染色體結構或數目畸變的化學物檢測有足夠的敏感性，則此種動物可以利用。通常用周齡 周齡，體重 的小鼠或體重 的大鼠，在試驗開始時，動物體重差異應不超過每種性別平均體重的 。每組用兩種性別的動物至少各只。 動物準備：試驗前動物在試驗動物房應進行至少環(huán)境適應和檢疫觀察。 動物飼養(yǎng)：實驗動物飼養(yǎng)條件、飲用水、飼料應符合國家標準和有關規(guī)定（ 、 、 、 、 ） 。每個受試物組動物按性別分籠飼養(yǎng)，每籠只。試驗期間實驗動物喂飼基礎飼料，自由飲水。 劑量受試物應設三個劑量組，最高劑量組原則上為動物出現嚴重中毒表現和（或）個別動物出現死亡的劑量，一般可取 ，低劑量組應不表現出毒性，分別取 和 作為中、低劑量。急性毒性試驗給予受試物最大劑量（最大使用濃度和最大灌胃容量）動物無死亡而求不出 時，高劑量組則按以下順序：） 體重；）人的可能攝入量的 倍；）一次最大灌胃劑量進行設計，再下設中、低劑量組。另設溶媒對照組。陽性對照物可用環(huán)磷酰犌犅 胺 體重經口或腹腔注射（首選經口）給予。 試驗步驟和觀察指標 受試物給予經口灌胃。根據細胞周期和不同物質的作用特點，可先做預試，確定取材時間。常用 給受試物法。即兩次給受試物間隔 ，第二次給受試物后采集骨髓樣品。試驗還可以有以下種采樣方式：）以受試物次給予動物。以適當的間隔采集骨髓樣品至少次，開始不早于給予后 ，最后不晚于給予后 。早于給予后 的采樣，應說明理由。外周血采樣以適當的間隔至少次，開始不早于給予后 ，最后不晚于給予后 。如在一個采樣時間發(fā)現陽性結果，則不需要進一步采樣。）每天次給予，共次或多次（間隔 ）給予，可在末次給予后 之間采集骨髓次，對外周血可在末次給予后 之間采樣次。若選用外周血正染紅細胞的含微核細胞率作為試驗觀察終點，動物給予的時間應達周以上。 標本制作 骨髓樣品：處死后取胸骨或股骨，用止血鉗擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻，常規(guī)涂片，或用小牛血清沖洗股骨骨髓腔制成細胞懸液涂片，涂片自然干燥后放入甲醇中固定 。當日固定后保存。將固定好的涂片放入 應用液中，染色 。立即用 的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水沖洗、晾干。寫好標簽，陰涼干燥處保存。 外周血樣品：從尾靜脈或其他適當的血管采集外周血，血細胞立即在存活狀態(tài)染色或制備涂片并染色。為排除與使用非染料相關的人工假象可利用特異性染料（如吖啶橙或 加 ） 。這種方法的好處是不會排除常用染料（如 ）的使用。 閱片 選擇細胞完整、分散均勻，著色適當的區(qū)域，在油鏡下觀察。以有核細胞形態(tài)完好作為判斷制片優(yōu)劣的標準。 本方法系觀察嗜多染紅細胞的微核。用 染色法，嗜多染紅細胞呈灰藍色，成熟紅細胞呈粉紅色。典型的微核多為單個的、圓形、邊緣光滑整齊，嗜色性與核質一致，呈紫紅色或藍紫色，直徑通常為紅細胞的 。 對每個動物的骨髓至少觀察 個紅細胞，對外周血至少觀察 個紅細胞，計數嗜多染紅細胞在總紅細胞中比例，嗜多染紅細胞在總紅細胞中比例不應低于對照值的 。每個動物至少觀察 個嗜多染紅細胞以計數有微核嗜多染紅細胞頻率，即含微核細胞率，以千分率表示。如一個嗜多染紅細胞中有多個微核存在時，只按一個細胞計。數據處理和結果評價 數據處理按動物性別分別統(tǒng)計各組含微核細胞率的均數和標準差，利用適當的統(tǒng)計學方法如泊松（ ）分布或檢驗，對受試樣品各劑量組與溶劑對照組的含微核細胞率進行比較。 結果評價試驗組與對照組相比，試驗結果含微核細胞率有明顯的劑量反應關系并有統(tǒng)計學意義時，即可確犌犅 認為有陽性結果。若統(tǒng)計學上差異有顯著性，但無劑量反應關系時，則應進行重復試驗。結果能重復可確定為陽性。試驗報告 試驗名稱、試驗單位名稱和聯系方式、報告編號。 試驗委托單位名稱和聯系方式、樣品受理日期。 試驗開始和結束日期、試驗項目負責人、試驗單位技術負責人、簽發(fā)日期。 試驗摘要。 受試物：名稱、批號、劑型、狀態(tài)（包括感官、性狀、包裝完整性、標識） 、數量、前處理方法、陽性對照物的相關信息。 實驗動物：物種、品系、級別、數量、周齡、體重、性別、來源（供應商名稱、實驗動物生產許可證號） 、動物檢疫、適應情況，飼養(yǎng)環(huán)境（溫度、相對濕度、實驗動物設施使用許可證號） ，飼料來源（供應商名稱、實驗動物飼料生產許可證號） 。 試驗方法：試驗分組、每組動物數、劑量選擇依據、受試物給予途徑及期限、采樣時間點、標本制備方法、每只動物觀察的細胞數、統(tǒng)計方法和判定標準。 試驗結果：記錄每只動物觀察的嗜多染紅細胞數和含有微核的細胞數，以列表方式報告不同性別每組動物的嗜多染紅細胞數、含微核細胞率和嗜多染紅細胞在總紅細胞中的比例、劑量反應關系、陰性對照的歷史資料和范圍，并寫明結果的統(tǒng)計方法。 試驗結論：根據試驗結果，對受試物是否能引起哺乳動物嗜多染紅細胞含微核細胞率增加做