GB15193.7-2003小鼠精子畸形試驗.pdf

I C S 0 7 . 1 0 0C 5 3中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準GB 1 5 1 9 3 . 7 -2 0 0 3 代替 G B 1 5 1 9 3 . 7 -1 9 9 4小鼠 精子畸 形試驗Mi c e s p e r m a b n o r ma l i t y t e s t2 0 0 3 - 0 9 - 2 4發(fā)布2 0 0 4 - 0 5 - 0 1 實施華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部國 國 家 標 準 化 管 理 委 員 會發(fā) 布中中GB 1 51 9 3 . 7 - 2 0 0 3月 IJ舌本標準全文強制。本標準代替G B 1 5 1 9 3 . 7 -1 9 9 4 小鼠精子畸形試驗 。本標準與G B 1 5 1 9 3 . 7 -1 9 9 4 相比主要修改如下:在“ 范圍” 中增加了受試物的具體內(nèi)容: 食品生產(chǎn)、 加工、 保藏、 運輸和銷售過程中所涉及的可能 對健康造成危害的化學、 生物和物理因素， 檢驗對象包括食品添加劑( 含營養(yǎng)強化劑) 、 食品新 資源及其成分、 新資源食品、 輻照食品、 食品容器與包裝材料、 食品工具、 設備、 洗滌劑、 消毒劑、 農(nóng)藥殘留、 獸藥殘留、 食品工業(yè)用微生物等;在“ 劑量及分組” 中: 在高劑量組的設計方法中增加“ 急性毒性試驗給予受試物最大劑量( 最大 使用濃度和最大灌胃 容量) 動物無死亡而求不出L D。 時， 則按以下順序: a ) 1 0 g / k g 體重; b ) 人的可能攝人量的1 0 。 倍; 或 c ) 一次最大灌胃劑量進行設計，:在“ 操作步驟” 中: 增加了“ 受試物配制” 的內(nèi)容;將“ 鏡檢” 改為“ 閱片” ， 內(nèi)容分列為: “ 閱片要求” 、 “ 精子畸形的類型” 和“ 閱片注意事項” 三部分;- “ 統(tǒng)計方法及結(jié)果判定” 分列為“ 數(shù)據(jù)處理” 和“ 結(jié)果判定”自 本標準實施之日 起， G B 1 5 1 9 3 . 7 -1 9 9 4 同時廢止。本標準由中華人民共和國衛(wèi)生部提出并歸口。本標準起草單位: 中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與食品安全所、 浙江省醫(yī)學科學院本標準主要起草人: 徐晉康、 龔幼菊、 陳似蘭。本標準于 1 9 9 4 年首次發(fā)布， 本次為第一次修訂。GB 1 51 9 3 . 7 - 2 0 0 3小鼠精子畸形試驗范圍 本標準規(guī)定了小鼠精子畸形試驗的基本技術(shù)要求。 本標準適用于評價食品生產(chǎn)、 加工、 保藏、 運輸和銷售過程中所涉及的可能對健康造成危害的化學、生物和物理因素的遺傳毒性， 檢驗對象包括食品添加劑( 含營養(yǎng)強化劑) 、 食品新資源及其成分、 新資源食品、 輻照食品、 食品容器與包裝材料、 食品工具、 設備、 洗滌劑、 消毒劑、 農(nóng)藥殘留、 獸藥殘留、 食品工業(yè)用微生物等。2 原理 小鼠精子畸形受基因控制， 具有高度遺傳性， 許多常染色體及 X , Y性染色體基因直接或間接地決定精子形態(tài)。精子的畸形主要是指形態(tài)的異常， 已知精子的畸形是決定精子形成的基因發(fā)生突變的結(jié)果。因此形態(tài)的改變提示有關(guān)基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的改變。小鼠精子畸形試驗可檢測環(huán)境因子對精子生成、 發(fā)育的影響， 而且對已知的生殖細胞致突變物有高度敏感性， 故本試驗可用作檢測環(huán)境因子在體內(nèi)對生殖細胞的致突變作用 。3 儀器與試劑 全部試劑除注明外， 均為分析純， 試驗用水為蒸餾水3 . 1 實驗室常用設備。3 . 2 生物顯微鏡。3 . 3 甲醇。3 . 4 1 %-2 % 伊紅染色液: 稱取伊紅1 g ,2 g , 溶于1 0 0 m L 蒸餾水備用。4 實驗動物成年雄性小鼠, 6 周8 周齡、 體重 2 5 g -3 5 g 。動物購買后適應環(huán)境 3 天一5 天。5 劑量及分組 受試物應設三個劑量組， 最高劑量組原則上為動物出現(xiàn)嚴重中毒表現(xiàn)和/ 或個別動物出現(xiàn)死亡的劑量 一般可取 1 1 2 L D s， 低劑量組應不表現(xiàn)出毒性， 分別取 1 / 4和1 / 8 L D s 作為中、 低劑量。急性毒性試驗給予受試物最大劑量( 最大使用濃度和最大灌胃容量) 動物無死亡而求不出L D s 。 時， 高劑量組則按以下順序: a ) 1 0 g / k g 體重; b ) 人的可能攝人量的1 0 。 倍; 或c ) 一次最大灌胃劑量進行設計， 再下設中、 低劑量組。另設溶劑對照組和陽性對照組。每組至少有 5 只存活動物。陽性物可采用環(huán)磷酞胺4 0 m g / k g 體重一6 0 m g / k g 體重、 甲基磺酸甲醋( MMS ) 5 0 m g / k g體重或絲裂霉素C ( MMC ) 1 . 0 m g / k g體重一1 . 5 mg / k g體重經(jīng)口或腹腔注射( 首選經(jīng)口) 給予6 操作步驟6 . 1 受試物配制 一般用蒸餾水作溶劑， 如受試物不溶于水， 可用食用油、 醫(yī)用淀粉、 梭甲基纖維素等配成乳化液或懸濁液受試物應于灌胃前新鮮配制， 除非有資料表明以溶液( 或懸濁液、 乳濁液等) 保存具有穩(wěn)定性6 . 2 實驗動物的處理 5 7GB 1 51 9 3 . 7 - 2 0 0 3 經(jīng)口給予， 連續(xù) 5 天。各種致突變物作用于精子的不同發(fā)育階段， 可在接觸某種致突變物后不同時間出現(xiàn)精子畸形， 故有條件時， 可于給受試物后第 1 , 4 , 1 0 周處死動物， 檢查精子形態(tài)。因為大部分化學致突變物對精原細胞后期或初級精母細胞早期的生殖細胞較為敏感， 故一般均是于首次給受試物后的第 3 5 天處死。6 . 3 標本制備 用頸椎脫臼法處死小鼠， 取出二側(cè)副肇， 放人有適量生理鹽水( 約 1 m L ) 的小燒杯中或放人盛有2 m L生理鹽水的平皿中。用眼科剪將副肇縱向剪 1 刀一2 刀， 靜止 3 m i n -5 m i n， 輕輕搖動。用四層擦鏡紙或合成纖維血網(wǎng)袋過濾， 吸濾液涂片?？諝飧稍锖?， 用甲醇固定5 m i n以上干燥， 用1 % - 2 %伊紅染色1 h ， 用水輕沖， 干燥。6 . 4 閱片6 . 4 . 1 閱片要求 在低倍鏡下( 用綠色濾光片) 找到背景清晰、 精子重疊較少的部位， 用高倍鏡順序檢查精子形態(tài)， 計數(shù)結(jié)構(gòu)完整精子。 精子有頭無尾( 輪廓不清) 或頭部與其他精子或碎片重疊， 或明顯是人為剪碎者， 均不計算， 每只動物至少檢查1 0 0 0 個精子6 . 4 . 2 精子畸形的類型 精子畸形， 主要表現(xiàn)在頭部， 其次為尾部?；晤愋涂煞譃闊o鉤、 香蕉形、 胖頭、 無定形、 尾折疊、 雙頭、 雙尾等。6 . 4 . 3 閱片注意事項 異常精子均應記錄顯微鏡的坐標數(shù)， 以備復查。并分別記錄異常類型， 以便統(tǒng)計精子畸形率及精子畸形類型的構(gòu)成比。判斷雙頭、 雙尾畸形時， 要注意與兩條精子的部分重疊相鑒別， 判斷無定形時要與人為剪碎及折疊相鑒別。7 數(shù)據(jù)處理 每個劑量組應分別與相應