聚酰胺樹(shù)脂柱分離純化貫葉連翹中的金絲桃素VIP

本科畢業(yè)論文 題 目 聚酰胺樹(shù)脂柱提取純化 貫葉連翹中的金絲桃素 專(zhuān) 業(yè) 化學(xué) 作者姓名 遲琳琳 學(xué) 號(hào) 2011202313 單 位 化學(xué)化工學(xué)院 指導(dǎo)教師 孫愛(ài)玲 2015年 5 月 教務(wù)處編聊城大學(xué)本科畢業(yè)論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究取得的成果。除文中已經(jīng)引用的內(nèi)容外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得聊城大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位證書(shū)而使用過(guò)的材料。對(duì)本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均在文中以明確的方式表明。本人承擔(dān)本聲明的相應(yīng)責(zé)任。學(xué)位論文作者簽名： 日期： 指 導(dǎo) 教 師 簽 名: 日期： 目 錄前言11.化學(xué)成分及藥理作用研究21.1化學(xué)成分21.1.1苯并二蒽酮類(lèi)化合物21.1.2間苯三酚化合物21.1.3黃酮類(lèi)化合物21.2金絲桃素的不同提取方法21.2.1 金絲桃素的提取21.2.2 黃酮類(lèi)成分的提取31.3金絲桃素的藥理作用31.3.1抗抑郁作用31.3.2抗病毒作用31.3.3抗腫瘤作用41.3.4抗菌作用41.4前景與展望41.4.1明確金絲桃素延緩衰老及抗腫瘤作用機(jī)理41.4.2治療偏頭痛的活性成分51.4.3 貫葉連翹與其它藥物聯(lián)合相互作用51.4.4改變藥物劑型來(lái)提高治療效果51.4.5結(jié)合中醫(yī)理論進(jìn)行發(fā)掘研究52.高效液相色譜法52.1高效液相色譜法的簡(jiǎn)介52.2高效液相色譜法的分類(lèi)62.3高效液相色譜法的分離原理62.4高效液相色譜法的特點(diǎn)6 2.5高效液相色譜的應(yīng)用72.6液相色譜與氣相色譜的區(qū)別73.實(shí)驗(yàn)部分73.1實(shí)驗(yàn)儀器73.2實(shí)驗(yàn)藥材73.3樣品的處理83.4聚酰胺柱層析83.4.1聚酰胺簡(jiǎn)介83.4.2聚酰胺的預(yù)處理83.4.3聚酰胺柱的回收83.4.4裝柱的方法83.4.5聚酰胺柱層析的不足83.4.6用聚酰胺柱除雜83.5樣品的保存94.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論94.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果94.1.1HPLC分析條件104.1.2結(jié)果104.2討論10參考文獻(xiàn)111摘 要金絲桃素(hypericin)是貫葉連翹(Hypericumperforatum L)提取物抗抑郁作用的主要活性成分之一，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗抑郁、抗老年癡呆和促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶等多方面的藥理活性。金絲桃素遇光、氧、熱極易發(fā)生變質(zhì)。為促進(jìn)我國(guó)貫葉連翹資源的深入開(kāi)發(fā)與新藥研制，文章對(duì)從貫葉連翹中提取有效成分金絲桃素進(jìn)行了研究，用乙酸乙酯提取，經(jīng)過(guò)聚酰胺樹(shù)脂柱分離，依次用乙醇、丙酮洗脫，得以產(chǎn)品，并建立了金絲桃素的HPLC分析方法。 關(guān)鍵詞：聚酰胺樹(shù)脂；乙醇；乙酸乙酯；金絲桃素；HPLCAbstractHypericin is one of the main active ingredient of the anti-depressant effect of Hypericin perforatum L,having pharmacological activity of antibacterial, anti - inflammatory,anti-tumor,anti-depression,anti-Alzheimer-disease and promotion of learning and memory.The nature of Hypericin was easily occurred in the sunlight, oxygen and heat.For the further development of new drugs and promoting the development of hypericum perforatum resources in China,it based on extract Hypericin from Hypericum perforatum L.First,it was extracted with ethyl acetate and was separated by polyamide resin column.Then,it was eluted with ethanol and acetone in turn.We got the product.The HPLC analysis method of the Hypericin was established. Key words:Polyamide resin;Ethanol;Ethyl acetate;Hypericin;HPLC貫葉連翹中有效成分生產(chǎn)工藝前 言貫葉連翹是藤黃科金絲桃素屬多年生草本植物全草入藥，具有清熱解毒、收斂止血、利濕等功效。金絲桃素是最具有生物活性的貫葉連翹。研究表明，金絲桃素具有治療抑郁、菌消炎、DNA和RNA病毒，促進(jìn)記憶等疾病的藥理活性。還是一種有效的光敏劑，在光動(dòng)力學(xué)治療中表現(xiàn)出強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性 1, 2 。在德國(guó)，將金絲桃素與蛋白結(jié)合，用于治療艾滋病及甲、乙型肝炎 3 ；在美國(guó)，它作為食品添加劑已被廣泛的使用。我國(guó)貫葉連翹資源十分豐富，金絲桃素只有通過(guò)化學(xué)方法才能對(duì)其進(jìn)行提取和精制，需要對(duì)其進(jìn)行提取、分離和純化。國(guó)內(nèi)有關(guān)金絲桃素的工藝研究進(jìn)行的較晚，直到上世紀(jì)90年代末才有報(bào)道 4 。到目前為止，國(guó)內(nèi)現(xiàn)行的生產(chǎn)工藝大部分還停留在金絲桃素的提取工藝上，對(duì)其分離、純化的產(chǎn)品易發(fā)粘、易吸濕的缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)現(xiàn)行金絲桃素的提取工藝進(jìn)行研究改進(jìn)的基礎(chǔ)上，探索了分離、純化金絲桃素的生產(chǎn)工藝，使其成為了系統(tǒng)的生產(chǎn)工藝，從而有助于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。 金絲桃素是貫葉連翹花枝中的親脂性成分,同時(shí)還具有抗腫瘤、抗菌、抗老年癡呆與促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶等多方面的藥理活性，是當(dāng)前國(guó)際上研究的主要熱點(diǎn)天然藥物。金絲桃素因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、顯著的藥理活性、體內(nèi)低毒性、豐富的天然來(lái)源而有著廣闊的開(kāi)發(fā)前景，因?yàn)樗鼘?duì)光、熱和氧氣非常之敏感，常溫下存放幾個(gè)星期乃至幾天就可以完全被氧化。HF的高度不穩(wěn)定性對(duì)該化合物的研究和藥用開(kāi)發(fā)有著一定的難度。所以，有必要對(duì)它的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾和改造，使它能夠在常態(tài)下保持非常穩(wěn)定的化學(xué)特性，而且保留原來(lái)的藥理活性。對(duì)HF的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了進(jìn)一步的修飾與改造，有望得到化學(xué)性質(zhì)相對(duì)比較穩(wěn)定、不會(huì)誘導(dǎo)肝藥酶的活性并能夠保留母體中化合物藥理的活性的衍生物。研究并合成成功的衍生物已經(jīng)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和十分優(yōu)越的藥理活性機(jī)理，但是它的藥動(dòng)學(xué)行為有待進(jìn)一步的研究。在抗抑郁作用方面是金絲桃素的藥理學(xué)方面進(jìn)行的主要研究，但是它的作用機(jī)理至今未研究清楚，仍然需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。研究表明其在較低的濃度下產(chǎn)生明顯的藥理活性，而且顯示金絲桃素可能作用于細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路。金絲桃素及其衍生物對(duì)于開(kāi)發(fā)新藥物和新劑型，提高藥效與生物利用度等多個(gè)方面都有著極大的促進(jìn)作用。以其為先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)新藥，對(duì)抑郁癥、老年癡呆癥這兩種嚴(yán)重威脅生命健康、且迄今未有有效方法醫(yī)治的疾病的預(yù)防和治療，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本論文對(duì)貫葉連翹提取物中的金絲桃素的生產(chǎn)工藝及提取方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)探究，建立了貫葉連翹中有效成分金絲桃素的提取方法。利用聚酰胺柱及乙酸乙酯提取、乙醇洗脫、旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法提取金絲桃素，并用HPLC對(duì)提取物進(jìn)行分析及含量測(cè)定。1.化學(xué)成分及藥理作用研究 1.1化學(xué)成分貫葉連翹有多種化學(xué)成分。主要有苯并二蒽酮類(lèi)化合物、間苯三酚化合物、黃酮類(lèi)化合物5。深入地研究使人們發(fā)現(xiàn)貫葉連翹中的黃酮類(lèi)在抗抑郁作用中起著不可忽視的作用1.1.1苯并二蒽酮類(lèi)化合物主要包括金絲桃素、偽金絲桃素、異金絲桃素、環(huán)金絲桃素、原偽金絲桃素等。含量主要為金絲桃素和偽金絲桃素，植物中含有的大量的原金絲桃素和原偽金絲桃素在陽(yáng)光下可以轉(zhuǎn)化為金絲桃素和偽金絲桃素。1.1.2間苯三酚化合物間苯三酚類(lèi)物質(zhì)廣泛存在于藤黃科植物中。此化合物的主要成分是貫葉金絲桃素與加貫葉金絲桃素。貫葉金絲桃素的成分含量為2%-4.5%，而且加貫葉金絲桃素成分為0.2%-1.9%。1.1.3黃酮類(lèi)化合物貫葉連翹黃酮成分十分豐富，全草成分已達(dá)到了9.25%，比金絲桃素更加穩(wěn)定，無(wú)需避光和熱，具有非常好的開(kāi)發(fā)前景。已鑒定了的化合物有槲皮素、蘆丁等物質(zhì)，具有抗炎、抗病毒等功效。 1.2金絲桃素的不同提取方法1.2.1 金絲桃素的提取對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)式進(jìn)行分析得出相應(yīng)結(jié)論，金絲桃素的溶解度在極性與非極性溶劑非常高，在非極性溶劑中極易被氧化，在甲醇、乙醇、乙醚等極性溶劑中具有比較好的穩(wěn)定性，它同時(shí)有多個(gè)酚羥基，呈弱酸性，溶于弱堿性物質(zhì)5。醇提法有吸濕，發(fā)粘有關(guān)缺點(diǎn)，王曉利等6優(yōu)化出的最佳提取工藝：用藥材4倍量的甲醇，在40下提取3次，每12 h/次；王剛等7用甲醇為溶劑，運(yùn)用回流提取與和超聲振蕩方法提取，考察產(chǎn)物提取率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定以甲醇超聲提取30 min提取率最高。1.2.2 黃酮類(lèi)成分的提取關(guān)于對(duì)于貫葉連翹中黃酮物質(zhì)的提取方法的相關(guān)報(bào)道很少。目前比較通用的方法有：水提取法、堿液提取法、微波或超聲波提取法、大孔樹(shù)脂法、超濾法以及超臨界萃取法等。李曉萌等8研究結(jié)果表明貫葉連翹中總黃酮的最佳提取條件為60%，乙醇80 ml，回流提取3 小時(shí)。研究9表明采用乙醇熱回流法，用量分?jǐn)?shù)為80%乙醇10倍量，經(jīng)過(guò)熱回流提取2次，每次0.5 h可以提高金絲桃苷的提取率。各種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，需要根據(jù)提取物的性質(zhì)、提取的成本、工藝設(shè)備等多方面條件來(lái)選擇比較合適的提取工藝，提高黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取率和原料的利用的效果。 1.3金絲桃素的藥理作用 1.3.1抗抑郁作用目前臨床上治療抑郁癥化學(xué)藥物雖說(shuō)治療效果顯著，但隨之其毒副作用也日益凸顯。國(guó)內(nèi)外許多人已把目光轉(zhuǎn)向植物提取物及中成藥，其中應(yīng)用較多的為貫葉連翹。金絲桃素抗抑郁癥最早始于德國(guó)，19世紀(jì)初德國(guó)醫(yī)生Kemer發(fā)現(xiàn)金絲桃素可以治療情緒性疾病。此后，金絲桃素在歐洲長(zhǎng)期被作為治療皮膚表面創(chuàng)傷和抗抑郁藥物。特別是20世紀(jì)80年代以來(lái)，貫葉連翹成分已越來(lái)越成為國(guó)外醫(yī)藥工作者研究的熱點(diǎn)，最具說(shuō)服力的說(shuō)法是當(dāng)我們治療輕度與中度抑郁癥患者的時(shí)候，含有金絲桃素類(lèi)成分的貫葉連翹提取物治療效果比安慰劑的效果更好，同標(biāo)準(zhǔn)抗抑郁藥相比較，療效副作用會(huì)更加小。有研究總結(jié)認(rèn)為10貫葉連翹的提取物的抗抑郁主要活性是由于能抑制多巴胺、去甲腎上腺素等單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的攝取，有研究學(xué)者指出11未來(lái)的研究可應(yīng)用神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)的模式和通過(guò)更多劑量反應(yīng)的關(guān)系來(lái)確定這一機(jī)制。1.3.2抗病毒作用艾滋病是威脅人類(lèi)健康的頑癥，其致病因子為HIV病毒。早在20世紀(jì)80年代Memel等報(bào)道了金絲桃素抗HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用：金絲桃素與HIV一同培養(yǎng)，結(jié)果顯示12HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活性降低了75%。De-clervp認(rèn)為抑制逆轉(zhuǎn)錄酶可能是金絲桃素抗艾滋病毒機(jī)理，金絲桃素并不能影響病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯，而是對(duì)病毒的裝配和釋放進(jìn)行干擾。孫宇新等13從分子水平上研究了金絲桃素HIV病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的相互作用，以用來(lái)探究金絲桃素類(lèi)化合物抗病毒作用機(jī)理，其研究可以為HIV病毒抑制劑的藥物設(shè)計(jì)提供理論模型和重要參考。1.3.3抗腫瘤作用金絲桃素的抗腫瘤作用許多體內(nèi)及體外的實(shí)驗(yàn)均顯示金絲桃素對(duì)喉癌14、肺癌等具有抗腫瘤作用，金絲桃素的光敏活性也被用于癌癥的早期診斷，研究表明金絲桃素在膀胱癌早期診斷中的敏感性和特異性可分別高達(dá)94%和95%，而且在診斷和手術(shù)過(guò)程中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)光致褪色現(xiàn)象15。1.3.4抗菌作用 目前貫葉連翹總提取物用于抗菌作用的研究報(bào)道較少。李宏等報(bào)道貫 葉連翹總提取物對(duì)黃色短桿菌16、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、綠膿桿菌、蘇云金桿菌有很強(qiáng)的抑菌和殺菌作用。貫葉連翹提取物對(duì)臨床分離的11株對(duì)常用抗生素有耐藥性的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌株均有較強(qiáng)的抑菌和殺菌作用提示提取物可用于控制臨床上對(duì)多種抗生素有耐藥性的革蘭氏陽(yáng)性菌株所致的感染。上述這些實(shí)驗(yàn)研究表明用于臨床作抗菌藥對(duì)人體既是安全的，而貫葉連翹中金絲桃素的抗腫瘤和抗病毒作用需要光照條件來(lái)增強(qiáng)，但金絲桃素在強(qiáng)光照射下可能引起光敏性皮炎，這一副作用使其抗腫瘤17、抗病毒作用的發(fā)揮受到一定限制。貫葉連翹總提取物的抗抑郁作用不依賴(lài)于光照，避免了光敏化副作用，對(duì)于控制病人因細(xì)菌感染可能引起的抑郁癥狀，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。 1.4前景與展望貫葉連翹在我國(guó)資源豐富，但研究確尚在起步。隨著越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道18研究了貫葉連翹對(duì)多種疾病具有治療作用，近年來(lái)在中藥研究領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注，綜合學(xué)者的研究成果19，對(duì)貫葉連翹中金絲桃素的研究主要集中在藥理作用、化學(xué)方面。隨著對(duì)貫葉連翹需求量的增加。然而貫葉連翹資源破壞程度日趨嚴(yán)重，因此合理利用資源，防止資源枯竭迫在眉睫。我們應(yīng)加強(qiáng)貫葉連翹組織培養(yǎng)是保護(hù)資源，并建立物種種質(zhì)基因庫(kù)，防止物種種質(zhì)基因流失。1.4.1明確金絲桃素延緩衰老及抗腫瘤作用機(jī)理研究表明20貫葉連翹提取物能延長(zhǎng)果蠅平均壽命，增強(qiáng)小鼠體內(nèi)抗氧化能力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平。但其延緩衰老的活性成分及其作用機(jī)制還有待一步研究。貫葉連翹中的金絲桃素對(duì)于單胺氧化酶丙二醛的抑制作用被認(rèn)為是貫葉連翹抗抑郁的主要作用機(jī)理，但是該假設(shè)尚且并未在實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。金絲桃素對(duì)于神經(jīng)遞質(zhì)的攝取抑制作用為貫葉連翹抗抑郁作用的主要作用機(jī)理，其他藥理作用也可以解釋其臨床療效。1.4.2治療偏頭痛的活性成分 貫葉連翹在民間常用于偏頭痛，治療效果極好，但這方面尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。尋找到貫葉連翹治療偏頭痛的活性成分，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，可有利于貫葉連翹資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。1.4.3 貫葉連翹與其它藥物聯(lián)合相互作用 金絲桃素能夠與其它藥物發(fā)生相互作用，改變藥物的體內(nèi)代謝行為，甚至引發(fā)嚴(yán)重不良事件。如沈燕研究表明貫葉連翹與強(qiáng)心苷、免疫抑制劑、他汀類(lèi)降血脂藥物等均會(huì)發(fā)生相互作用。因此，減少與其它藥物一起服用時(shí)的相互作用而產(chǎn)生的副作用的研究對(duì)于臨床研究具有重要的意義。1.4.4改變藥物劑型來(lái)提高治療效果 有研究表明金絲桃素主要的副作用為胃腸不適、失眠和頭痛等?？砂沿炄~連翹制成靶向制劑或者制成腸溶制劑通過(guò)載體使藥物選擇性的濃集于病變位的給藥系統(tǒng)，這樣可減少胃腸不適的副作用。1.4.5結(jié)合中醫(yī)理論進(jìn)行發(fā)掘研究目前金絲桃素在國(guó)外研究較多，而國(guó)內(nèi)研究甚少。但是金絲桃素具有很長(zhǎng)的藥用歷史，根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，其性平，貫葉連翹味辛苦澀，具有清心明目、舒經(jīng)活血、止血生肌、解毒消炎、利濕之功效。因此我們應(yīng)充分利用我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)，在臨床上合理應(yīng)用傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的經(jīng)方驗(yàn)方，綜合中西醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)辯證應(yīng)用貫葉連翹在治療各種疾病上的優(yōu)勢(shì)，能做到最大限度的利用資源。 2.高效液相色譜法 2.1高效液相色譜法的簡(jiǎn)介 高效液相色譜法是1906年由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特在研究用碳酸鈣分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的。此后又發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法的測(cè)定方法。高效液相色譜法又稱(chēng)“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜法是一種新型分離分析技術(shù)，是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來(lái)隨著不斷的改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段，具備速率快、效率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。 2.2高效液相色譜法的分類(lèi) (1)按固定相聚集狀態(tài)：可以分為液液色譜法和液固色譜法兩大類(lèi)。(2)按分離機(jī)制可分為：液-液色譜法、液-固色譜法、離子交換色譜法、空間排阻色譜法、化學(xué)鍵合相色譜法、離子對(duì)色譜法、離子色譜法等類(lèi)別。其中，化學(xué)鍵合相色譜中的反相鍵合相色譜應(yīng)用最廣,使用最廣的反相鍵合相是十八烷基鍵合相，即碳十八烷鍵合到硅膠表面。這種鍵合相又稱(chēng)ODS鍵合相，如國(guó)產(chǎn)的YWG-C18等。本實(shí)驗(yàn)就是用的該鍵合相。 (3)按流動(dòng)相的壓強(qiáng)：可分為高效液相色譜法和超高效液相色譜法兩大類(lèi)。 2.3高效液相色譜法的分離原理 高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。高效液相色譜法是在高壓條件下溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換的過(guò)程，它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)親和力吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。 2.4高效液相色譜法的特點(diǎn) 高效液相色譜法具有“四高一廣”特點(diǎn)：(1)高壓：液體流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱所受阻力較大，為了使載液迅速通過(guò)色譜柱，必須對(duì)其加高壓。(2)高速：分析速度比較快、載液流速比較快，相對(duì)于經(jīng)典液體色譜法速度要快得多，通常分析在1小時(shí)以?xún)?nèi)均能完成。(3)高效：分離效能比較高。相比于工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出來(lái)了許多倍。(4)高靈敏度：紫外檢測(cè)器可以達(dá)到0.01 ng，進(jìn)樣量在微升數(shù)量級(jí)。(5)應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可以利用高效液相色譜進(jìn)行化合物的分析，特別是沸點(diǎn)高、分子大、極性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析，顯示出比較明顯的優(yōu)勢(shì)。色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等也是高效液相色譜的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)也存在，就是“柱外效應(yīng)”。從進(jìn)樣到檢測(cè)器之間，除了柱子之外的任何的死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測(cè)池等）中，流動(dòng)相的流型如果有所變化，被分離物質(zhì)的任何的擴(kuò)散和滯留都會(huì)顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率的降低。高效液相色譜檢測(cè)器的靈敏度比不上氣相色譜。 2.5 高效液相色譜的應(yīng)用(1)藥物分析中藥質(zhì)量控制，抗生素質(zhì)控分析，生化藥質(zhì)量控制，化學(xué)藥物質(zhì)量控制，新型高效手性藥物中手性對(duì)映體含量的測(cè)定等。 (2)環(huán)境污染物的分離與測(cè)定大氣、水、土壤和食品中的多環(huán)芳烴、多環(huán)聯(lián)苯，有機(jī)氯農(nóng)藥、有機(jī)磷農(nóng)藥，除草劑，陰離子表面活性劑，黃曲霉毒素、酚類(lèi)胺類(lèi)等污染物的分離與測(cè)定。(3)食品質(zhì)量分析農(nóng)藥殘留，獸藥殘留；防腐劑、抗氧化劑、人工合成色素等食品添加劑的分離與測(cè)定，真菌毒素分析，保健食品中的功效成分檢測(cè)等。 (4)前沿生命科學(xué)分析DNA電泳與色譜分析，生物標(biāo)志物色譜分析，生物技術(shù)藥物純化及鑒定，蛋白質(zhì)組學(xué)研究等。 2.6液相色譜與氣相色譜的區(qū)別(1)液相色譜可完成難度較高的分離，是因?yàn)橐合嗌V固定相類(lèi)型多，分析時(shí)可選擇的余地大，氣相色譜則不可能；液相色譜室溫下便可操作，低溫利于色譜分離。(2)液相色譜不受試樣和熱穩(wěn)定性的限制，適合相對(duì)分子質(zhì)量大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)的分離、分析，而氣相色譜僅可以分析在操作溫度下氣化而不分解的物質(zhì)，即氣體和沸點(diǎn)較低的化合物。3.實(shí)驗(yàn)部分3.1實(shí)驗(yàn)儀器RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；DLSB-ZD低溫循環(huán)真空泵；B-260恒溫水浴鍋；電子分析天平（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；UltiMate3000高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司），包括U-300輸液泵，DAD-300紫外檢測(cè)器；KQ3200型超聲波清洗機(jī)（濟(jì)寧科源超聲設(shè)備有限公司）；抽慮瓶；25 mL容量瓶；50 mL圓底燒瓶；AR1140電子天平(MaxCap:110g,Readability:0.0001g)。3.2實(shí)驗(yàn)藥材聚酰胺（顆粒度：30-60目，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠(chǎng)出品），用于樣品提取的試劑（乙醇和丙酮）為分析純（天津市試劑三廠(chǎng)），HPLC所用的試劑（甲醇和磷酸氫二鈉），水為過(guò)濾的純凈水 3.3樣品的處理 精準(zhǔn)稱(chēng)取貫葉連翹提取物50克避光操作，先以三倍量乙酸乙酯超聲30分鐘提取3次，提取物減壓濃縮后，以95%乙醇溶解。 3.4聚酰胺柱層析3.4.1聚酰胺簡(jiǎn)介俗稱(chēng)尼龍(Nylon)，它是大分子主鏈重復(fù)單元中含有酰胺基團(tuán)的高聚物的總稱(chēng)。可由已內(nèi)酰胺聚合，或是由二元胺與二元酸縮聚，也或是用-氨基酸或環(huán)內(nèi)酰胺來(lái)合成。其分離原理可能與其主鏈上含有許多的重復(fù)酰胺基與含有酚、醌及硝基結(jié)構(gòu)的化合物形成氫鍵，與不能形成氫鍵的化合物進(jìn)行分離有關(guān)。 3.4.2聚酰胺的預(yù)處理將稱(chēng)取的新聚酰胺置于500ml的大燒杯中，用適量的95%乙醇浸泡，注意乙醇的液面要高于樹(shù)脂，用玻璃棒充分?jǐn)噭?dòng)，以除氣泡，封口，靜置過(guò)夜。3.4.3聚酰胺柱的回收使用過(guò)的聚酰胺一般用5%氫氧化鈉溶液洗滌，然后水洗，再用10%醋酸液洗，然后用蒸餾水洗至中性，即可。 3.4.4裝柱的方法將過(guò)夜的聚酰胺樹(shù)脂用95%乙醇溶解，一般將顆粒狀聚酰胺混懸于水中，使其充分膨脹，然后裝柱，讓聚酰胺自由沉降。裝柱時(shí)要填實(shí)，使聚酰胺藥品添勻，防止影響分離效果。 3.4.5聚酰胺柱層析的不足比如機(jī)械強(qiáng)度不大，粒度不均勻，分離時(shí)流速較慢。一些小分子雜質(zhì)混入的問(wèn)題 采用的解決方案有：裝柱前先過(guò)篩；裝柱時(shí)用5%甲醇或10%鹽酸預(yù)先除去小分子雜質(zhì)；與硅藻土混合制粒以增加機(jī)械強(qiáng)度。 3.4.6用聚酰胺柱除雜將樣品均勻平鋪在聚酰胺樹(shù)脂表面，在聚酰胺樹(shù)脂柱靜止吸附1小時(shí)后，首先以95%乙醇洗脫至洗脫液無(wú)色，再用丙酮洗脫，收集富含金絲桃素的丙酮餾分減壓濃縮，經(jīng)冷卻干燥，得褐綠色粉末冷凍保存，備用。用完的聚酰胺樹(shù)脂先用5%的氫氧化鈉洗脫至無(wú)色，再用酸洗滌，最后用蒸餾水洗脫，回收保存。3.5樣品的保存 將含金絲桃素的產(chǎn)品至于棕色瓶中，4下避光保存4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖1.貫葉連翹粗提取物的HPLC 圖2.貫葉連翹過(guò)聚酰胺柱后丙酮流分的HPLC圖圖中為大黃素 為金絲桃素 4.1.1HPLC分析條件 色譜柱 C18 (250 mm4.6 mm,5m)；流動(dòng)相：0.006M的磷酸氫二鈉緩沖液(用磷酸調(diào)PH為6.5 )和甲醇（12.5:87.5v/v）柱溫：30，流速: 1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng): 590 nm。4.1.2結(jié)果 經(jīng)核磁對(duì)比得知為大黃素，為金絲桃素。圖2較圖1來(lái)看圖像顯示樣品成分更為明顯，圖1峰較亂，圖2更為分類(lèi)明顯。貫葉連翹提取物中活性成分提取實(shí)驗(yàn)表明：以乙酸乙酯為提取劑，超聲提取30分鐘提取3次并減壓濃縮，能效率較高的實(shí)驗(yàn)從貫葉連翹中提取金絲桃素等有效成分，且對(duì)環(huán)境造成的污染也小，材料易得，因此該工藝適合于工業(yè)化生產(chǎn)。 4.2討論 本實(shí)驗(yàn)用乙酸乙酯提取貫葉連翹，超聲提取3次后，進(jìn)一步利用樹(shù)脂柱層析分離純化金絲桃素，用乙醇、丙酮洗脫后，將得到的提取物減壓濃縮后，晾干，得到產(chǎn)物。貫葉連翹粗提物經(jīng)過(guò)樹(shù)脂柱的分離純化后，大大提高了產(chǎn)品中金絲桃素的提取率，并且該法操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)易行(所用乙醇可回收）。金絲桃素提取液進(jìn)行HPLC檢測(cè)時(shí)，金絲桃素的提取效果理想 ,有利于金絲桃素的分離與制取。金絲桃素對(duì)于光和熱表現(xiàn)不穩(wěn)定，在提取、分離、純化、精制金絲桃素的整個(gè)工藝過(guò)程中，每一個(gè)環(huán)節(jié)應(yīng)始終將溫度控制在50條件以下，而且避光操作。若要保存，最好將其溶于乙醇中在室溫或4的條件于棕色瓶中避光保存。 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