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大連海洋大學(xué)本科畢業(yè)論文 畢 業(yè) 論 文 論文題目:吡咯喹啉醌對大型溞耐饑餓能力的影響學(xué) 院: 水產(chǎn)與生命學(xué)院 專 業(yè): 生物技術(shù) 年 級: 2008級 姓 名: 鄭 瑋 指導(dǎo)教師: 張 鵬 職 稱: 講師（博士） （2012年6月）目 錄摘要1Abstract.1引言.1.1吡咯喹啉醌研究概況11.2本研究的目的、意義12材料與方法22.1 藥品器具22.2 供試生物32.3 分組設(shè)計(jì)32.4 指標(biāo)測定32.5 統(tǒng)計(jì)分析53結(jié)果93.1 死亡時(shí)間93.2 死亡數(shù)量93.3 致死時(shí)間103.4 運(yùn)動(dòng)能力.4 結(jié)論11參考文獻(xiàn)13致謝14 吡咯喹啉醌對大型溞耐饑餓能力的影響鄭瑋（大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院）摘 要：吡咯喹啉醌（PQQ）是一種小分子醌類化合物，由某些細(xì)菌合成作為細(xì)菌脫氫酶氧化還原反應(yīng)的輔助因子，廣泛存在于各種生物組織中，且發(fā)揮著多重的生理功效。本研究選用淡水生態(tài)系統(tǒng)中常見的浮游動(dòng)物大型溞作為受試物種，構(gòu)建饑餓脅迫生理環(huán)境，通過死亡指標(biāo)考察PQQ對其耐饑餓能力的影響。結(jié)果表明，在饑餓脅迫環(huán)境下，低、中、高劑量PQQ組（0.1、0.5、1mM）均可不同程度地提高大型溞抗饑餓脅迫的能力，與對照組相比，生存時(shí)間最高增加至2倍，每天平均死亡的溞體數(shù)量亦明顯降低，但饑餓前期作用效果不如中后期階段。因此，PQQ能夠顯著提高大型溞抗饑餓的能力，極大地延長其生存時(shí)間，其保護(hù)作用主要發(fā)揮在饑餓的中期生理階段。關(guān)鍵詞：吡咯喹啉醌；饑餓脅迫；大型溞；生理保護(hù)Effect of Pyrroloquinoline quinone on the ability against starvation stress in Daphnia magna Zheng Wei(College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University)Abstract: Pyrroloquinoline quinone (PQQ) is a small molecular quinone compound. As designated in earlierliterature, this bacterially synthesized quinone acts as a redox cofactor of bacterial dehydrogenases, exists inthe various organism tissues, and exerts various physiological effects. In this study, we chose Daphnia magnaas a representative aquatic animal species to investigate the effect of PQQ on its ability against starvation stressthrough the death indexes. The results showed that different concentrations of PQQ (0.1、0.5、1mM) couldpromote the ability of against starvation stress. Compared to the control group, the survival time of Daphniamagna in the 1mM PQQ group increased to 2 times. Also, the daily death number averagely significantlydecreased due to the use of PQQ,. Therefore, PQQ could clearly increase the ability of Daphnia magnaagainst starvation stress, and apparently prolong its survival time. This protection effect might exert on themid-phase starvation stage.Keywords: Pyrroloquinoline quinone; starvation-stress; Daphnia magna; Physiological protection1引 言1.1吡咯喹啉醌研究概況吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ），化學(xué)名稱4,5-二氫-4,5-二氧-1氫-吡咯并（2,3-f）喹啉-2,7,9-三羧酸，是一種不同于煙酰胺核苷酸（NAD+和NADP+）和黃素核苷酸（FAD和FMN）的新有機(jī)輔酶。上世紀(jì)60年代，PQQ在某些微生物代謝過程中被發(fā)現(xiàn)。1979年，Duine和Salisbury等采用電子自旋共振、核磁共振、質(zhì)譜、X射線晶體衍射等技術(shù)，才確定其結(jié)構(gòu)式并命名PQQ1。圖1.1 PQQ的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1.1 The chemical structure of PQQ研究證實(shí)，PQQ由某些細(xì)菌產(chǎn)生，通過與Ca2+或Mg2+形成配位鍵連接于酶蛋白上，參與電子在醌酶內(nèi)的傳遞，協(xié)助醌酶完成特定的生物學(xué)功能，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中的鄰位醌和3個(gè)羧基是其重要的功能基團(tuán)。在植物、動(dòng)物以及人體組織內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了痕量水平的PQQ。目前認(rèn)為，動(dòng)物和人體腸道菌群不能合成PQQ或合成量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足機(jī)體需要，其體內(nèi)的PQQ主要是通過飲食途徑外源性獲得2。國外對PQQ生物學(xué)功能的研究開展較早，總結(jié)起來有四大方面的作用：（1）刺激微生物、植物、動(dòng)物及人體細(xì)胞生長；（2）動(dòng)物生長、發(fā)育和繁殖必需的營養(yǎng)因子；（3）清除多余的自由基；（4）提供神經(jīng)營養(yǎng)與保護(hù)作用。其中，后兩方面的研究成果最為全面豐富3-5。我國對PQQ的研究尚處于起步階段，且絕大多數(shù)人對其尚缺乏了解。國內(nèi)外同行均已達(dá)成共識(shí)，PQQ各項(xiàng)功能的發(fā)揮與線粒體密切相關(guān)。張鵬等通過流式細(xì)胞術(shù)研究發(fā)現(xiàn)PQQ能夠抑制線粒體膜電位降低，維持Bcl-2蛋白水平，進(jìn)而阻斷caspase級聯(lián)反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡6。在氧化應(yīng)激方面，PQQ能夠有效清除O2、OH和H2O2等ROS，明顯抑制了脂質(zhì)過氧化損傷作用，同時(shí)也維持了胞內(nèi)SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶活力以及GSH水平7。這些生理作用都與線粒體功能的調(diào)控有關(guān)。饑餓生理的典型特征是線粒體功能的極度活躍。饑餓信號(hào)刺激下線粒體功能被高度激活為研究PQQ與線粒體的關(guān)系提供了良好的契機(jī)，深入開展PQQ在饑餓生理領(lǐng)域的研究工作必將成為未來國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一。1.2 本研究的目的、意義PQQ獨(dú)特的理化性質(zhì)和多樣的生理功效引起了國內(nèi)外營養(yǎng)學(xué)家和藥理學(xué)家的廣泛關(guān)注。在治療帕金森癥、老年癡呆癥、中風(fēng)、心臟病、肝病、骨質(zhì)疏松、癌癥以及營養(yǎng)價(jià)值等方面，對PQQ的深入研發(fā)將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。然而，目前PQQ的研究領(lǐng)域都集中在陸地生物方面，對水生生物如何發(fā)揮其生理功效尚有待探索。水是生命之源，生命起源于水中，開展PQQ對水生生物生理功效的研究將有助于更全面地認(rèn)識(shí)其生理作用的機(jī)制，并為其在水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物的健康養(yǎng)殖和病害防治上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。因此，本研究選用淡水生態(tài)系統(tǒng)中常見的浮游動(dòng)物大型溞作為受試物種，構(gòu)建饑餓脅迫生理環(huán)境，通過死亡指標(biāo)考察PQQ對其耐饑餓能力的影響，在完全排除餌料藻類食物干擾的情況下，探明大型溞這類典型的水生生物是否也對PQQ具有生理響應(yīng)，也為PQQ在饑餓生理?xiàng)l件下的作用效果提供科學(xué)依據(jù)。2材料和方法2.1藥品器具PQQ（純度98%）購于Sigma公司，使用時(shí)用超純水溶解，一次性無菌注射器和0.22m孔徑的無菌濾膜過濾后，4C冰箱貯存?zhèn)溆谩?4孔細(xì)胞培養(yǎng)板購于Costar公司。光學(xué)顯微鏡、載玻片、培養(yǎng)皿、光波爐、燒杯、吸管、三角燒瓶等實(shí)驗(yàn)器具由水生生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。2.2供試生物大型溞Daphnia magna由水生生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，在室溫條件下自然光照培養(yǎng)，培養(yǎng)用水為滅菌后的自來水。選取一只體大健壯的懷卵個(gè)體進(jìn)行孤雌繁殖后移出母溞繼續(xù)培養(yǎng)幼溞, 如此反復(fù)操作直至達(dá)到滿足試驗(yàn)要求的幼溞數(shù)量。其間以室溫自然光照下培養(yǎng)的斜生柵藻Scenedesmus obliquus作為餌料，每天投餌一次。2.3分組設(shè)計(jì)選取48只出生后6-24 h的活躍幼溞為實(shí)驗(yàn)材料，放于50ml燒杯中饑餓24h排空腸道后，隨機(jī)挑選幼溞置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行分組，每孔放一只溞。試驗(yàn)共設(shè)低、中、高3個(gè)PQQ濃度，分別為0.1、0.5、1m，全饑餓組加入相應(yīng)體積的無菌水。在室溫自然光照下培養(yǎng)，每天觀察記錄溞的死亡情況，并觀察其活動(dòng)情況。2.4測定指標(biāo)每隔24h記錄死亡的個(gè)體數(shù)量，以溞完全停止活動(dòng)為死亡標(biāo)志。通過死亡數(shù)計(jì)算下列各項(xiàng)死亡指標(biāo)：（1）開始死亡時(shí)間（ILT）：開始出現(xiàn)死亡個(gè)體時(shí)所需的天數(shù)；（2）最長存活時(shí)間（FLT）：個(gè)體全部死亡時(shí)所需的天數(shù)；（3）日平均死亡數(shù)（MLN）：平均每天死亡的個(gè)體數(shù)，即MLN=TN/FLT，其中TN表示每組溞總數(shù)；（4）日累加死亡數(shù)（ALN）：至當(dāng)日為止累計(jì)死亡的個(gè)體總數(shù)，即ALN=Nn+ Nn-1，其中Nn-1代表至第n-1天死亡的個(gè)體總數(shù)，Nn代表第n天死亡的個(gè)體數(shù)，n；（5）半數(shù)致死時(shí)間（LT50）：溞個(gè)體死亡一半時(shí)所需要的時(shí)間；（6）全部致死時(shí)間（LT100）：溞個(gè)體全部死亡時(shí)所需要的時(shí)間；2.5統(tǒng)計(jì)分析采用EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖?；贐liss法，應(yīng)用SPSS 11.5的Probit模塊分析計(jì)算LT50值和LT100值。3結(jié)果3.1死亡時(shí)間溞死亡時(shí)間的數(shù)據(jù)見表3.1，從表3.1可以看出，全饑餓組開始死亡時(shí)間出現(xiàn)在第2天，而低、中、高劑量PQQ組則均在第3天出現(xiàn)死亡個(gè)體。全饑餓組最長存活時(shí)間是5天，而低、中、高劑量PQQ組則分別是7、8、10天。表3.1 PQQ對大型溞死亡時(shí)間的影響Table 3.1 Effect of PQQ on the death time of Daphnia magna全饑餓組低量PQQ組中量PQQ組高量PQQ組ILT(d)2333FLT(d)578103.2死亡數(shù)量溞死亡數(shù)量的數(shù)據(jù)見圖3.1、3.2。從圖3.1可以看出，全饑餓組日平均死亡數(shù)2.4只，加入低、中、高不同劑量的PQQ后，日平均數(shù)死亡數(shù)分別降低為1.7、1.5、1.2只，呈現(xiàn)隨PQQ濃度升高死亡數(shù)逐漸降低的趨勢。圖3.1 PQQ對大型溞日平均死亡數(shù)的影響Figure 3.1 Effect of PQQ on the MLN of Daphnia magna圖3.2 PQQ對大型溞日累計(jì)死亡數(shù)的影響Figure 3.2 Effect of PQQ on the ALN of Daphnia magna 從圖3.2可以看出，無論是全饑餓組還是PQQ干預(yù)組，第2天至第4天日累計(jì)死亡數(shù)急劇升高，第四天以后全饑餓組死亡趨勢仍在升高，而PQQ干預(yù)組則逐漸趨于減緩。隨著PQQ濃度的增加，減緩死亡的趨勢愈發(fā)明顯，且前期作用較強(qiáng)，而后期作用逐漸減弱。3.3致死時(shí)間溞致死時(shí)間的數(shù)據(jù)見表3.2，從表3.2可以看出，不同濃度PQQ均可延長LT50值，但與全饑餓組相比，差異并不明顯，且各組之間也無明顯區(qū)別。不同濃度PQQ也能延長LT100值，與全饑餓組相比，差異較為明顯，且隨著PQQ濃度的升高，差異愈發(fā)明顯，高量PQQ組LT100值達(dá)到全饑餓組的2倍。表3.2 PQQ對大型溞致死時(shí)間的影響Table 3.2 Effect of PQQ on the lethal time of Daphnia magna全饑餓組低量PQQ組中量PQQ組高量PQQ組LT50 (d)2.483.853.403.66LT100 (d)5.167.988.0111.383.4運(yùn)動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)期間對溞的運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，隨著饑餓時(shí)間的延長，全饑餓組幼溞運(yùn)動(dòng)能力減弱，表現(xiàn)在趴伏于水底靜止時(shí)間較長，而PQQ處理組幼溞運(yùn)動(dòng)能力則明顯強(qiáng)于全饑餓組，但PQQ各組之間的運(yùn)動(dòng)能力尚無法通過觀察得出較為客觀的結(jié)論。4討論水生動(dòng)物在生境中受到食物分布不均、季節(jié)更替或環(huán)境變化等影響，經(jīng)常會(huì)面臨食物短缺而受到饑餓脅迫，造成十分嚴(yán)重的生理損傷。浮游動(dòng)物作為生物活餌料因饑餓導(dǎo)致營養(yǎng)丟失是導(dǎo)致魚苗生長緩慢和高死亡率的重要原因8-9。饑餓生理的典型特征是線粒體功能的極度活躍。線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的主要場所，也是胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要樞紐，對細(xì)胞的增殖、分化與死亡都起到了調(diào)節(jié)作用。長期饑餓下動(dòng)物死亡的原因往往并不是能源物質(zhì)的耗竭，而是因?yàn)橥饨缒芰抗?yīng)不足，迫使機(jī)體加速代謝自身儲(chǔ)備的能源物質(zhì)以滿足能量需求，但同時(shí)也造成了線粒體內(nèi)自由基的過量生成，從而促發(fā)胞內(nèi)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致機(jī)體因內(nèi)環(huán)境紊亂和功能喪失而死亡10-12。因此，饑餓脅迫下通過調(diào)節(jié)線粒體能量代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制氧化損傷和細(xì)胞凋亡，即可有效減輕饑餓脅迫造成的損傷，延長動(dòng)物的生存時(shí)間。研究表明PQQ對真核生物線粒體的數(shù)量和質(zhì)量都會(huì)產(chǎn)生明顯的作用。飲食中缺乏PQQ，會(huì)造成斷奶后幼鼠肝中線粒體數(shù)量減少2030%，線粒體質(zhì)量和功能上的紊亂直接造成了葡萄糖和氨基酸代謝發(fā)生障礙，使得血漿中葡萄糖和氨基酸水平升高13。PQQ能夠提高DJ-1的抗氧化應(yīng)激活性，進(jìn)而通過Nrf1、Nrf2和mt TFA等信號(hào)分子共同作用，促進(jìn)線粒體生物發(fā)生14。Bychek等研究發(fā)現(xiàn)大型溞可以耐受24小時(shí)的短期饑餓而不耗損的體內(nèi)脂類物質(zhì)15，但長期饑餓下溞體內(nèi)的生理變化特征卻不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，PQQ能夠顯著延長大型溞在饑餓狀態(tài)下的生存時(shí)間，與對照組相比，1mM PQQ甚至可以使其生存時(shí)間延長2倍。從日平均死亡數(shù)據(jù)來看，PQQ濃度越高，每天死亡溞體的數(shù)量越少，即PQQ提高溞體抗饑餓的能力呈現(xiàn)出濃度依賴性。但是從開始死亡時(shí)間和半數(shù)致死時(shí)間的數(shù)據(jù)來看，PQQ似乎并不能有效地在饑餓前期階段減緩溞類個(gè)體的死亡，這一點(diǎn)從日累計(jì)死亡數(shù)據(jù)中也可以看出。由此，我們認(rèn)為PQQ在一定濃度范圍內(nèi)可以有效地減輕饑餓脅迫對溞體造成的損傷，提高其生存能力，但其作用的發(fā)揮主要是在饑餓中期階段，而并非是在饑餓前期。在饑餓后期，隨著溞體內(nèi)環(huán)境急劇紊亂，熵值不斷升高，PQQ的保護(hù)作用也逐漸失效，導(dǎo)致死亡不可避免。5結(jié)論 在饑餓脅迫環(huán)境下，PQQ能夠顯著提高大型溞抗饑餓的能力，極大地延長其生存時(shí)間。 PQQ的這種保護(hù)作用主要發(fā)揮在饑餓的中期生理階段，前期和后期作用似乎并不明顯。關(guān)于PQQ在饑餓生理保護(hù)方面的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn) (References) 1 Salisbury SA, Forrest HS, Cruse WB. 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