實(shí)驗(yàn)3質(zhì)粒DNA的提取與鑒定.ppt

質(zhì)粒DNA的提取、定量 酶切與鑒定,/sfzx/,南方醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 Expertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biology,尹莉 E-mail:qsdyl_2006163.com,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,提取原理 操作步驟,計(jì)算方法 操作步驟,質(zhì)粒DNA,定量,酶切原理 酶切步驟,酶切,電泳原理 電泳步驟,電泳,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的方法 了解紫外吸收法檢測(cè)DNA濃度與純度的原理、方法 學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳操作,第一部分 質(zhì)粒DNA提取與定量 Extraction and Quantitation of Plasmid DNA,獨(dú)立于細(xì)菌染色體外，能獨(dú)立自主復(fù)制的閉合環(huán)狀DNA分子； 存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多,質(zhì)粒（lasmid）,定 義,堿裂解法 煮沸裂解 羥基磷灰石柱層析法 質(zhì)粒DNA釋放法 酸酚法等,方 法,選擇哪一種方法主要取決以下幾個(gè)因素： 質(zhì)粒的大小 大腸桿菌菌株 裂解后用于純化的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)要求,分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟： 培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增； 收集和裂解細(xì)菌； 分離質(zhì)粒DNA,分離質(zhì)粒DNA三步曲,分離 質(zhì)粒,收集 裂解 細(xì)菌,質(zhì)粒 擴(kuò)增,基本步驟,基本原理,1、堿裂解法,基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異；,高堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性；,當(dāng)以高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性并保存在溶液中，染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心形成沉定去除；,原理示意圖,2、離心層析柱,基本原理,硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，不吸附蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)； 通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除； 低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫；,（一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋 （二）材料：含pMD18-T質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 （三）試劑： LB培養(yǎng)基（液體、固體） Bioteke質(zhì)粒提取試劑盒（北京百泰克，中國）,溶液 P1 溶液 P2 溶液 P3 去蛋白液 PE 漂洗液 WB 洗脫液 EB,儀器材料,50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L TrisCl(pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 作用：分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活 注意：菌液一定懸浮均勻，不能有結(jié)塊,溶液 I,0.2 mol/ L NaOH 1% SDS 作用：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。 注意：時(shí)間勿太久，動(dòng)作要溫柔，輕輕顛倒幾次,溶液 II,5mol/L 乙酸鈉 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 作用：酸性條件下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白-SDS線性DNA沉淀，Na可中和DNA 注意：復(fù)性時(shí)間不宜過長,溶液 III,菌液,離心12000rpm,1min,棄上清,短時(shí)離心,徹底棄上清,加250l 溶液P1,旋渦振蕩,懸浮沉淀,加250l 溶液P2,加400l 溶液P3,顛倒,顛倒數(shù)次,放置3-5min,離心13000rpm,10min,取上清700l加到吸附柱中,離心,13000rpm,1min,棄濾液，加入500l去蛋白液,13000rpm,1min,離心,（1）,（2）,（3）,（4）,（5）,（6）,（7）,（8）,（9）,棄濾液，加入500l漂洗液WB,（10）,離心,13000rpm,1min,棄濾液，加入500l漂洗液WB,（11）,離心,13000rpm,1min,棄濾液,（12）,離心,13000rpm,2min,放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間加70l洗脫液EB,離心,13000rpm,1min,（13）,-20保存?zhèn)溆?操作步驟,第二部分 酶切鑒定 DNA Restriction Enzyme Digestion,在一個(gè)潔凈的1.5mlEP管中按順序依次加入下述試劑,移液槍輕輕混勻(避免產(chǎn)生氣泡),37水浴1.5h,反應(yīng)體系,限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease）是DNA操作過程中所使用的基本工具。 特異性地結(jié)合于一段被稱為限制酶識(shí)別序列的特殊DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并在此切割雙鏈DNA。 分子克隆中常用的為II類限制酶，其識(shí)別位點(diǎn)長度為4、5或6個(gè)核苷酸的反向重復(fù)序列。,限制性內(nèi)切酶,限制酶的切割點(diǎn)因酶而異，有的在對(duì)稱軸處切割, 產(chǎn)生平末端的DNA片段,如HaeIII,有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端，如EcoR.,限制性內(nèi)切酶, 平末端 在識(shí)別順序的中心對(duì)稱軸處切割,5 G-G-C-C 3 3 C-C-G-G 5,5 G-G 3 C-C,-C-C 3 -G-G 5,限制性內(nèi)切酶, 3端粘性末端 在識(shí)別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對(duì)稱軸的3末端切割。,5 G-G-T-A-C-C 3 3 C-C-A-T-G-G 5,G-G-T-A-C 3 C,C 3 C-A-T-G-G,限制性內(nèi)切酶,5 G-A-A-T-T-C 3 3 C-T-T-A-A-G 5,G C-T-T-A-A 5,5 A-A-T-T-C G,5端粘性末端 在識(shí)別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對(duì)稱軸的5末端切割。,5 A-A-G-C-T-T 3 3 T-T-C-G-A-A 5,A T-T-C-G-A 5,5 A-G-C-T-T A,限制性內(nèi)切酶,雙酶切限制酶的選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER 如果有一種buffer能同時(shí)使2種酶的活力都超過70%的話，就可以用這種buffer作為反應(yīng)buffer； 如果兩種酶廠家不同無法查時(shí)可比較其buffer成份，相似的話可以考慮各取一半中和。,限制性內(nèi)切酶,Buffer的選擇查閱內(nèi)切酶供應(yīng)商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表,酶量的選擇任何時(shí)候2種酶的總量不能超過反應(yīng)體系的1/10體積，而且最大反應(yīng)體系最好不要小于20 ul。 以TAKARA的為例，其對(duì)1單位酶的定義如下：在50 l 反應(yīng)液中，30溫度下反應(yīng)1小時(shí)，將1 g 的DNA完全分解的酶量定義為1個(gè)活性單位(U)。 而該酶濃度約為15單位/微升，在除外酶降解的 因素外該酶可分解15g的DNA。,限制性內(nèi)切酶,插入400bp DNA片段,質(zhì)粒大小為: 2692bp+400bp=3092bp,酶切片段大小為 ?,影響酶切反應(yīng)的因素,底物DNA的純度：主要污染DNA 的某些物質(zhì)，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反應(yīng); 反應(yīng)系統(tǒng)：主要是反應(yīng)緩沖液中的離子強(qiáng)度,如NaCl和Mg2+, 合適離子強(qiáng)度可以激發(fā)酶切反應(yīng); 反應(yīng)體積：一般應(yīng)盡量小，且酶切反應(yīng)中甘油濃度應(yīng)低于5%; 保溫時(shí)間與溫度：溫度改變會(huì)使酶識(shí)別錯(cuò)誤;,限制性內(nèi)切酶,紫外光吸收法,原理：1,物質(zhì)在光的照射下會(huì)產(chǎn)生對(duì)光的吸收效應(yīng) 2,而且物質(zhì)對(duì)光的吸收是具有選擇性的 3,各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜,因此不同波長的單色光通過溶液時(shí)其光的能量就會(huì)被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系.,定量檢測(cè),計(jì)算方法: 因?yàn)榻M成核酸的堿基(G,A,T,C）在260nm處具有強(qiáng)吸收峰，所以通過測(cè)定260nm的吸收峰即可對(duì)DNA進(jìn)行定量。,定量檢測(cè),記錄OD260值，通過計(jì)算確定DNA濃度，公式如下: 質(zhì)粒DNA(g /ml)=50(OD260) 稀釋倍數(shù),注意:我們接下來要用的eppendorf公司生產(chǎn)的紫外分光光度計(jì),會(huì)根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)自動(dòng)算出質(zhì)粒DNA的最終濃度和Ratio值.,定量檢測(cè),根據(jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)比值估計(jì)核酸的純度（Ratio=A260/A280）,Ratio= 1.8 DNA樣品較純,符合實(shí)驗(yàn)要求 Ratio1.9 RNA污染 Ratio1.6 有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染,定量檢測(cè),實(shí)驗(yàn)儀器,定量檢測(cè),紫外分光光度計(jì),比色杯,數(shù)據(jù)處理,定量檢測(cè),菌體老化 堿裂解不充分 菌體中無質(zhì)粒 溶液使用不當(dāng),請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng) 可減少菌體用量或增加溶液的用量 不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。檢查抗生素使用濃度是否正確。 溶液在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，置于37保溫片刻直至溶解為清亮的溶液。,問題一：未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低，如何解決？,原 因,對(duì) 策,常見問題,混有蛋白 混有RNA 混有基因組DNA,不要使用過多菌體。重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì) 加入RNaseA室溫放置一段時(shí)間 加入溶液II 和III后防止劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解，培養(yǎng)時(shí)間不要超過16小時(shí)。,問題二：質(zhì)粒純度不高，如何解決？,原因,對(duì) 策,常見問題,定量檢測(cè),第三部分 瓊脂糖凝膠電泳 DNA Agarose Gel Electrophoresis,天然瓊脂（Agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（Agarose ，約占80）及瓊脂膠（Agaropectin）組成。 瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。 瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。瓊脂糖透明無紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。,定 義,瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度 DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng). DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶(遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系).,實(shí)驗(yàn)原理,1、 DNA的分子大小 2、 瓊脂糖濃度 3、 DNA分子的構(gòu)象 4、 電源電壓 5、 嵌入染料的存在 6、 離子強(qiáng)度影響,影響遷移速率因素,分離范圍,.電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)呈藍(lán)紫色；二甲苯晴呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。 Gelview TBE 瓊脂糖 5、 DNA Marker 5000,實(shí)驗(yàn)材料,溴化乙錠(EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴鹽)，可與DNA結(jié)合,在紫外光照射下呈現(xiàn)紅橙熒光,有致癌性. Gelview: 是一種新型核酸染料,可與DNA分子形成復(fù)合物，能產(chǎn)生極強(qiáng)的熒光信號(hào)，其靈敏度比EB高, 且熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比熒光,在紫外光照射下呈現(xiàn)綠色熒光.,常用染料,實(shí)驗(yàn)材料,是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝膠電泳時(shí)，加樣用做對(duì)比來檢測(cè)瓊脂糖凝膠是否有問題。,DNA Marker,應(yīng)選擇在目標(biāo)片段大小附 近ladder較密的marker，這樣對(duì)目標(biāo)片段大小的估計(jì)較準(zhǔn)確。,實(shí)驗(yàn)材料,電泳緩沖液,4 保存?zhèn)溆?實(shí)驗(yàn)材料,凝膠準(zhǔn)備,膠床準(zhǔn)備,鋪膠,靜置,膠床置于電泳槽中,加電泳緩沖液,拔梳子,上樣,電泳,取出凝膠,拍照,實(shí)驗(yàn)步驟,加樣量 質(zhì)粒DNA： 10 *loading buffer +4l 酶切產(chǎn)物：10 *loading buffer +2l 用移液槍吹打混勻（避免產(chǎn)生氣泡）后各取10l點(diǎn)樣 點(diǎn)樣要集中、迅速，否則樣品會(huì)揮發(fā)，影響成像 每組點(diǎn)兩種樣品：質(zhì)粒DNA和酶切產(chǎn)物兩條帶 每組記清自己點(diǎn)樣的位置,倒膠時(shí)把握好膠的溫度，不要高于60 ，否則溫度太高會(huì)使制板變形 膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要豎直向上，不要弄壞點(diǎn)樣孔 電泳前，確認(rèn)樣品孔位于電場(chǎng)負(fù)極； 點(diǎn)樣時(shí)槍頭下伸，點(diǎn)樣孔內(nèi)不能有氣泡，緩沖液不要太多 Geldview有毒，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境，膠勿亂扔 紫外線照射不要太久,