HBVcccDNA及其意義.ppt

HBVcccDNA及其意義,貴州省人民醫(yī)院感染科 湯正明,2006-08-15,1,2006.08.15,感染科,2006-08-15,2,臨床上我們常常遇到以下問題： 慢性乙肝難以治愈 抗病毒治療過程中常常發(fā)生藥物耐受 抗病毒治療后容易復發(fā) 分子生物學研究表明，HBVcccDNA在病毒持 續(xù)感染、抗病毒治療后的再度活躍復制以及藥物耐受方面起著至關(guān)重要的作用。 現(xiàn)就 HBVcccDNA乙肝病毒共價閉合環(huán)狀DNA的研究進展進行簡單的闡述。這是我的學習匯報，希望各位專家批評指正。,感染科,為什么？,2006-08-15,3,一、HBV感染初期cccDNA的形成 二、HBVcccDNA的穩(wěn)定性 三、核苷類似物不能阻止初始cccDNA的形成 四、HBVcccDNA檢測方法 五、慢性乙肝患者cccDNA檢測的意義 六、如何清除HBVcccDNA？ 七、 cccDNA在抗病毒治療研究中的應(yīng)用前景,一、HBV感染初期cccDNA的形成,HBVcccDNA存在于肝細胞核內(nèi)，是病毒成功感染肝細胞的標志，也是慢性乙型肝炎持久存在的關(guān)鍵。 其形成過程包括： HBV顆粒與肝細胞膜接觸，被細胞以內(nèi)吞作用攝入，病毒脫殼后核殼體向肝細胞核轉(zhuǎn)移，釋放松弛的環(huán)狀DNA（relaxe circular DNA,rcDNA)進入細胞核。,2006-08-15,4,感染科,2006-08-15,5,rcDNA的正鏈在DNA聚合酶作用下進一步延長形成全長的rcDNA，正負鏈末端各自連接并構(gòu)象發(fā)生改變形成cccDNA，最后在核小體內(nèi)組合形成非整合狀態(tài)的微型染色體。,感染科,2006-08-15,6,細胞核內(nèi)的cccDNA作為復制模板轉(zhuǎn)錄前基因組RNA和其他基因的mRNA。前基因RNA被轉(zhuǎn)運至胞漿，與病毒核心蛋白以及P蛋白組裝成核殼體。病毒DNA聚合酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，以前基因組RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄子代DNA ，核殼體成熟。,感染科,2006-08-15,7,成熟的核殼體有兩個去向： 部分再進入細胞核重新形成cccDNA，不斷補充核內(nèi)cccDNA池； 部分進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與病毒蛋白組裝成病毒顆粒向細胞外分泌，感染新的肝細胞。 病毒cccDNA的產(chǎn)生也有兩個途徑，既可由肝細胞內(nèi)已有的病毒在復制周期中產(chǎn)生，也可由新感染的肝細胞產(chǎn)生。如圖所示。,感染科,2006-08-15,8,感染科,2006-08-15,9,感染科,HBV復制過程,2006-08-15,10,感染科,2006-08-15,11,復制方式： HBV吸附 cccDNA 轉(zhuǎn) 2.1KbmRNA 外衣殼蛋白 錄 內(nèi)衣殼蛋白 3.5KbmRNA （前基因組） 反轉(zhuǎn)錄HBVDNA負鏈 復制+DNA 組裝與釋放,感染科,2006-08-15,12,動物實驗證實，處于穩(wěn)定感染的肝細胞內(nèi)大約有30-50個cccDNA拷貝。對慢性乙型肝炎患者肝組織內(nèi)cccDNA實時定量檢測，平均每個感染細胞含有33拷貝，與動物實驗結(jié)果相符。 穩(wěn)定感染的肝細胞核內(nèi)cccDNA一般維持在一定水平，既滿足病毒復制需要，又不對細胞產(chǎn)生毒性。,感染科,2006-08-15,13,這一調(diào)節(jié)機制通過病毒胞膜蛋白負反饋機制來實現(xiàn)，前C區(qū)蛋白發(fā)生變異可導致cccDNA大量擴增，并引起細胞死亡。 cccDNA的穩(wěn)定對維持細胞的長期感染狀態(tài)起決定作用。,感染科,2006-08-15,14,cccDNA和rcDNA在結(jié)構(gòu)和理化特性上有3點不同： 1.rcDNA在正鏈與負鏈上均有缺口或缺刻，只是部分區(qū)域互補才能形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但非超螺旋結(jié)構(gòu)，而cccDNA兩條鏈均是完整的，兩者共價互補，形成超螺旋結(jié)構(gòu)。,感染科,2006-08-15,15,2.rcDNA 能與蛋白共價結(jié)合，cccDNA則不能。 3.由于缺口或缺刻的存在，rcDNA 可以被一些核酸酶降解成核苷酸或單核苷酸，而cccDNA則由于是超螺旋且雙鏈結(jié)構(gòu)均完整，一般不會被上述酶降解。,感染科,二、 HBVcccDNA的穩(wěn)定性,對HBVcccDNA半衰期的認識來自動物實驗。核苷類似物可以抑制胞漿內(nèi)病毒DNA的逆轉(zhuǎn)錄，從而阻斷胞漿內(nèi)病毒DNA進入細胞核內(nèi)再形成cccDNA，使人們可以在動物實驗模型中研究cccDNA半衰期。,2006-08-15,16,感染科,2006-08-15,17,Addisson研究發(fā)現(xiàn)，拉米夫定、雙脫氧鳥苷前體聯(lián)合抗病毒治療能有效抑制DHBV的復制，1周后斑點雜交法檢測表明，血清DHBVDNA下降至檢測水平以下，肝組織中cccDNA呈指數(shù)下降，其半衰期為35-57天。,感染科,2006-08-15,18,Moraleda等通過土撥鼠原代細胞抗病毒研究結(jié)果顯示，cccDNA 的半衰期很長，其清除依賴于感染細胞的死亡。 但是也有相反的報道。 盡管用人的原代肝細胞感染HBV，可以觀察到cccDNA的合成和緩慢增加，但到目前為止還沒有原代人肝細胞中cccDNA的半衰期的報道。,感染科,三、核苷類似物不能阻止 初始cccDNA的形成,Delmas等研究發(fā)現(xiàn)，阿德福韋能降低培養(yǎng)細胞內(nèi)DHBVDNA(包括cccDNA)水平，說明病毒感染后起始的病毒基因組向cccDNA的轉(zhuǎn)換在阿德福韋存在的情況下仍能發(fā)生，但擴增合成cccDNA的過程被抑制。,2006-08-15,19,感染科,2006-08-15,20,Kock等研究發(fā)現(xiàn)，阿德福韋、拉米夫定都可以部分抑制病毒感染后初始的cccDNA 轉(zhuǎn)換，前者作用更強，但是，即使聯(lián)合用藥也不能完全抑制初始cccDNA 的轉(zhuǎn)換。 因此，說明抗病毒藥物治療期間HBV仍有能力感染新的肝細胞，給抗病毒治療帶來困難，因而對慢乙肝患者需要長期使用抗病毒藥物治療。,感染科,四、HBVcccDNA檢測方法,1.細胞內(nèi)cccDNA的抽提與純化 最常用的抽提細胞內(nèi)cccDNA的方法是蛋白質(zhì)去污劑沉淀法，其原理是基于rcDNA和cccDNA與蛋白質(zhì)結(jié)合能力的差異。rcDNA能與蛋白質(zhì)共價結(jié)合，與絕大多數(shù)細胞染色體DNA一起形成沉淀，而cccDNA不能與蛋白質(zhì)結(jié)合故游離于上清中，用酚氯仿抽提上清即可得到cccDNA。根據(jù)繆曉輝等的經(jīng)驗，該方法的主要缺點是：抽提較為費時，一般需要4-5小時；酚氯仿抽提環(huán)節(jié)多、得率不高；對于凍存的富集細胞（pellet）難以充分裂解，單裂解這一步可能需要3-4小時甚至更長時間。此外，在上清中實際仍然含有少量的rcDNA，而在沉淀中實際上也存在著一部分cccDNA。,2006-08-15,21,感染科,2006-08-15,22,為進一步分離cccDNA、rcDNA和單鏈DNA，可以對抽提產(chǎn)物進行純化。以酶切法最為常用。外切核酸酶是一種35外切酶，對帶有鈍端、5突出端或有缺口的雙鏈具有特異性，而不能降解帶有3突出端（至少4個堿基）的雙鏈DNA。綠豆核酸酶則以內(nèi)切方式降解單鏈DNA或RNA，而保持雙鏈DNA的完整性（二者的比活性1000），可用于選擇性切除雙鏈DNA的突出單鏈末端，以及切除單鏈DNA或RNA。也可單用綠豆核酸酶酶切rcDNA，或先用外切核酸酶將rcDNA降解成單鏈，然后再用綠豆核酸酶酶切。,感染科,2006-08-15,23,該方法也有其缺點：如抽提產(chǎn)物被稀釋，降低了檢測敏感度；綠豆核酸酶的反應(yīng)緩沖液對PCR反應(yīng)有抑制作用等。 繆曉輝等嘗試用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提去抽提HepG2.2.15細胞內(nèi)的cccDNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)得率比上述所用方法均要高，操作也簡便，所有操作在30分鐘內(nèi)就可完成。,感染科,2006-08-15,24,2 .cccDNA的定性檢測 既往絕大多數(shù)文獻報道的是用Southern blot對cccDNA進行定性檢測，該方法是分子生物學的經(jīng)典方法，但技術(shù)要求較高，敏感度低。,感染科,2006-08-15,25,近年來，也有較多文獻報道用PCR技術(shù)對cccDNA進行檢測。但是，由于PCR技術(shù)靈敏度極高，rcDNA和cccDNA的序列又具有高度的同源性，因此在用PCR技術(shù)檢測cccDNA時，必須確保只能擴增cccDNA而rcDNA不被擴增。目前利用rcDNA和cccDNA結(jié)構(gòu)上的差異可以解決這一問題。由于rcDNA的正鏈和負鏈上均存在缺口，故可以設(shè)計跨越兩個缺口的引物，使rcDNA不會被擴增，而cccDNA由于是完整的雙鏈結(jié)構(gòu)則可以被選擇性擴增。同時可設(shè)計另一對不跨越缺口的引物或只跨越一條鏈的缺口的引物同時檢測cccDNA和rcDNA圖1。Kock等成功地用這種選擇性PCR的方法在檢測感染細胞內(nèi)的cccDNA和rcDNA。,感染科,2006-08-15,26,此外，為進一步提高檢測的靈敏度，可用套式PCR(nested PCR)的方法。,感染科,2006-08-15,27,感染科,2006-08-15,28,但是有報道認為跨缺口引物對兩種DNA的選擇性不是絕對的，在PCR檢測cccDNA時，起始模板量不能過高，否則rcDNA也有可能被擴增，Kock等發(fā)現(xiàn)每個PCR反應(yīng)管中HBV DNA的量在1 pg（約6105拷貝）時能達到最佳的靈敏度與選擇性，因此在分析前應(yīng)估計標本中HBV DNA的量。雖然套式PCR更為靈敏，但由于需取PCR產(chǎn)物進行再次擴增，因此在操作中要注意防止PCR產(chǎn)物污染，避免假陽性。,感染科,2006-08-15,29,3 .cccDNA的定量檢測 在定性檢測的基礎(chǔ)上，可以進一步對cccDNA進行定量檢測。仍以PCR定量分析技術(shù)中，尤其是競爭PCR技術(shù)的敏感性和精確度高。方法是在PCR反應(yīng)管中加入一種已知量的、能與野生模板等效擴增的內(nèi)參照，內(nèi)參照是經(jīng)過突變處理的，其兩端尤其是引物退火區(qū)的序列與野生模板相同。PCR擴增后通過一定的方法將野生片段與突變片段區(qū)分開，分別計算其絕對量，或求出其相對比值，就可以推算PCR擴增以前野生模板的量。,感染科,2006-08-15,30,He等建立了實時熒光定量PCR檢測cccDNA的方法。他們將Taqman MGB探針設(shè)計在負鏈缺刻的下游，與負鏈互補結(jié)合。對cccDNA，在上游引物的引導下，Taq酶到達Taqman MGB探針所結(jié)合的位點，利用其53外切活性將探針切斷，3端的淬滅基團失去對5端的發(fā)光基團的抑制作用，從而產(chǎn)生熒光信號。每擴增一個cccDNA分子，就會產(chǎn)生一個熒光信號，PCR儀可對產(chǎn)生的信號進行實時監(jiān)測，根據(jù)熒光信號的強弱對cccDNA進行定量。對rcDNA，由于上游引物引發(fā)的鏈延伸不能通過負鏈缺刻，故不能使Taqman MGB探針被Taq酶切斷產(chǎn)生熒光信號。該方法的特異性比選擇性PCR進一步提高，可以消除高rcDNA背景可能產(chǎn)生的非特異性擴增。該方法的檢測低限可達100個拷貝，靈敏度比目前應(yīng)用的任何一種其它方法都高。所有檢測在2小時內(nèi)可完成。,感染科,2006-08-15,31,還有其他一些更為敏感的檢測方法，如Shao等報告的兩步法對cccDNA進行實時熒光定量。其設(shè)計與He等的方法有異曲同工之處，即都是利用rcDNA與cccDNA分子結(jié)構(gòu)上是否完整來有效地將二者區(qū)分開來，實現(xiàn)對cccDNA的特異性檢測。,感染科,2006-08-15,32,該方法在熒光探針位置的選擇上更符合熒光PCR的要求，即探針越靠近引物效果越好，這樣檢測到的熒光信號質(zhì)量和實時擴增曲線形狀可能更佳，而在He等的方法中探針與上游引物點之間的距離則至少需要在230個堿基以上。但是，該方法存在與套式PCR類似的缺點，即需要分兩步操作，單鏈延伸反應(yīng)管開蓋后極有可能造成產(chǎn)物污染。,感染科,五、慢性乙肝患者 cccDNA檢測的意義,第一，cccDNA可作為評價抗乙肝病毒藥物的新指標。 目前臨床上評價干擾素、核苷類似物這些抗乙肝病毒藥物時存在一個很大的問題。 即其評價指標主要是患者肝功能的改善與否、血清乙肝病毒DNA水平的變化以及肝組織的病理學改變等。,2006-08-15,33,感染科,2006-08-15,34,誠然，這些指標對臨床醫(yī)師判斷患者病情而言非常重要和實用，也是臨床醫(yī)師選用抗乙肝病毒藥物時的依據(jù)。 然而對于何時停用抗病毒藥物、停用抗病毒藥物后乙肝病毒是否會重新復制活躍導致乙肝復發(fā)，則缺乏客觀而有效的指標。,感染科,2006-08-15,35,開展肝細胞內(nèi)乙肝病毒cccDNA的動態(tài)定量監(jiān)測可以部分解決這個問題。 治療前后肝細胞內(nèi)乙肝病毒cccDNA含量的變化應(yīng)該納入到抗乙肝病毒藥物評價的指標體系中來，從一定意義上說，只有能夠徹底清除乙肝病毒cccDNA的藥物，才能算是真正“有效”的抗病毒藥物。,感染科,2006-08-15,36,第二，檢測乙肝病毒cccDNA可作為評價乙肝病毒是否能感染肝外組織的客觀指標之一。乙肝病毒不僅僅是一種嗜肝病毒，一些肝外組織中也可檢測到乙肝病毒DNA，如腎臟、胰腺以及外周血單個核細胞(PBMC)等。 早就有人發(fā)現(xiàn)乙肝病毒可以感染白細胞,而這種免疫細胞的感染似乎有利于病毒逃避免疫反應(yīng)，從而導致機體清除乙肝病毒的能力下降。關(guān)于PBMC能否被乙肝病毒感染的問題目前仍有爭議，其中一個重要的原因是沒有確立PBMC被感染的標準。 我們認為把PBMC細胞內(nèi)是否存在cccDNA作為判斷感染的標準是最可靠的。 cccDNA的形成是乙肝病毒的侵入細胞后在細胞內(nèi)進行復制的起始步驟，也是轉(zhuǎn)錄合成前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA)的前體，是建立病毒感染狀態(tài)的最重要標志，沒有cccDNA的形成也就沒有其后的一系列過程。,感染科,2006-08-15,37,Kock等用乙肝病毒去感染體外培養(yǎng)的PBMCs時，發(fā)現(xiàn)不能在細胞內(nèi)檢測到cccDNA，相反，如果轉(zhuǎn)染的是肝細胞，則非常容易檢測到cccDNA。此外，在乙肝患者的肝組織內(nèi)，能檢測到cccDNA和rcDNA，而在其PBMC中，則只能檢測到rcDNA。,感染科,2006-08-15,38,認為乙肝病毒是不能感染PBMC，即使PBMC中檢測到乙肝病毒，也只是血液的病毒DNA與PBMC表面牢固結(jié)合，不易被PBS等洗滌下來，抽提細胞所得到的病毒DNA其實并不存在于細胞內(nèi)；或病毒僅僅是被PBMC所“吸收”(absorption)，并沒有建立真正意義上的感染狀態(tài)。 這一實驗結(jié)果給我們很多啟發(fā)，也加深了對乙肝病毒感染的認識。,感染科,2006-08-15,39,第三，檢測乙肝病毒cccDNA可評價乙肝患者病情?？姇暂x等用選擇性熒光定量PCR對93例乙肝患者血清作回顧性分析時，發(fā)現(xiàn)24例患者血清HBVcccDNA呈陽性，其中慢性乙肝中度以上的病例占70%以上。,感染科,2006-08-15,40,繆曉輝等用選擇性熒光定量PCR對93例乙肝患者血清作回顧性分析時，發(fā)現(xiàn)24例患者血清cccDNA呈陽性，其中急性乙肝1例，慢性乙肝（輕度）6例，慢性乙肝（中度）6例，慢性乙肝（重度）3例，肝炎肝硬化2例，慢性乙肝（重型）6例，其中慢性乙肝（中度）以上的病例占70%以上。雖然經(jīng)過統(tǒng)計學分析還不能看出顯著差異，樣本量還不夠大，血清cccDNA陽性與病情的輕重是否存在某種關(guān)系還有待于進一步的深入研究。但是，從理論上推測，既然存在于肝細胞胞質(zhì)和線粒體中的轉(zhuǎn)氨酶等酶類在肝細胞被破壞時能釋放到血液中，那么存在于肝細胞核內(nèi)的cccDNA分子在肝細胞變性、壞死時應(yīng)該也可以釋放到血液中，而且病情越嚴重，變性壞死的細胞越多，對于同一個患者而言，在某一時間段內(nèi)，其血液中的cccDNA水平應(yīng)該也相應(yīng)地越高，對判斷病情有意義。,感染科,2006-08-15,41,雖然經(jīng)過統(tǒng)計學分析還不看出顯著差異，樣本量還不夠大，血清HBVcccDNA陽性與病情的輕重是否存在某種關(guān)系還有待于進一步的深入研究。 目前通過肝活檢來監(jiān)測乙肝患者肝組織中的cccDNA水平變化存在著一定困難，因而監(jiān)測血液中的cccDNA的動態(tài)變化也許更具有現(xiàn)實意義。當然，其中還存在一些問題有待研究和解決，比如血液中的cccDNA水平遠遠低于肝組織中的cccDNA水平，也遠遠低于血液中的的rcDNA水平，因此必須進一步提高cccDNA定量檢測的靈敏度。,感染科,2006-08-15,42,但是，從理論上推測，既然存在于肝細胞胞質(zhì)和線粒體中的轉(zhuǎn)氨酶等酶類在肝細胞被破壞時能釋放到血液中，那么存在于肝細胞核內(nèi)的cccDNA分子在肝細胞變性、壞死時應(yīng)該也可以釋放到血液中，而且病情越嚴重，變性壞死的細胞越多，對于同一例患者而言，在某一時間段內(nèi)，其血液中的cccDNA水平應(yīng)該也相應(yīng)地越高，對判斷病情有意義。,感染科,2006-08-15,43,目前通過肝活檢來監(jiān)測乙肝患者肝組織中的cccDNA水平變化存在著一定困難，因而監(jiān)測血液中cccDNA的動態(tài)變化也許更具有現(xiàn)實意義。,感染科,2006-08-15,44,當然，目前還存在一些問題有待研究和解決，例如血液中HBVcccDNA的水平遠遠低于肝組織中的水平，也遠遠低于血液中的松