外源化學物致突變作用.ppt

第七章 外源化學物致突變作用,案例3分析討論,鐮刀型細胞貧血是遺傳物質DNA中血紅蛋白基因序列中一個CTT變成CAT，即發(fā)生基因顛換，血紅蛋白鏈中N端第六位氨基酸由Glu變?yōu)閂al，血紅蛋白分子發(fā)生遺傳缺陷，以至產生病變。這種疾病可以遺傳。 通過這個案例，一方面了解從堿基改變，到編碼產物的改變，再到表現(xiàn)型的改變最后到健康效應的出現(xiàn)之間的因果關系。另一方面要認識到基因突變的發(fā)生會引起嚴重的健康危害。,第四節(jié) 機體對致突變作用的影響,遺傳物質在外源性因素的損傷仍能 代代相傳的原因：,DNA可執(zhí)行高保真度的復制，對復制中的錯誤能及時修復，從而達到高度的保真。 細胞能夠通過對DNA損傷的修復而保護親代DNA鏈，使之避免由于內、外各種因素的損傷而發(fā)生改變。,一、DNA損傷的修復,（一）直接修復：依賴酶的作用。 光復活： 依賴光的過程，通過光裂合酶切下DNA上嘧啶二聚體，將毗連的嘧啶接回原結構上?？梢酝耆迯妥贤饩€誘發(fā)的嘧啶二聚體，使其在原位上恢復為單體。 “適應性”反應： 通過烷基轉移酶修復DNA烷化損傷，保護細胞免受烷化劑的毒性影響。,（二）堿基切除修復,DNA糖基酶作用于受損的DNA，識別并切除損傷堿基，通過切斷堿基與脫氧核糖連接的鍵，使受損的堿基脫落，留下一個無嘌呤或無嘧啶的AP位點。AP內切酶將DNA鏈切斷，由聚合酶和連接酶完成修復過程。 堿基切除修復是細胞對堿基氧化損傷的主要防御系統(tǒng)。,（三）核苷酸切除修復 使細胞具有從DNA上移除較大損傷。 所有生物體最常見的修復機制?；究梢孕迯退蟹N類的DNA損傷。 過程：內切酶， 損傷識別；損傷兩側切除損傷鏈；切除寡聚核苷酸；修復合成填補產生的缺口；DNA連接酶封閉，恢復原有DNA序列。,（四）雙鏈斷裂修復,未修復的雙鏈斷裂啟動DNA損傷反應系統(tǒng)，使細胞阻滯于周期的某一期或誘發(fā)細胞凋亡。 不是修復，是一種耐受過程，以容忍損傷繼續(xù)存在和高突變率情況來換取細胞繼續(xù)生存的耐受過程。,（五）交聯(lián)修復： 當細胞內發(fā)生DNA鏈內交聯(lián)，會造成雙鏈的斷裂，機體啟動無誤交聯(lián)修復或易誤交聯(lián)修復。,小結,修復的結果不全是有益的。 修復的途徑是多種。 修復與突變不可分。 損傷修復突變,二、遺傳因素對致突變作用的影響,（一）代謝酶遺傳多態(tài)性 1、氧化代謝酶 芳烴羥化酶：催化多環(huán)芳烴等致癌物活化。 2、酯酶 環(huán)氧水化酶：活化酶，參與苯并（a）比代謝為終致癌物。 3、谷胱甘肽硫轉移酶 缺乏易患肺癌,（二）修復功能的個體差異,修復酶的多態(tài)性造成機體對損傷的反應不一。 1、O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶： 功能：恢復堿基的原有配對性。 缺乏或活性降低：腫瘤發(fā)生 2、聚（二磷酸腺苷核糖）多聚酶： 功能：氧化損傷的修復方式，對外來因素造成基因突變和腫瘤發(fā)生可產生抑制或促進作用。,小 結,遺傳因素是化學毒物的作用靶部位，是決定化學毒物毒作用性質和強度的一個重要因素。 遺傳因素對致突變作用的影響的研究，是預防和治療腫瘤的新思路。,第五節(jié) 觀察外源化學物致突變作用的基本方法*,致突變試驗的應用,中國預防醫(yī)學博士張學明:煎炸魚中合有強致癌物雜環(huán)胺。 雜環(huán)胺的形成量主要受煎炸、烤的溫度影響，其次是煎烤時間。煎炸溫度小于200，雜環(huán)胺的形成量就很少；如果煎炸溫度超過200，煎炸時間少于2分鐘，雜環(huán)胺的形成量也很少；在煎炸的魚外面掛上一層淀粉糊再炸，也能預防雜環(huán)胺形成。 美國加州科研人員發(fā)現(xiàn)，高溫烹調或油炸的肉食中合有突變源，對經過高溫烹調的牛肉、雞、魚等進行檢驗，結果測出10種致癌化合物，這次研究證實，突變源不是由于炭火等熱源將肉燒糊所致，而是肉食本身成分在加溫200以上時的產物。,檢測化學物的致突變性的目的：,鑒定生殖細胞和體細胞的致突變物； 預測潛在致癌物 環(huán)境致突變物的監(jiān)測與評價。,一. 觀察項目的選擇 （一）觀察的效應終點類型 遺傳學終點(genetic endpoint )： 基因突變和染色體畸變的檢測可直接反映外源化學物的致突變性，是評價化學物致突變性唯一可靠的方法。有許多試驗所觀察到的現(xiàn)象并不反映基因突變,染色體畸變和染色體分離異常,而僅反映致突變過程中發(fā)生的其他事件。因此，將試驗觀察到的現(xiàn)象所反映的各種事件統(tǒng)稱為遺傳學終點。 包括：基因突變，染色體畸變，染色體組畸變，DNA原始損傷,（二）成套觀察項目 1.原則 選擇的遺傳毒性試驗應包括每一類型的遺傳學終點。 應包括多種進化程度不同的物種,如原核細胞,低等和高等真核細胞。 體內試驗與體外試驗配合。,2. HIC(1997)對于藥品的遺傳毒性評價建議的實驗組合為：,細菌基因突變試驗 體外哺乳動物細胞染色體畸變實驗或體外小鼠淋巴瘤細胞tk試驗； 體內嚙齒類造血細胞染色體損傷試驗； 對標準致突變實驗組合的結果進一步研究時，可以選擇其他一些實驗，如DNA加合物測定、DNA鏈斷裂檢測、DNA修復實驗等。,二、常用的致突變試驗 細菌回復突變試驗 微核試驗 染色體畸變分析 姐妹染色單體交換試驗 果蠅伴性隱性致死試驗 顯性致死試驗 程序外DNA合成試驗 單細胞凝膠電泳,(一)細菌回復突變試驗Ames試驗*,是利用突變體的測試菌株，觀察受試物能否糾正或補償突變體所攜帶的突變改變，判斷其突變型。,常用的指示菌株：鼠傷寒沙門菌和大腸桿菌。,廣泛應用鼠傷寒沙門菌突變試驗。,(一)細菌回復突變試驗Ames試驗* 1. 原理： 是人工誘變的突變株在組氨酸操縱子中有一個突變，突變的菌株必需依賴外源性的組氨酸才能生長，而在無組氨酸的選擇性培養(yǎng)基上不能存活。致突變物可使其基因發(fā)生回復突變，使它在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上也能生長。計算誘發(fā)的回復菌落數(shù)即可判斷化學毒物的致突變性。,2. 常用菌株：鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型突變株為指示微生物。目前推薦使用 TA100 TA102 TA97 TA98 為增強對誘變物的敏感性加入一些附加突變：,試驗中可供選用的測試菌株有多種，所攜帶的突變在不同的基因中，各有不同的特征，有的測定堿基置換，有的測定移碼突變，有的兩者都可測定，根據實驗目的配套選擇。,(一)Ames試驗 3. 方法： 點試法：用作定性試驗，適用于短期大量篩選,平板摻入法：標準試驗，用作定量測定,(二)微核試驗(micronucleus test, MNT) 觀察受試物產生微核發(fā)生率或 有微核的細胞率為觀察指標檢測 化學物染色體損害能力的試驗， DNA斷裂劑，非整倍體誘變劑。 微核（micronucleus） ：染色體或染色單體的無著絲點斷片或因紡錘體受損傷而丟失的整個染色體，在細胞分裂的后期仍留在子細胞的胞質內，單獨形成一個或幾個規(guī)則的次核，包含在子細胞的胞質內，比主核小。,正常細胞、微核細胞,正常細胞、微核細胞和核異常細胞,指示正常細胞； 指示微核細胞； 指示核異常細胞 （2.5100）,骨髓多染紅細胞微核試驗,大多數(shù)類型的細胞都可形成微核，但有核細胞的胞質少，微核與正常核葉及核的突起難以鑒別。 常規(guī)：骨髓多染紅細胞微核試驗 多染紅細胞是成紅細胞發(fā)展為成熟紅細胞時，主核已排出，微核仍保留在細胞質中，成為多染紅細胞（polychromatic erythrocytes PCE）,這些細胞保持其嗜堿性約24小時，然后成為正染紅細胞，并進入外周血。 計數(shù)骨髓有微核多染紅細胞率可判斷受試物對骨髓細胞的染色體損傷作用。,骨髓細胞微核試驗的不足,某些化學物在骨髓難以達到有效濃度。 骨髓中的SCE是動態(tài)平衡，其不斷成熟為紅細胞，紅細胞又衰老死亡。 化學物毒物主要在肝臟活化，其活化中間產物可能在到達骨髓之前消失。 僅觀察體細胞其結果外推其他組織應慎重。,微核實驗進展,體外微核試驗：中國倉鼠肺細胞/中國倉鼠卵巢細胞/中國倉鼠成纖維細胞，易于操作和控制受試物濃度。 外周血微核實驗：可能成為人群觀察化學毒物遺傳毒性的一種手段。 雙核細胞法：提高微核的靈敏度。 免疫熒光染色法、熒光原位雜交：靈敏度高，還可判斷來源（斷片還是染色體）。,(三)染色體畸變分析 chromosome aberration assay,觀察染色體形態(tài)結構和數(shù)目改變，又稱細胞遺傳學試驗。 觀察：用顯微鏡檢查細胞分裂中期相染色體畸變和染色體分離異常。 結果：裂隙，斷裂，斷片，微小體，染色體環(huán)等。,常染色體異常,Down syndrome (trisomy 21):先天愚型或唐氏綜合征,三體綜合征（13三體）：嚴重的眼，腦，循環(huán)系統(tǒng)缺陷以及腭裂。兒童生活很少超過幾個月。,(四)姐妹染色單體交換試驗(sister-chromatid exchange,SCE) 指染色體同源座位上DNA復制產物的相互交換,其頻率與DNA斷裂和修復有關。檢測DNA損傷的靈敏指標。,原理： 在細胞培養(yǎng)液中加入5-溴脫氧尿嘧 啶（5-BrdU，嘧啶類似物），在 DNA合成期可與胸苷競爭摻入DNA 中，經兩個分裂周期后，兩條染色 單體，其中一條DNA鏈的雙鏈內T 被5-溴脫氧尿嘧啶核苷取代，另一 條只有一條鏈被取代。用染色劑處 理，使雙鏈含BrdU的染色單體著色 淺淡，單鏈含BrdU的染色單體著色 深。當姐妹染色單體間發(fā)生同源片 段交換時，就可以根據每條染色單 體夾雜著深淺不一的著色片段加以 區(qū)分。,(五)果蠅伴性隱性致死試驗,原理 根據隱性基因在伴性遺傳中的交叉遺傳特征，即雄蠅的X染色體傳給F1代雌蠅。又通過F1代傳給F2代雄蠅。位于X染色體上的隱性基因能在半合子雄蠅中表現(xiàn)出來。據此推斷致死突變的存在。 結果： 能檢出點突變，小缺失，重排。,優(yōu)點：判斷突變終點客觀、不需活化。 不足：與哺乳動物差異較大。,(六)顯性致死試驗 1. 原理 對雄性動物染毒，觀察一個精子發(fā)育周期中各個階段雌鼠出現(xiàn)受精卵在著床前死亡和胚胎早期死亡。 致突變物引起哺乳動物生殖細胞染色體發(fā)生結構和數(shù)目變化。 2.檢測整體哺乳動物生殖細胞遺傳性（染色體畸變）損傷的方法。是評價化學毒物對雄性動物的生殖細胞遺傳毒性較好的方法之一。,不足：靈敏度差，動物數(shù)量大，一定的受孕率。,（七）程序外DNA合成試驗 (unschedule DNA synthesis， UDS),當DNA受損傷時，損傷修復的DNA合成主要在S期以外的其他細胞周期，稱程序外DNA合成 *。 原理：觀察分離或培養(yǎng)的細胞，加入標記DNA合成原料，如3H-胸苷，測定S期以外3H-胸苷摻入胞核的量，判斷受試物是否造成DNA損傷。因此發(fā)現(xiàn)UDS增高，即表明DNA發(fā)生過損傷。,39,(八)單細胞凝膠電泳試驗(single cell gel electrophoresis，SCGE)（彗星試驗(comet assay)）,一種快速檢測哺乳動物細胞DNA損傷的實驗方法。 原理：DNA損傷后，斷裂的DNA片段比大片段DNA遷移的更快，電泳后出現(xiàn)彗星狀，即可判斷DNA損傷。,幾種遺傳毒理學試驗的哺乳動物性細胞 致突變物篩檢可靠性評價,試 驗 靈敏性(%) 特異性(%) 準確性() Ames試驗 17/19 (89%) 3/10 (30%) 20/29 (69%) 骨髓細胞染色體畸 18/18 (100%) 2/10 (20%) 20/28 (71%) 變試驗或微核試驗 顯性致死試驗 18/18 (100%) 8/10 (80%) 26/28 (93%),常用的遺傳毒理學試驗的特點,（九）觀察方法的新進展（自學） 1.轉基因小鼠致突變檢測系統(tǒng) 2.微核自動化檢測技術 3.熒光原位雜交技術,致突變試驗的應用實例如何設計？,分組（化合物） 選擇致突變實驗組合 體外，體內 觀察遺傳學終點 做出評價,致突變實驗的應用實例,致突變實驗的應用實例空氣污染,家庭裝潢有害氣體致小鼠遺傳毒性實驗,三、致突變試驗中的一些問題,（一）陰性和陽性對照的設立 陰性對照 為了獲取試驗的基礎數(shù)據。 陽性對照 證明試驗方法的可靠；驗證實驗者在本實驗條件下，完成技術和鑒定致突變物的能力；證實經一段時間后，本試驗的重復性。,(二) 體外試驗的活化系統(tǒng) 1哺乳動物細胞介導 使用完整的細胞，特別是大鼠肝原代細胞，與測試細菌或細胞一起培養(yǎng)。 特點：這也是一種活化系統(tǒng)。它有完整的細胞結構和各種酶及內源性輔助因子，代謝能力優(yōu)于無細胞系統(tǒng)如S9。 不足：但不如體內活化系統(tǒng)。,2S9 S9指經酶誘導劑處理后制備的肝勻漿，再經9000g離心分離所得上清液，加上適當?shù)木彌_液和輔助因子。 特點：它主要含有混合功能氧化酶(MFO)，是國內常規(guī)應用于體外致突變試驗的代謝活化系統(tǒng)。 缺點：S9隨實驗動物種屬或器官不同而有差異；S9含有的大量親核物質有可能影響試驗的敏感性。,3純化酶和基因工程 純化酶：應用純化細胞色素P-450、谷胱苷肽轉移酶及過氧化物水解酶，可嚴格控制代謝產物誘發(fā)突變的條件，但技術難度大。 基因工程：將人的細胞色素P-450基因，插入組合細胞內，用上述細胞進行致突變試驗，使細胞具有代謝活化系統(tǒng)。 不足：不可能完全取代整體動物代謝。,（三） 致突變試驗與致癌試驗的關系 已知致突變作用是致癌機制之一。 利用致突變試驗預測致癌性時，應該考慮敏感度與特異性。通過互補復合試驗加以克服。 致突變試驗僅可檢出遺傳毒性致癌物。,（四）試驗結果在毒理學安全性評價中的作用,1. 實驗的質量控制：盲法觀察； 陰性對照和陽性對照的設立；資料的統(tǒng)計學分析；試驗結果的重現(xiàn)性。 2.陰性結果判定條件： 最高劑