中藥羌活有效成分的提取工藝研究

聊城大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）題 目：中藥羌活有效成分的提取工藝研究專(zhuān)業(yè)代碼：0703作者姓名：亢靜靜學(xué) 號(hào)：2009201799單 位：化學(xué)化工學(xué)院09級(jí)3班指導(dǎo)教師：柳仁民 教授 2013年5月25日 原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，論文中不含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得聊城大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位證書(shū)而使用過(guò)的材料。對(duì)本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人承擔(dān)本聲明的相應(yīng)責(zé)任。學(xué)位論文作者簽名：日期 指 導(dǎo) 教 師 簽 名： 日期 聊城大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 目錄前 言11. 中藥有效成分提取方法21.1 溶劑提取法21.1.1 溶劑提取法的原理21.1.2 溶劑的選擇21.1.3 提取方法21.2 水蒸氣蒸餾法31.3 超聲波提取法31.4 微波提取法31.5 超臨界流體萃取法31.6 破碎提取法31.7 酶法提取42. 高效液相色譜法簡(jiǎn)介42.1 高效液相色譜法的簡(jiǎn)介42.1.1 高效液相色譜的特點(diǎn)42.1.2 液相色譜的分離原理和分類(lèi)52.2 高效液相色譜法的應(yīng)用53. 羌活性狀及藥理作用研究53.1 羌活性狀63.2 主要成分63.3 藥理作用74. 實(shí)驗(yàn)部分84.1 實(shí)驗(yàn)儀器84.2 試劑與材料84.3 色譜條件94.4 提取過(guò)程94.4.1 不同提取方法的比較94.4.2 不同提取溶劑的比較94.4.3 不同濃度甲醇的比較94.4.4 不同提取次數(shù)的比較105. 結(jié)果與討論105.1 HPLC分離條件的優(yōu)化105.2 不同提取方法的比較125.3 不同提取溶劑提取效率的比較135.4 不同濃度甲醇提取效率的比較145.5 不同提取次數(shù)提取效率的比較15結(jié)論15參考文獻(xiàn)17致謝19摘要為了將中藥羌活中的有效成分提取出來(lái)，分別采用冷浸、超聲與加熱回流三種提取方法，使用水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯作提取溶劑，對(duì)中藥羌活中活性成分進(jìn)行提取，并通過(guò)對(duì)高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）分離條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了分離分析羌活中活性成分的方法，用HPLC對(duì)提取液進(jìn)行了分析，比較了不同提取方法，不同提取溶劑提取率的高低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：提取溶劑的種類(lèi)、提取方法，提取次數(shù)均明顯地影響提取效率。其中用純甲醇為提取劑，采用加熱回流的方法在80 條件下提取0.5 h時(shí)的提取效率最佳。 關(guān)鍵詞：高效液相色譜；羌活；超聲；回流；冷浸AbstractThe extraction methods of active components from Chinese traditional medicine. Rhizoma et Radix Notopterygii; incised notopterygium rhizome and root were tested including marinating, ultrasonic and reflux with methanol, ethanol and ethyl acetate as extraction solvent. HPLC separation conditions of nunciferine and pronuciferine were investigated. The extracted samples were analyzed by HPLC and the results indicated that the contents of each compound extracted by different extraction methods were diverse. Among these extraction methods, ultrasonic extraction for 0.5h under the 80 temperature using methanol as 100%methanol solvent was the best method. The results suggested that the extraction method, and time all remarkably affected the extraction efficiency.Key Words: HPLC; Radix Notopterygii; incised notopterygium rhizome and root; marinating; ultrasonic; reflux.中藥羌活中有效成分的提取工藝研究前 言羌活藥材為常用中藥，來(lái)源于傘形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang或?qū)捜~羌活Notopterygium franchetii H. De Boiss.的干燥根及莖1，藥用歷史悠久，始見(jiàn)于神農(nóng)本草經(jīng)，列于獨(dú)活項(xiàng)下。主要分布于我國(guó)西部四川、甘肅、青海、云南、西藏等省(自治區(qū))。其性溫，味辛、苦，具有散寒、祛風(fēng)、除濕、止痛之功效，現(xiàn)代研究表明羌活具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎、改善血液循環(huán)及保護(hù)肝臟的作用2-9?，F(xiàn)有研究表明，羌活化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有揮發(fā)油、香豆素、有機(jī)酸、氨基酸、糖類(lèi)等化學(xué)成分，其中香豆素類(lèi)成分有乙基羌活醇、羌活酚縮醛、環(huán)氧脫水羌活酚、佛手內(nèi)酯、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素、珊瑚菜內(nèi)酯等10-16。此外，藥理研究結(jié)果顯示香豆素類(lèi)成分具有顯著的藥理作用，如異歐前胡素具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱等作用17。近年來(lái)，由于HPLC引用了高壓泵和高靈敏度的檢測(cè)器，使其具有很多優(yōu)越性，主要表現(xiàn)為分離效能高、選擇性高、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快、分析對(duì)象范圍廣。HPLC廣泛用于天然產(chǎn)物、生命活性物質(zhì)、生物大分子、高聚物、高分子化合物以及無(wú)機(jī)物的分離測(cè)定。因此，利用HPLC對(duì)羌活中主要化合物的提取方法進(jìn)行研究具有非常重要的意義。本課題對(duì)中藥羌活中有效成分用不同溶劑和不同提取方法進(jìn)行研究，建立羌活中有效成分的高效液相色譜的分析方法。通過(guò)HPLC分析，結(jié)果表明：提取方法，提取溶劑，溶劑濃度，提取時(shí)間均影響提取效率，其中加熱回流提取效率最高，采用甲醇作為提取溶劑提取效率最高且提取三次即可提取完全；故用純甲醇提取3次，每次回流0.5 h。1. 中藥有效成分提取方法我國(guó)的天然藥物資源豐富，但中藥成分一般較復(fù)雜，有效成分含量差別大，雜質(zhì)占大部分，而且藥物中往往多種有效成分共存，為尋找新的藥物，弄清藥物中各種有效成分的藥理作用，必須將有效成分從中草藥中提取出來(lái)，才能進(jìn)一步的研究和利用，所以中草藥中有效成分的提取是中藥化學(xué)研究的首要前提。提取，是指用適當(dāng)?shù)姆椒ɑ蜻m當(dāng)?shù)娜軇⒅胁菟幹械幕瘜W(xué)成分從植物組織中抽提出來(lái)，由此提取出來(lái)的有效成分往往不止一種，為得到其中的某種有效成分，還需進(jìn)一步的分離。中藥有效成分的提取一般采用傳統(tǒng)的溶劑提取法，而近些年來(lái)出現(xiàn)了一些新技術(shù)，如超聲波提取法、微波提取法、超臨界流體提取法。 1.1 溶劑提取法 1.1.1 溶劑提取法的原理溶劑提取法是根據(jù)中草藥中各種成分在溶劑中的溶解性質(zhì)，選用對(duì)活性成分溶解度大，對(duì)不需要溶出成分溶解度小的溶劑，而將有效成分從藥材組織內(nèi)溶解出來(lái)的方法。當(dāng)溶劑加到中草藥原料（需適當(dāng)粉碎）中時(shí)，溶劑由于擴(kuò)散、滲透作用逐漸通過(guò)細(xì)胞壁透入到細(xì)胞內(nèi)，溶解了可溶性物質(zhì)，而造成細(xì)胞內(nèi)外的濃度差，于是細(xì)胞內(nèi)的濃溶液不斷向外擴(kuò)散，溶劑又不斷進(jìn)入藥材組織細(xì)胞中，如此多次往返，直至細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，將此飽和溶液濾出，繼續(xù)多次加入新溶劑，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。1.1.2 溶劑的選擇運(yùn)用溶劑提取法的關(guān)鍵，是選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。溶劑選擇適當(dāng)，就可以比較順利地將需要的成分提取出來(lái)。選擇溶劑要注意以下三點(diǎn)：（1) 溶劑對(duì)有效成分溶解度大，對(duì)雜質(zhì)溶解度小；(2) 溶劑不能與中藥的成分起化學(xué)變化；(3) 溶劑要經(jīng)濟(jì)、易得、使用安全等。 1.1.3 提取方法用溶劑提取中草藥成分，常用浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法及連續(xù)回流提取法等。 1.2 水蒸氣蒸餾法此法適用于具有揮發(fā)性，能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞，與水不發(fā)生反應(yīng)，有難溶或不溶于水的化學(xué)成分的提取，如揮發(fā)油。分為共水蒸餾法、通水蒸氣蒸餾法和水上蒸餾法三種。 1.3 超聲波提取法超聲波輔助萃取是超聲能量輔助作用下的提取方法，主要是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超聲波的次級(jí)效應(yīng)，如機(jī)械振動(dòng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速欲提取成分的擴(kuò)散釋放并充分與溶劑混合，利于提取，提高中草藥有效成分的產(chǎn)率18。另外超聲波破碎過(guò)程是一個(gè)物理過(guò)程，浸提過(guò)程中無(wú)化學(xué)反應(yīng)，被浸提的生物活性物質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)保持不變，生物活性不減。 1.4 微波提取法微波提?。╩icrowave assisted extraction）是指利用微波能將中藥細(xì)胞內(nèi)的有效成分提取出來(lái)的一種新技術(shù)，其原理是微波加熱促使中藥植物細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)吸收電磁能，產(chǎn)生的熱量促使細(xì)胞內(nèi)溫度上升，壓力增大，將細(xì)胞膜、細(xì)胞壁沖破，形成孔洞，細(xì)胞外的溶劑通過(guò)孔洞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，有效成分則溶解在溶劑中19。微波提取可對(duì)中草藥中的不同成分進(jìn)行選擇性加熱，易于將目標(biāo)成分提取，因而具有選擇性。微波提取設(shè)備簡(jiǎn)單，使用范圍廣，可用于對(duì)中藥中揮發(fā)油、苷類(lèi)、生物堿、多糖、黃酮、有機(jī)酸等有效成分的提取，與傳統(tǒng)提取法相比，它提取時(shí)間短、效率高、污染小、重現(xiàn)性好，但微波提取要求中藥含有一定的水分，對(duì)含水少的細(xì)胞不易破壁，有效成分難提取。微波對(duì)某些化合物有一定的降解作用，微波對(duì)人體，尤其是眼睛有一定程度的影響，所以應(yīng)用時(shí)，應(yīng)選擇合理的提取工藝條件，并注意微波的泄露和防護(hù)20。 1.5 超臨界流體萃取法它是利用超臨界狀態(tài)下的流體為萃取劑，從液體或固體中萃取中藥材中的藥效成分并進(jìn)行分離的方法。本方法提取效率高，生產(chǎn)周期短，易發(fā)現(xiàn)天然植物中新的活性成分，極少損失易揮發(fā)組分或破壞生理活性物質(zhì)，無(wú)溶劑殘留，產(chǎn)品質(zhì)量高。1.6 破碎提取法 破碎提取法是使中草藥在破碎提取器中加入適當(dāng)溶劑后破碎，而得以提取有效成分21。有關(guān)研究表明，此法提取速度快且完全，不需加熱，可以節(jié)省時(shí)間、能源和溶劑，這種方法雖然省時(shí)且不用高溫加熱，但由于其提取率并非最高而使其只局限于實(shí)驗(yàn)研究。 1.7 酶法提取酶法提取是通過(guò)酶解反應(yīng)強(qiáng)化傳質(zhì)過(guò)程，從而提高提取效率。酶解是一種能夠最大限度從植物體內(nèi)提取有效成分的方法之一22。中藥的有效成分經(jīng)常與蛋白質(zhì)、果膠、淀粉、植物纖維等雜質(zhì)混合，這些雜質(zhì)不但影響植物細(xì)胞中活性成分的浸出，而且影響中藥液體制劑的澄清度。選擇恰當(dāng)?shù)拿福坏梢詫⑦@些雜質(zhì)祛除，而且可以通過(guò)酶反應(yīng)較溫和地將植物組織分解，加速有效成分的釋放提取，還可以促進(jìn)脂溶性成分轉(zhuǎn)化為易溶于水的成分而有利于提取。 綜上所述，為縮短提取時(shí)間，提高產(chǎn)率，對(duì)于中藥有效成分已知的研究，僅需采取最適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行提取；對(duì)于中藥有效成分未知的研究，可采用對(duì)照的方法，采用不同的提取方法，盡可能完全提取出有效成分。2. 高效液相色譜法簡(jiǎn)介 2.1 高效液相色譜法的簡(jiǎn)介高效液相色譜法(High-Performance Liquid Chromatography，HPLC)是以液體作為流動(dòng)相，并采用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)23。高效液相色譜對(duì)樣品的適用性廣，不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來(lái)分析，高效液相色譜已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物的含量測(cè)定、組成分析、質(zhì)量控制等方面。 2.1.1 高效液相色譜的特點(diǎn) (1) 高壓：流動(dòng)相為液體,流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液加高壓。(2) 高效：分離效能高。可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。(3) 高靈敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01 ng，進(jìn)樣量在L數(shù)量級(jí)。(4) 應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。(5) 分析速度快、載液流速快：較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在15-30 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成，一般小于1 h。 2.1.2 液相色譜的分離原理和分類(lèi)根據(jù)被分離混合物中各組分在固定相及流動(dòng)相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離，其實(shí)質(zhì)是試樣分子與流動(dòng)相或洗脫液以及固定相分子間的作用力，作用力的大小決定色譜過(guò)程的保留行為21。根據(jù)分離機(jī)制的不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化學(xué)鍵合相色譜、離子交換色譜和分子排阻色譜。 2.2 高效液相色譜法的應(yīng)用 由于HPLC具備了高靈敏度、高分辨率、速度快、色譜柱可反復(fù)使用、流出組分易收集的特點(diǎn)。使得它在生化、有機(jī)化學(xué)、醫(yī)學(xué)藥物臨床、化工、環(huán)保監(jiān)測(cè)等方面都有廣泛的用途24。例如：（1）藥物分析：中藥質(zhì)量控制，化學(xué)藥物質(zhì)量控制，抗生素質(zhì)控分析，生化藥質(zhì)量控制，新型高效手性藥物中手性對(duì)映體含量的測(cè)定等。（2）環(huán)境污染物分析：大氣、水、土壤和食品中的多環(huán)芳烴、多環(huán)聯(lián)苯，陰離子表面活性劑，有機(jī)氯農(nóng)藥、有機(jī)磷農(nóng)藥，除草劑，酚類(lèi)胺類(lèi)、黃曲霉毒素等污染物的分離與測(cè)定。（3）食品質(zhì)量分析：農(nóng)藥殘留，獸藥殘留；防腐劑、抗氧化劑、人工合成色素等食品添加劑的分離與測(cè)定，保健食品中的功效成分檢測(cè)，真菌毒素分析等。（4）前沿生命科學(xué)分析：DNA電泳與色譜分析，生物技術(shù)藥物純化及鑒定，生物標(biāo)志物色譜分析，蛋白質(zhì)組學(xué)研究等。3. 羌活性狀及藥理作用研究為圓柱形略彎曲的根莖，長(zhǎng)4-13 cm，直徑0.6-2.5 cm，頂端具莖痕。表面棕褐色至黑褐色，外皮脫落處呈黃色。節(jié)間縮短，呈緊密隆起的環(huán)狀，形似蠶（習(xí)稱(chēng)蠶羌）；或節(jié)是延長(zhǎng)，形如竹節(jié)狀（習(xí)稱(chēng)竹節(jié)羌）。節(jié)上有多數(shù)點(diǎn)狀或瘤狀突起的根良及色破碎鱗片。體輕，質(zhì)脆，易折斷。斷面不平整，有多數(shù)裂隙，皮部黃棕色至暗棕色，油潤(rùn)，有棕色油點(diǎn)，木部黃白色，射線(xiàn)明顯，髓部黃色至黃棕色。氣香，味微苦而辛。羌活不同部位如圖3-1至3-3所示： 圖3-1羌活茂盛植株 圖3-2晾干的羌活莖 圖3-3晾干的羌活根部 3.1 羌活性狀 羌活藥材因藥用部分和形態(tài)不同而有蠶羌、竹節(jié)羌、大頭羌、條羌等數(shù)種。蠶羌又名：螺絲羌。為干燥的根莖部，形態(tài)似蠶。呈圓柱狀或略彎曲，長(zhǎng)約4-10 cm，直徑約1-2 cm。頂端有莖葉殘基。表面棕褐色，有多數(shù)緊密而隆起的環(huán)節(jié)。節(jié)上密生疣狀突起的須根痕。質(zhì)輕松易折斷，斷面不齊，有明顯的菊花紋和多數(shù)裂隙，皮部棕紅色；木質(zhì)部淡黃色，中央有黃白色髓，均有朱砂點(diǎn)（油管），具特殊香氣，味微苦而麻；竹節(jié)羌：根莖的環(huán)節(jié)較稀，如竹節(jié)狀，似蠶羌而略大；大頭羌：根莖的環(huán)節(jié)特別膨大，呈不規(guī)則團(tuán)塊狀，大小不等，頂端具多數(shù)殘留莖基，余皆與蠶羌相同；條羌：為干燥的根及支根。呈圓柱形或分枝，長(zhǎng)3-17 cm，直徑約0.7-1.7 cm，頂端偶可見(jiàn)有根莖，表面棕褐色，有縱紋及疣狀突起的須根痕，上端較粗大，有稀疏隆起的環(huán)節(jié)，質(zhì)疏松而脆、易折斷，斷面不平坦，皮部淺棕色，木部黃白色，有菊花紋，朱砂點(diǎn)不明顯，中央無(wú)髓，氣味較淡薄。 3.2 主要成分 羌活中含有的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、香豆素、氨基酸、有機(jī)酸和甾醇等25 。揮發(fā)油主要含有Ot-蒎烯(Otpinene)、B-蒎烯(3-pinene)、檸檬烯(1imonene)等63種；香豆素類(lèi)化合物主要含有異歐芹素乙(isoiinperatorin)、佛手柑內(nèi)酯(ber-gapten)、佛手柑亭(bergamotin)、佛手酚(bergapto1)、羌活酚(notopto1)、羌活醇(notoptero1)、脫水羌活酚(anthydronotopt01)、乙基羌活醇(ethylnotoptero1)、羌活酚縮醛(notoptolide)、環(huán)氧脫水羌活酚(anhydronotoptoloxide)和紫花前胡苷(nonak-enin)等；糖類(lèi)主要有鼠李糖、果糖、葡萄糖和蔗糖；氨基酸有19種；還含有阿魏酸(ferulic acid)、茴香酸對(duì)羥基苯乙酯(P-hydroxyphenethyl anisate)等有機(jī)酸及有機(jī)酸酯；此外，羌活中還含有B-谷甾醇(B-sitostero1)、娠烯醇酮(prenenolone)、鐮葉芹二醇(fmcarindio1)等類(lèi)化合物 。主要成分的結(jié)構(gòu)如圖3-4至3-6所示： 圖3-4 阿魏酸分子結(jié)構(gòu)圖 圖3-5 香豆素母體結(jié)構(gòu) 圖3-6 異歐前胡素分子結(jié)構(gòu)圖 3.3 藥理作用（1）急毒性研究及抑菌抗病毒作用 研究表明，發(fā)現(xiàn)羌活對(duì)流感病毒肺炎小鼠的死亡具有保護(hù)作用，高劑量組能直接殺死小鼠肺部的流感病毒。同時(shí)有報(bào)道表明，羌活中有的鐮葉芹二醇具有明顯的抑菌作用，可抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，并可用來(lái)防治特應(yīng)性皮炎；研究測(cè)得羌活最小抑真菌濃度(MIC)為11.88%。（2）解熱消炎鎮(zhèn)痛作用 湯液本草中記載：“羌活氣雄，治足太陽(yáng)風(fēng)濕相搏，頭痛，肢體痛，一身盡痛者，非此不能除。”由此可見(jiàn)，古人就用羌活作為鎮(zhèn)痛藥。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)羌活的解熱消炎鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行了大量的研究：給大鼠灌服大劑量的羌活揮發(fā)油1.328 mL/kg體重和腹腔注射0.133 mL/kg體重，可使酵母引起的發(fā)熱現(xiàn)象明顯改善26；羌活中含有的乙酸乙酯具有鎮(zhèn)痛作用27。羌活水提物對(duì)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)誘導(dǎo)的肝損傷、酵母多糖誘導(dǎo)的腹腔白細(xì)胞游出和膠原蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶等具有顯著的抑制作用28。（3）抗血栓作用資料表明27，羌活主要是通過(guò)抑制血小板和紅細(xì)胞聚集，降低血液黏度產(chǎn)生抗血栓形成作用，因此推測(cè)苯乙基阿魏酸酯和(-)-冰片基阿魏酸酯可能是羌活抗血小板聚集的活性成分。張明發(fā)等29研究指出，0.100 g/mL羌活醇提取物可延長(zhǎng)凝血時(shí)間。（4）抗心律失常作用 羌活小分子、大分子水溶液抗心律失常作用的最佳使用濃度分別為12和22 g/mL30。羌活水提物能明顯縮短氯仿一腎上腺素引起的兔心律失常的掙續(xù)時(shí)間成伊竹等 研究指出，當(dāng)羌活小分子水溶液濃度為l2 kg時(shí)，能在短時(shí)問(wèn)恢復(fù)正常心律?？诜蓟钐崛∥锬苎娱L(zhǎng)烏頭堿致大鼠心律失常的出現(xiàn)時(shí)間，提高哇巴 致豚鼠室顫和心搏停止的用量，降低大鼠缺血再灌注誘發(fā)的室早、室速和室顫的發(fā)生率31。 另外，羌活還具有改善學(xué)習(xí)記憶障礙和抗過(guò)敏作用。有研究表明31，羌活中的紫花前胡苷具有改善學(xué)習(xí)記憶障礙的功能，表明紫花前胡苷有望發(fā)展成為新的預(yù)防和治療健忘癥藥物。 4. 實(shí)驗(yàn)部分 4.1 實(shí)驗(yàn)儀器Agilent1100 HPLC儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；Unimicro HPLC泵；Unimicro色譜工作站；Redone 7725i定量進(jìn)樣閥；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；KQ3200型超聲清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；FZ102型微型植物粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。 4.2 試劑與材料用于樣品提取的試劑(水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯)為分析純?cè)噭ㄌ旖蛟噭┤龔S）；用于HPLC檢測(cè)的試劑(甲醇、0.1%磷酸)為色譜純?cè)噭?；?shí)驗(yàn)用水為純凈水。羌活藥材為市售精品藥材。 4.3 色譜條件色譜柱：YMC ODS-A C18柱（250 mm4.6 mm I.D,5 m）；流動(dòng)相：甲醇：0.1%磷酸水溶液(v/v)，0-30 min 30%-45%甲醇-0.1%磷酸水溶液混合液梯度洗脫；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 L；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm。 4.4 提取過(guò)程將羌活粉碎，分別按照以下步驟進(jìn)行提取。 4.4.1 不同提取方法的比較(1) 精確稱(chēng)取羌活藥材粉末1.939 g，于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL無(wú)水乙醇，超聲提取0.5 h。(2) 精確稱(chēng)取羌活藥材粉末2.0035 g，于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL無(wú)水乙醇，冷浸0.5 h。 (3) 精確稱(chēng)取羌活藥材粉末1.9993 g，于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL無(wú)水乙醇，設(shè)定溫度為80 加熱回流0.5 h。提取液過(guò)濾后，置于10 mL容量瓶中，用乙醇定容，通過(guò)0.45 m膜過(guò)濾，待測(cè)。 4.4.2 不同提取溶劑的比較(1) 精確稱(chēng)羌活藥材粉取末1.9993 g，于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL無(wú)水乙醇，加熱回流0.5 h。(2) 精確稱(chēng)羌活藥材粉取末2.0078 g，于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL甲醇，加熱回流0.5 h。(3) 精確稱(chēng)羌活藥材粉取末2.0094 g，于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL乙酸乙酯，加熱回0.5 h。(4) 精確稱(chēng)羌活藥材粉取末2.0331 g，于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL水，加熱回流0.5 h。 無(wú)水乙醇、甲醇提取液經(jīng)過(guò)濾后，分別置于10 mL容量瓶中，用乙醇、甲醇定容；乙酸乙酯提取液需旋干后置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，通過(guò)0.45 m膜過(guò)濾，待測(cè)。 4.4.3 不同濃度甲醇的比較(1) 精確稱(chēng)羌活藥材粉取末2.0014 g，于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL30%甲醇，加熱回流0.5 h。(2) 精確稱(chēng)羌活藥材粉取末2.0413 g，于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL50%甲醇，加熱回流0.5 h。(3) 精確稱(chēng)羌活藥材粉取末2.0165 g，于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL70%甲醇，加熱回流0.5 h。(4) 精確稱(chēng)羌活藥材粉取末2.0238 g，于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL90%甲醇，加熱回流0.5 h。(5) 精確稱(chēng)羌活藥材粉取末2.0363 g，于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL100%甲醇，加熱回流0.5 h。 提取液過(guò)濾后，置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容，通過(guò)0.45 m膜過(guò)濾，待測(cè)。 4.4.4 不同提取次數(shù)的比較(1) 精確稱(chēng)羌活藥材粉取末10.0316 g，于100 mL圓底燒瓶中，加入50 mL甲醇，加熱回流第一次，回流0.5 h。(2) 取第一次回流抽濾后羌活藥材粉末于100 mL圓底燒瓶中，加入50 mL甲醇，加熱回流0.5 h。(3) 取第二次回流抽濾后羌活藥材粉末于100 mL圓底燒瓶中，加入50 mL甲醇，加熱回流0.5 h。(4) 取第三次回流抽濾后羌活藥材粉末于100 mL圓底燒瓶中，加入50 mL甲醇，加熱回流0.5 h。提取液過(guò)濾后，置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，通過(guò)0.45 m膜過(guò)濾，待測(cè)。5. 結(jié)果與討論5.1 HPLC分離條件的優(yōu)化為使目標(biāo)化合物羌活有效成分獲得較好的分離效果，使用甲醇-0.1磷酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫各組分分離情況如圖5-1、5-2、5-3所示： 圖5-1 羌活于甲醇-0.1%磷酸水溶液(v/v)，0-40min10%-100%的HPLC圖 色譜條件：色譜柱：YMC ODS-A C18柱（250 mm4.6 mm I.D,5 m）；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm ；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(v/v)，0-40min10%-100%；流速:1.0 mL/min；進(jìn)樣量:20L。圖5-2 羌活于甲醇-0.1%磷酸水溶液(v/v)，0-15 min36%-48%HPLC圖 色譜條件：色譜柱：YMC ODS-A C18柱（250 mm4.6 mm I.D,5 m）；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm ；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(v/v)，0-15 min36%-48%；流速:1.0 mL/min；進(jìn)樣量:20L。圖5-3 羌活有效成分HPLC圖 色譜條件：色譜柱：YMC ODS-A C18柱（250 mm4.6 mm I.D,5 m）；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm ；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(v/v)，0-30 min30%-45%；流速:1.0 mL/min；進(jìn)樣量:20L。結(jié)論：由圖5-1、5-2、5-3比較知，圖5-3分離效果較好。且根據(jù)文獻(xiàn)和峰面積及保留時(shí)間的比較可推測(cè)這四種物質(zhì)為：I阿魏酸、II羌活醇、III苯乙基阿魏酸酯、IV異嘔前胡素。 5.2 不同提取方法的比較為了考察不同提取方法對(duì)于提取效率的影響，使用無(wú)水乙醇為提取溶劑，分別采用冷浸提取0.5 h、超聲提取0.5 h、加熱回流（80）提取0.5 h。提取液經(jīng)抽濾瓶真空過(guò)濾后，用HPLC分析，結(jié)果如圖5-4所示：圖5-4 不同提取方法下各有效成分的峰面積比較圖由圖5-4可以看出：采用相同的提取溶劑，不同的提取方法對(duì)提取效率也有顯著的影響，其中的加熱回流提取效率最高，超聲次之，冷浸的提取效率最低。5.3 不同提取溶劑提取效率的比較為了選擇合適的提取溶劑，分別加入水、甲醇、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇為提取溶劑加熱回流提取0.5 h，提取液經(jīng)抽濾瓶真空過(guò)濾，0.45m膜過(guò)濾后用HPLC分析，結(jié)果如圖5-5所示：圖5-5不同提取溶劑下各有效成分的峰面積比較圖由圖5-5可以看出：在相同提取方法及提取時(shí)間下，提取溶劑的種類(lèi)對(duì)提取效率影響非常顯著，其提取效率由高到低依次為甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯。故純甲醇為最優(yōu)提取溶劑。 5.4 不同濃度甲醇提取效率的比較為了選擇乙醇合適的提取濃度，分別加入100%甲醇、90%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇為提取溶劑加熱回流提取0.5 h，提取液經(jīng)抽濾瓶真空過(guò)濾后，用HPLC分析，結(jié)果如圖5-6所示：圖5-6不同甲醇濃度下各有效成分的峰面積比較圖 由圖5-6可以看出：溶劑濃度對(duì)提取成分的提取率有較大影響，純甲醇提取效果是最好的。5.5 不同提取次數(shù)提取效率的比較為了考察提取次數(shù)對(duì)于提取效率的影響，使用甲醇為提取溶劑，分別將藥品連續(xù)加熱回流提取0.5 h四次，提取液經(jīng)抽濾瓶真空過(guò)濾后，用HPLC分析，結(jié)果如圖5-7所示：圖5-7不同提取次數(shù)下各有效成分的峰面積比較圖從以上數(shù)據(jù)可以看出：使用甲醇為提取溶劑，隨提取次數(shù)的增加，提取物中有效成分的含量逐漸降低，提取次數(shù)為三次時(shí)就能將生物堿提取完全。故采用純甲醇加熱回流3次，每次0.5 h為最佳提取工藝。 結(jié)論（1）本文對(duì)羌活中有效成分的提取進(jìn)行了研究，并運(yùn)用高效液相色譜法進(jìn)行了分離、分析。所建立方法簡(jiǎn)便，快速，靈敏度高，顯示了高效液相色譜法在中藥分析中有較大優(yōu)勢(shì)。（2）本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用冷浸、超聲和加熱回流提取三種方法，考察了不同提取方法對(duì)于提取效率的影響，結(jié)果表明加熱回流效率最高；通過(guò)采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水為提取溶劑，結(jié)果表明甲醇為最佳提取溶劑；通過(guò)采用30%、50%、70%、90%、100%濃度甲醇進(jìn)行提取，結(jié)果表明純甲醇效果最好；通過(guò)采用提取次數(shù)對(duì)于提取效率的影響，用純甲醇連續(xù)提取4次，結(jié)果表明用純甲醇回流3次羌活中有效成分就能提取完全。由此建立了羌活有效成分的最佳提取工藝為：以純甲醇為提取溶劑加熱回流提取3次，每次0.5 h。參考文獻(xiàn)1 王幼平，溥發(fā)鼎，王萍莉等中國(guó)特有屬-羌活屬的系統(tǒng)分類(lèi)研究J.云南植物研究，1996,18(4):424-430.2 國(guó)家藥典委員會(huì)中國(guó)藥典S.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005,127.3 饒高雄，楊祺，戴萬(wàn)生中藥獨(dú)活、羌活的本草沿革和植物來(lái)源J.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994,17(4):11-16.4 徐國(guó)鈞，徐珞珊，王崢濤常用中藥材品種整理和質(zhì)量研究，第3冊(cè)M.福建科學(xué)技術(shù)出版社，1997,191-228.5 孫輝，蔣舜媛，陳士林等高寒山區(qū)瀕危藥用植物羌活產(chǎn)地適宜性及生產(chǎn)區(qū)劃分析J.中國(guó)中藥雜志，2009,34(5):535-538.6 蔣舜媛，孫輝，周毅等寬葉羌活適生地分析及數(shù)值區(qū)劃研究J.中草藥，2009,40(4):638-643.7 鐘革正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選羌活揮發(fā)油的提取工藝J.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2008,2(11):26-27.8 蔣合眾，李芬，劉春光等羌活揮發(fā)油SFE.C02提取工藝研究J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008,36(5):17409 胡敏敏，蔡寶昌，張志杰等兩種方法提取羌活揮發(fā)油化學(xué)成分的比較J.中醫(yī)藥學(xué)刊，2006,24(10):1931-1932.10 徐國(guó)鈞，徐珞珊，王崢濤常用中藥材品種整理和質(zhì)量研究，第3冊(cè)福建科學(xué)技術(shù)出版社，1997,190-228.11 肖永慶，孫友富，劉曉宏羌活化學(xué)成分研究J.中國(guó)中藥雜志，1994,19(7):421.12 李麗梅，梁寶德，俞紹文等羌活的化學(xué)成分J.中國(guó)天然藥物，2007,5(5):35l-354.13 王曙，王天志寬葉羌活化學(xué)成分研究J.中國(guó)中藥雜