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文檔簡介
人外周血淋巴細胞微核測定,一、目的要求 1、掌握人外周血淋巴細胞微核標本制備方法。 2、熟悉人外周血淋巴細胞微核的形態(tài)特征。 3、了解微核的發(fā)生機制及微核檢測技術的用途。,二、實驗原理: 人外周血淋巴細胞大都處于細胞周期的G0期,在含有PHA的培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)后,原來處于G0期的淋巴細胞可轉化為淋巴母細胞,恢復分裂能力。在細胞分裂過程中,由于化學物質或輻射作用影響,可以引起淋巴母細胞染色體損傷,致使染色體斷裂,無著絲粒的染色體斷片不能隨染色體移動進入子細胞核,結果在細胞質中形成微核。本試驗是一種體外測試有害因子遺傳毒性的方法,通過在人類外周血淋巴細胞體外培養(yǎng)過程中加入受試物,檢測細胞微核情況來評價受試物的遺傳毒性。同時也成為檢測致突變、致癌、致畸物質對機體遺傳效應的一種重要手段。,三、實驗用品 (1)器材:離心管、注射器、培養(yǎng)瓶(10ml)、吸管、離心機、載玻片、冰箱、培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱。 (2)試劑:Giemsa染液、pH6.8磷酸緩沖液、RPMI1640培養(yǎng)液、PHA溶液、0.075molL KCl溶液、甲醇:冰醋酸固定液 (3)材料:人外周血、環(huán)磷酰胺溶液。,四、實驗步驟 1、按人類外周血染色體培養(yǎng)常規(guī)方法采血、接種,按組分別加入受試物(CP終濃度100ug/ml)培養(yǎng)72小時,收獲前不用加秋水仙素,收獲標本,離心,去上清液。 2、低滲:加入0.075molL KCl溶液4m1?;靹蚝蠓湃?7恒溫水浴箱中低滲處理10分鐘。低滲時間可根據預實驗中細胞完整程度進行調整。 3、預固定:低滲結束后加入甲醇冰乙酸(3:1)固定液lml,混勻后離心(1000rpm)5分鐘。 4、固定:棄上清液,加入5ml固定液,混勻后離心(1000rpm)5分鐘。棄上清液,留沉淀物??砂幢痉椒ㄔ俟潭ㄒ淮?。 5、滴片:加入少量固定液混勻成細胞懸液,滴片。 6、染色:用Giemsa染液染色 10分鐘。自來水細水沖洗后,晾干。,7、觀察與計數:先以低倍鏡、高倍鏡粗檢,選擇細胞分散均勻,染色良好的區(qū)域,轉到油鏡下觀察轉化的淋巴細胞,進行微核的觀察和計數。轉化淋巴細胞與未轉化淋巴細胞比較,前者細胞較大,胞核明顯偏離中心,染色質較細致疏松或呈網狀、核仁多,胞漿豐富,常見空泡和偽足。 微核的識別:微核是存在于已轉化的胞漿完整的淋巴細胞中的小核,其直徑為主核的13以下,形態(tài)為圓形或橢圓形,嗜色性和主核一致或略淺,必須與主核完全脫離。一個細胞中,不論出現一個微核或多個微核,均按一個有微核的細胞計數,微核細胞率以千分率表示,即1000個已轉化的淋巴細胞中有微核的細胞
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