蛋白質(zhì)分離純化及鑒定.ppt

凝膠過濾層析法 聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白質(zhì)分離純化及鑒定,凝膠過濾層析法,試驗原理,利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進行分離。,凝膠層析的原理,Kd=(Ve-Vo)/Vi,優(yōu)點 條件溫和 操作簡便 損失少回收率高 層析柱可反復(fù)使用,凝膠及凝膠柱的選擇 根據(jù)不同分子量選擇不同凝膠 Sephadex: 交聯(lián)葡聚糖 G-10，15，25，50，75，100，150，200；得水值 X 10 Sepharose：瓊脂糖凝膠 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝膠分子篩 Sephacryl：用N，N-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)的葡聚糖凝膠,凝膠柱的選擇,凝膠的前處理,溶脹：稱取適量凝膠干粉，用約10倍蒸餾水浸泡24小時以上，待凝膠充分溶脹后，傾去上層懸浮物及蒸餾水。 堿洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半個小時，然后用蒸餾水洗至中性。 酸洗：用0.5 M HCl 溶液浸泡半個小時，然后用蒸餾水洗至中性。 平衡：用起始緩沖液浸泡凝膠，直至凝膠液pH與起始緩沖液相同。,將層析柱垂直固定，加入適量溶劑排走空氣。 將平衡好的凝膠攪勻，連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至1/41/3高時打開下端出口，讓溶劑慢慢流出，繼續(xù)侵入凝膠至沉降到所需高度。裝柱時要注意操作壓。 用3-5倍柱床體積的起始緩沖液走柱，使交換劑充分平衡，柱床穩(wěn)定。,裝柱,樣品上柱、洗脫、收集。,如圖裝好層析裝置，打開下端出口，使溶液流出至剛好達到凝膠膠面 沿柱壁緩慢加入2ml樣品，打開下端出口，使樣品溶液流出至剛好達到凝膠膠面，再取少量起始緩沖液洗滌柱壁。 打開起始緩沖液閥門，連續(xù)洗脫。 用自動部分收集器自動或手動收集，合并同一高峰各管。,凝膠的再生及保存,再生 用過的凝膠經(jīng)0.5M的NaOH和HCl溶液分別處理后可以恢復(fù)其性能 凝膠的保存方法 0.02%疊氮鈉 或0.002%雙氯苯雙胍己烷,a. 分離蛋白質(zhì) b. 脫鹽 c. 蛋白質(zhì)分子量的測定,應(yīng)用,聚丙烯酰胺凝膠電泳,1原理 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在加速劑N，N，N，N-四甲基乙二胺(簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(簡稱AP)或核黃素(VB2)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱PAGE)。,1.1 聚丙烯酰胺凝膠優(yōu)點 化學(xué)性能穩(wěn)定，對pH和溫度變化不敏感； 重復(fù)性好； 靈敏度高，可達10-6 g； 分辨率高。,1.2 凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān),凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān),1.3 種類 連續(xù)系統(tǒng)與不目前常用的多為圓盤電泳(圖1)和板狀電泳(圖2)，兩者電泳原理完全相同。 聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)兩大類。,圖1 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖 (A為正面,B為剖面) (1)樣品膠 pH 6.7 (2)濃縮膠 pH 6.7 (3)分離膠 pH 8.9 (4)電極緩沖液 pH 8.3,圖2 夾心垂直板電泳槽示意圖 1.樣品槽模板 2.長玻璃板 1.導(dǎo)線接頭 2.下貯槽 3.凹形橡膠框 4.樣品槽模板 5.固定螺絲 6.上貯槽 7.冷凝系統(tǒng),圖3 蛋白質(zhì)微型電泳系統(tǒng),蛋白質(zhì)微型電泳系統(tǒng),1.4 不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成 濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH 6.7的Tris-HC1。 分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH 8.9 Tris-HC1。 電極緩沖液是pH 8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。,樣品濃縮效應(yīng) A. 凝膠孔徑不連續(xù)性 B. 緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性 C. 電位梯度的不連續(xù)性 分子篩效應(yīng) 電荷效應(yīng),1.5 不連續(xù)體系凝膠對蛋白的分離作用,2.1 SDS-不連續(xù)體系凝膠制備,2. 操作步聚,試劑名稱 分離膠 (8%) 濃縮膠 (4%) 分離膠緩沖液 1.25 ml / 濃縮膠緩沖液 / 0.5 ml 水 2.4 ml 1.2 ml TEMED 10 ul 5 ml AP 60 ul 25 ul,聚丙烯酰胺凝膠配制,操作步聚,2.2 樣品處理 適量濃度蛋白溶液加入1上樣緩沖液混勻，95水浴中處理5分鐘。 2.3 加樣 用微量進樣器取10-15 l上述混合液，通過電極緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。 2.4 電泳 將電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連接，打開電泳儀開關(guān)，開始時電流為10 mA，待樣品進入分離膠后，將電流調(diào)至20-30 mA，當(dāng)溴酚藍染料距硅膠框1 cm時，停止電泳，關(guān)閉電源。,2.5 染色