《酶聯(lián)免疫分析技術(shù)》PPT課件.ppt

2013-8-13,1,酶聯(lián)免疫分析技術(shù),ELISA檢測(cè),免疫檢驗(yàn),利用免疫檢測(cè)原理檢測(cè)與免疫相關(guān)的 物質(zhì)（抗原、抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子 等）,北京世紀(jì)壇醫(yī)院 李莉 免疫檢驗(yàn)技術(shù) 1.酶聯(lián)免疫分析技術(shù) 2.放射免疫分析技術(shù) 3.熒光免疫分析技術(shù) 4.化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) 5.金標(biāo)免疫分析技術(shù) 6.免疫印跡技術(shù) 7.免疫電泳技術(shù)等 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA), 利用免疫檢測(cè)原理檢測(cè)體液中的微量 物質(zhì)（激素、酶、血漿中的微量蛋白、 藥物濃度等） 這些檢測(cè)結(jié)果為臨床上確定診斷， 分析病情，調(diào)整治療方案和判斷預(yù)后 提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù) 。 酶聯(lián)免疫分析技術(shù) 是以酶標(biāo)記抗原/抗體為主要試劑的 一種標(biāo)記免疫分析技術(shù)，利用酶催化 底物反應(yīng)的生物放大作用，提高特異 性抗原抗體免疫學(xué)反應(yīng)檢測(cè)的敏感性 . 歷史,1971 年 瑞 典 學(xué) 者 Engvail 和 Perlmann, 荷 蘭 學(xué) 者 Van Weerman 和 Schuurs 分 別 報(bào) 道 將 免 疫 技 術(shù) 發(fā) 展 為 檢 測(cè) 體 液 中 微 量 物 質(zhì) 的固 相 免 疫 測(cè) 定 方 法 ， 即 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 測(cè) 定 法 (enzyme- linked immunosorbent assay , ELISA) 。,Ab Ag和Ab 分離，然后測(cè)定Ab Ag或Ab 的量，,2013-8-13,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的原理,以待測(cè) 抗原 （或 抗體 ）與酶 標(biāo)抗 體（或 抗原 ） 的特異 結(jié)合 反應(yīng)為 基礎(chǔ) ，通 過(guò)酶 活力測(cè) 定來(lái) 確定 抗原（或抗體）含量。 因?yàn)?結(jié)合 了 免疫 反 應(yīng) 和 酶催 化 反 應(yīng)， 所以 是 一種特異而又敏感的技術(shù)。,酶免疫技術(shù),Ab*+Ag,Ab*Ag+Ab*,異相法： * * * * 從而推算出 Ag量。,A g,*,過(guò)量Ab,*,Ab A g,*,Ab,均相法： Ab *Ag中的標(biāo)記物*失去特性，直接測(cè)定游離 Ab *的量，從而推算出Ag量。,A g,*,過(guò)量Ab,*,Ab A g,*,Ab,1,特異性,抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié) 合位點(diǎn)之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高 度的特異性。 測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。 2,2,最適比例,2013-8-13,3 敏感性,化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平 酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5- 10g/ml 免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿 標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá) ng/ml水平 例如， HBsAg，其敏感度可達(dá) 0.1ng/ml 。,特點(diǎn), ,靈敏度高 特異性強(qiáng) 準(zhǔn)確性好 試劑穩(wěn)定 方法簡(jiǎn)便,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 方法類型：,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的 分類 雙抗體夾心法（三明志法）原理,固相支持物表面 3,包被抗體,標(biāo)記抗體,待測(cè)物,底物,一步法 ELISA 反應(yīng)會(huì) 出現(xiàn)鉤狀效應(yīng),1.雙抗體夾心法（主要用于測(cè)抗原） 2.間接法（主要用于測(cè)抗體） 3.競(jìng)爭(zhēng)法（主要用于測(cè)小分子抗原 /半抗原和抗體） 4.捕獲法（主要用于測(cè)血清中某抗體的亞型） 鉤狀效應(yīng)（hook effect） 一般情況下的雙抗 體夾心法ELISA反應(yīng) 抗原過(guò)量時(shí),2013-8-13,間接法原理,間接法的影響因素 正常血清中所含的 高濃度的非特異性 抗體對(duì)間接法的影,包被物 底物 待測(cè)物 底物,標(biāo)記抗體 待測(cè)抗體 標(biāo)記抗原 包被抗體,固相支持物表面 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原的原理,（ 7 ）酶反應(yīng)終止 液。 固相支持物表面,響 抗原的純度對(duì)間 接法測(cè)抗體的影 響 ELISA試劑盒組分： ELISA中有三個(gè)必要的試劑： 免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物 。 （1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑 ）； （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（ 結(jié)合物 ）； （3）酶的底物 ； （4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定中），參考標(biāo)準(zhǔn) 品和控制血清（定量測(cè)定中）； （5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液； （6）洗滌液；,結(jié)合物 即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是 ELISA中關(guān)鍵的試劑 1 酶的催化活性 2抗體（或抗原）的免疫活性 3含有或少含有游離的抗體（或抗原）,4結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。 4,酶標(biāo)記的抗原或抗體 酶標(biāo)抗原 天然抗原 重組抗原 合成多肽抗原 酶標(biāo)抗體 單抗 多抗,2013-8-13,酶及底物,HRP的底物,DH2+ H2O2,D+ 2H2O,上式中， DH 2為供氧體， H2O 2為受氫體。 DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。 DH2如：鄰苯二胺 (OPD)、四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)和ABTS 。 OPD 氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后 ，在 492nm 處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方 便，是 HRP 結(jié)合物最常用的底物。,E,TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。 TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶 液試劑，只需與 H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后， TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng) 為450nm。 ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑 盒所采用。 HRP對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于 H2O2、小分醇的過(guò)氧 化物和尿素過(guò)氧化物 (urea peroxide)。 洗滌液,常用的 HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色 常用的稀釋液為含 0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。 液的最終體積而異，在板式 ELISA中一般采用 2mol/L。 5,AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì) 硝基苯磷酸酯作 為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在 405nm波長(zhǎng)處 有吸收峰。用 NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí) 間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸 4-甲基傘酮），可用 于 ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的 比色法。 酶反應(yīng)終止液,2013-8-13,對(duì)照設(shè)定 陽(yáng)性對(duì)照品 (positive control) 和陰性對(duì)照品 (negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果 的對(duì)照。 陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多 以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。加入的量應(yīng)與試劑的敏感 度相稱；在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可 以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量。 陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。例如 HBsAg檢測(cè),參考標(biāo)準(zhǔn)品 定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等） 應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括 覆蓋可檢測(cè)范圍的 4-5 個(gè)濃度，一般均配入含蛋 白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中 .,酶免疫測(cè)定操作中的注意事項(xiàng),的陰性對(duì)照品中不可含 HBsAg，最好抗 HBs也是陰性。 酶免疫測(cè)定操作中的注意事項(xiàng),試劑準(zhǔn)備, ,加樣 溫育 洗板 顯色 比色 結(jié)果判斷 結(jié)果報(bào)告及解釋,標(biāo)本的采取和保存 標(biāo)本為血漿和血清均可，血清標(biāo)本應(yīng)注意避免溶血，紅 細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以 HRP為標(biāo) 記的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色，出現(xiàn) 假陽(yáng)性反應(yīng)。 血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。 如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生 假陽(yáng)性反應(yīng)。 如在冰箱中保存過(guò)久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法 ELISA中可使本底加深。5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于 4， 超過(guò)一周測(cè)定的需低溫冰存。 反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如,需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。 6,試劑的準(zhǔn)備 從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度 與室溫平衡后使用。試劑盒 中本次試驗(yàn)不 需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。 同時(shí)應(yīng) 將相應(yīng)的質(zhì)控取出待溫度達(dá)到與室溫平衡。 注意：檢驗(yàn)人員應(yīng)經(jīng)常核對(duì)試劑說(shuō)明 書的具體內(nèi)容，能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)操作程 序的更改和標(biāo)準(zhǔn)曲線指控定值的更新。 所用蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。,2013-8-13,7,保溫 ELISA 屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固 相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔 中的標(biāo)本和酶標(biāo)記抗體，其中的抗原并不是都有均等 的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有最貼近孔壁的一層溶液 中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程， 因 此 需經(jīng) 擴(kuò)散 才能 達(dá) 到反 應(yīng)的 終點(diǎn) 。這 就 是為 什么 ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。 溫育,溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫育溫度高，則所,需時(shí)間相對(duì)較短。,“邊緣效應(yīng)”的排除 : 使用水浴或在將反應(yīng)溶液加 入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如 37），就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，并且 可提高測(cè)定的重復(fù)性。,保溫 溫 育 常 采 用 的 溫 度 有 43 、 37 、 室 溫 和 4 （冰箱溫度）等。37是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度， 也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。 保溫的方式一般均采用水浴，可將 ELISA 板置于 水 浴 箱中 ， ELISA 板 底 應(yīng)貼 著水 面， 使溫 度 迅速 平衡 。 為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋。 另外保溫的方式還有 ELISA儀器附有特制的電熱塊 反 應(yīng) 板 均 不 宜 疊 放 ， 以 保 證 各板 的 溫度 都 能 迅 速平衡。 室 溫 溫 育 的 反 應(yīng) ， 操 作 時(shí) 的 室溫 應(yīng) 嚴(yán)格 限 制 在 規(guī) 定 的 范圍 內(nèi) ， 標(biāo)準(zhǔn) 室 溫溫 度 是指 20-25 ， 應(yīng)注 意 溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)， 一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。 加樣 ELISA中一般有 3次加樣步聚：即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。,加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在 ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注,意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更, ,換 吸 頭 ， 以 免 發(fā) 生 交 叉 污 染 。 然 后 在 微 型 震 蕩 器 上 震 蕩 1分 鐘 以 保 證 充分混和。 加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器 ，使加液過(guò)程 迅速完成。 從滴瓶中滴加試劑，除了要注意滴加角度外，滴加速度也很重要，滴,加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會(huì)在孔 內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。,洗滌,洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著 實(shí)驗(yàn)的成敗。 ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。 清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的 干擾物質(zhì)。 可以說(shuō)在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。,洗滌的方式：自動(dòng)洗滌儀,手工操作,全自動(dòng)加樣系統(tǒng)的標(biāo)本“交叉污染”問(wèn)題 洗板, ,每次溫育后洗板是否徹底，與非特異背景顯色有很大關(guān) 系。 洗板液一般為含 0.05% Tween20的中性PBS。 Tween20 為 一 種 非 離 子 去 垢 劑 ， 既 含 親 水 基 團(tuán) ， 也 含 疏 水基團(tuán)。 洗滌作用機(jī)理，借助其疏水基團(tuán)與固相上蛋白的疏水基 團(tuán)形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時(shí)在其 親水基團(tuán)與液相中水分子的結(jié)合作用下 ，促使蛋白質(zhì)脫 離固相而進(jìn)入液相,洗 板 液 中 Tween20 濃 度 高 于 0.2% ， 可 使 包 被 于 固 相 上 的 抗原或抗體解吸附而影響試驗(yàn)測(cè)定下限。,2013-8-13,8,顯色 顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催 化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是 影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色， 而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。 注意：OPD底物顯色一般在37反應(yīng)20-30分鐘 后即不再加深，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高。 OPD底物液受光照會(huì)自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行， 顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入終止液終止反應(yīng).OPD產(chǎn)物用硫酸 終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。 顯 色,加入底物 A和B后，應(yīng)振蕩混勻, ,當(dāng)?shù)孜餅?OPD時(shí)，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行 一般商品試劑盒顯色反應(yīng)條件為 37 或室溫 反應(yīng) 1530 min。從理論上說(shuō)， 37 30分鐘 才可以使 HRP的底物催化反應(yīng)完全，盡管在最 初的 10分鐘內(nèi)，絕大部份催化反應(yīng)即可完成。 因此，為使弱陽(yáng)性樣本孔能有充分的顯色， 建議在 37下反應(yīng)2530分鐘后，終止反應(yīng) 比色測(cè)定。,顯色 TMB 受光照的影響不大，可在室溫中置于操 作 臺(tái) 上 ， 邊 反應(yīng) 觀 察 結(jié)果 。 但 為保 證 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。 TMB 經(jīng) HRP 作 用 后 ， 約 40 分 鐘 顯 色達(dá) 頂 峰 ， 隨即逐漸減弱，至 2 小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。 TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉 （ SDS ）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止能使藍(lán)色維 持較長(zhǎng)時(shí)間。 此 外 ， 各 類酸 性 終 止液 則 會(huì) 使藍(lán)色 轉(zhuǎn) 變 成 黃色，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)（ 450nm ）測(cè)讀吸光 值。 比色,加酸終止顯色反應(yīng)后，比色測(cè)定前應(yīng)振蕩混勻, 先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀 的比色架中，正確選擇波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)。用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀 ，即每孔先后測(cè) 讀兩次，第一次在最適波長(zhǎng)（ W1 ），第二次在不敏感波長(zhǎng) （ W2 ），兩次測(cè) 定間不移動(dòng) ELISA 板的位置。例如 OPD 用 492nm 為 W1 ， 630nm 為 W2 ，最終測(cè)得 的 A 值為兩者之差（ W1-W2 ）。雙波長(zhǎng)式測(cè)讀可減少由容器上的劃痕或指印 等造成的光干擾。 各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書。酶標(biāo)儀的主要性 能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍 、線性 等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到 0.001 ，準(zhǔn)確性為1%，重復(fù)性達(dá) 0.5% 。操作時(shí)室溫宜在 15-30，使用前先預(yù)熱儀器 15-30 分鐘， 測(cè)讀結(jié)果 更穩(wěn)定。,結(jié)果判斷 在間接法和夾心法ELSIA 中，陽(yáng)性孔呈色深于 陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于 陽(yáng)性孔。,結(jié)果判定 1、定性測(cè)定的結(jié)果判斷是對(duì)受檢標(biāo)本中是否含有待測(cè)抗 原或抗體作出“有”或“無(wú)”的簡(jiǎn)單回答，分別用“陽(yáng) 性”、“陰性”表示?！瓣?yáng)性”表示該標(biāo)本在該測(cè)定系 統(tǒng)中有反應(yīng)?！瓣幮浴眲t為無(wú)反應(yīng)。用定性判斷法也可 得到 半定量結(jié)果，即用滴度來(lái)表示反應(yīng)的強(qiáng)度，其實(shí)質(zhì) 仍是一個(gè)定性試驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件的不同、陰性對(duì)照值 和陽(yáng)性對(duì)照值來(lái)判定陰陽(yáng)。 2、定量測(cè)定的結(jié)果判定是每批測(cè)試均須用一系列不同濃 度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo) 本的吸光度值不同來(lái)確定待測(cè)物的濃度。,9, ,2013-8-13 質(zhì)量控制 （Quaility Control,Q.C）,結(jié)果判斷：按試劑盒所定的 CUT-OFF 值判斷陰或陽(yáng)性結(jié)果， 不能以其它標(biāo)準(zhǔn)判斷。 Cut-off 值的確立應(yīng)盡可能地避免假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果的出 現(xiàn)，即敏感性和特異性相加的值達(dá)到最大。 結(jié)果報(bào)告：陰性或陽(yáng)性。 灰區(qū)內(nèi)的結(jié)果建議患者過(guò)一段時(shí)間 復(fù)查。 室內(nèi)質(zhì)量控制 質(zhì)控品濃度的選擇 S/CO 2-3 或同時(shí)選擇 S/CO處于1.5左右的質(zhì)控血清以 判斷每次測(cè)定時(shí)試劑盒測(cè)定下限的有效性。 CUTOFF 值計(jì)算 S/CO 值計(jì)算 繪制質(zhì)控圖 質(zhì)控圖-定性,質(zhì)控血清分定值和未定值兩種。如只用一份質(zhì)控 血清定值，一般定在正常值與異常值交界點(diǎn)上，定性 測(cè)定時(shí)處于弱陽(yáng)性水平，稱為臨界值。乙肝標(biāo)志物臨 界值的制定，應(yīng)按臨床要求，為臨床提供統(tǒng)一的判斷 弱陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)。 臨界值質(zhì)控血清可以作為試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照品 和陰性對(duì)照品以外的第三個(gè)對(duì)照品，它可以靈敏地反 映出試劑盒的 檢出水平，確保弱陽(yáng)性反應(yīng)的標(biāo)本不 漏檢。 質(zhì)控圖-定量 失控的處理及糾正,2013-8-13,10,ELISA法檢測(cè)失控糾正措施, ,+ 2-2s,+ 1-3s 分析失控原因（質(zhì)控品、試劑、檢測(cè)環(huán)節(jié)） 復(fù)檢所有陽(yáng)性樣本 - 2-2s, - 1-3s,分析失控原因（質(zhì)控品、試劑、檢測(cè)環(huán)節(jié)） 復(fù)檢所有陰性樣本, ,標(biāo)本因素 試劑因素 操作因素,ELISA測(cè)定影響因素,標(biāo)本因素, ,內(nèi)源性干擾因素：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、異 嗜性抗體、治療性抗體、自身抗體、溶菌 酶、磷脂、藥物小分子、總蛋白濃度等 外源性干擾因素：溶血、細(xì)菌污染、標(biāo)本 貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、凝固不全、反復(fù)凍融,內(nèi)源性干擾因素,1.類 風(fēng) 濕 因 子 ： 人 血清 中 IgM 、 IgA 型類 風(fēng)濕 因 子（ rheu-matoid factor,RF ） 可以與 ELISA 系統(tǒng)中的 捕獲抗體及 酶標(biāo)志二抗 體的 Fc 段直接結(jié)合，從而 導(dǎo)致假 陽(yáng)性。 2. 補(bǔ) 體 ： ELISA 系統(tǒng)中一抗和標(biāo)記二抗過(guò)程 中，抗體 分子發(fā)生變構(gòu) ，其 Fc 段的 CIq分子結(jié)合點(diǎn)被暴露出來(lái)，使Ciq 可以將二者連接起來(lái)，從而造成假陽(yáng)性 。解 決的辦法是：（ 1 ）用 1.5 乙二胺四 乙酸二鉀鹽（ EDTA ）稀釋標(biāo)本；（ 2 ）用 530C10min 加熱血清使 Ciq滅活。 3. 嗜 異性 抗體 ：人類血清中含天然嗜異性抗體， 該 抗體將 ELISA 系統(tǒng)中一抗和 標(biāo)記二抗二者連接起來(lái)，也可導(dǎo)致假陽(yáng)性。 4.嗜靶抗原的自身抗體 ：抗甲狀腺球旦白、抗胰導(dǎo)素抗體等嗜靶抗原的自身抗 體，有時(shí)能與靶抗原結(jié)合形成抗原 - 抗體復(fù)合物，在ELISA 測(cè)定方法中均可干擾 抗原-抗體測(cè)定結(jié)果。,內(nèi)源性干擾因素 5.醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig(s)抗體：臨床開展的用醫(yī)源性CD3等 單克隆抗體，用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及 靶向治療等技術(shù)，均可使這些患者產(chǎn)生抗體這些患者在 ELISA測(cè)定時(shí)均可產(chǎn)生假陽(yáng)性。 6.病毒變異：病毒變異所致的假陰性主要表現(xiàn)在HB-sAg的檢 測(cè)，HBV的S基因負(fù)責(zé)編碼表達(dá)表面抗原，即S旦白，任何影 響S旦白表達(dá)水平或抗原性的突變，都可能導(dǎo)致表面抗原檢測(cè) 出陰性結(jié)果。 7.標(biāo)本中其它成分的影響：血清脂質(zhì)過(guò)高、膽紅素、血紅蛋 白及血液黏度過(guò)大等，均對(duì)ELISA結(jié)果有干擾作用。,外源性干擾因素 1.標(biāo)本溶血：由于各種人為因素引起的標(biāo)本溶血，均可因紅細(xì)胞破壞時(shí)釋放 大量過(guò)氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過(guò)氧化酶為標(biāo)記的ELISA測(cè)定 方法中，會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色，而干擾測(cè)定結(jié)果。 2.標(biāo)本受細(xì)菌污染：因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過(guò)氧化酶，因此，被細(xì)菌 污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色，而干擾測(cè)定結(jié)果。 血清標(biāo)本如是以無(wú)菌操作分離，則可以在 2 8下保存一周，如為有菌 操作，則建議冰凍保存。樣本的長(zhǎng)時(shí)間保存，應(yīng)在 70以下 3.標(biāo)本保存不當(dāng)：在冰箱中保存過(guò)久的標(biāo)本，血清IgG可聚合成多聚體，在 間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深，甚至造成假陽(yáng)性；標(biāo)本放置時(shí)間過(guò) 長(zhǎng)，有時(shí)抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾， ELISA標(biāo)本宜為新鮮采集，如不能測(cè)定，5天內(nèi)測(cè)定的可放40C冰箱，1 周后測(cè)定的應(yīng)放低溫保存，凍存后溶解的標(biāo)本，蛋白局部濃縮，分布不均， 應(yīng)充分混均后再測(cè)定，但混均時(shí)應(yīng)輕柔，不可劇烈振蕩。,2013-8-13,11,外源性干擾因素,4.血液采集后，如收集管中無(wú)促凝劑和抗凝劑 ，則血液通常 在半小時(shí)后開始凝固， 1824h 完全凝固 。日常檢驗(yàn)中，常 在血液還未開始凝固時(shí)即離心分離血清，此時(shí)因血液沒(méi)有 完全凝固，離出的“血清”并非為完全的血清，其中仍殘 留 部 分 纖 維 蛋 白 原 ， 如 將 其 加 入 微 孔 中 ， 在 ELISA 測(cè) 定 過(guò) 程中仍可以形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié) 果。 5. 標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響：抗凝劑（如肝素 EDTA ）、酶抑 制劑（如 NaN3 可可抑制辣根過(guò)氧化酶活 性）及快速離心膠 等均可對(duì)測(cè)定產(chǎn)生一定的干擾作用。,影響ELISA試劑盒質(zhì)量的因素, ,固相材料 :聚苯乙烯塑料 抗原:純化、合成和基因工程抗原 抗體：多抗、單抗和基因工程抗體 酶結(jié)合物：酶免疫測(cè)