《藥物化學(xué)復(fù)習(xí)》PPT課件.ppt

藥物篩選復(fù)習(xí)課,選擇藥物作用靶標(biāo)的考慮因素,1 靶標(biāo)的有效性，即靶標(biāo)與疾病確實(shí)相關(guān)，并且通過調(diào)節(jié)靶標(biāo)的生理活性能有效地改善疾病癥狀。 2 靶標(biāo)的副作用，如果對(duì)靶標(biāo)的生理活性的調(diào)節(jié)不可避免地產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，那么將其選作藥物作用靶標(biāo)是不合適的。,從天然資源中尋找微生物先導(dǎo)藥的一般流程,1.采集各種來源的樣品 2.根據(jù)不同的分離要求進(jìn)行處理 3.對(duì)各類微生物分離純化 4.分離菌株的培養(yǎng)、發(fā)酵 5.應(yīng)用各種模型對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行高通量篩選 6.對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)分離純化及結(jié)構(gòu)測(cè)定 7.活性物質(zhì)體內(nèi)外活性評(píng)價(jià) 8.先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化及深入研發(fā) 9.放大發(fā)酵積累量進(jìn)行臨床研究,影響微生物合成的主要因素,影響其合成效率的主要因素有：所用微生物的種類、底物、酶、培養(yǎng)基類型、溫度等。 （一）微生物 微生物種類不同，其代謝以及合成的產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型乃至生物活性多不相同，擴(kuò)大微生物的來源是尋找新的微生物產(chǎn)物的有效途徑之一 （二）酶及底物 由于生物合成酶的底物專一性較低，在其野生型菌株或阻斷突變株的發(fā)酵過程中添加一些結(jié)構(gòu)類似物可作為前體產(chǎn)生新的微生物產(chǎn)品 （三）其他培養(yǎng)條件 微生物體具有的合成能力在適宜其生長(zhǎng)的條件下會(huì)增強(qiáng)，也會(huì)因改變培養(yǎng)基成分而隨之 變化，當(dāng)環(huán)境不利時(shí)則會(huì)抑制其合成。,微生物發(fā)酵法,發(fā)酵是利用未固定的微生物在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)來獲得所需產(chǎn)品，能夠進(jìn)行批次性的生產(chǎn)； 發(fā)酵罐通常為含微生物營(yíng)養(yǎng)基的大槽或大桶。發(fā)酵罐常配有能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)基溫度、pH和氧氣含量的調(diào)節(jié)器； 典型的培養(yǎng)基含碳源如葡萄糖、水合淀粉或果糖； 蛋白質(zhì)或氮源如大豆粉、玉米湯或棉籽粉； 維生素源如酵母提取物；礦物質(zhì)和其他混合性營(yíng)養(yǎng)物。,初級(jí)代謝與次級(jí)代謝,一般將微生物通過代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的自身繁殖所必需的物質(zhì)和能量的過程，稱為初級(jí)代謝，該過程所產(chǎn)生的產(chǎn)物即為初級(jí)代謝產(chǎn)物，如氨基酸、核苷類，以及酶或輔酶等。 微生物的初級(jí)代謝是指微生物從外界吸收各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過分解代謝和合成代謝，生成維持生命活動(dòng)所需要的 物質(zhì)和能量的過程。 次級(jí)代謝與初級(jí)代謝關(guān)系密切，次級(jí)代謝是指微生物在一定的生長(zhǎng)時(shí)期，以初級(jí)代謝的關(guān)鍵性中間產(chǎn)物為前體物質(zhì)，合成一些對(duì)微生物的生命活動(dòng)無明確功能的物質(zhì)的過程，這一過程的產(chǎn)物，即為次級(jí)代謝產(chǎn)物。 次級(jí)代謝產(chǎn)物在微生物生命活動(dòng)過程中的產(chǎn)生極其微量，對(duì)微生物本身的生命活動(dòng)沒有明顯作用，當(dāng)次級(jí)代謝途徑被阻斷時(shí)，菌體生長(zhǎng)繁殖仍不會(huì)受到影響。,微生物固定法,細(xì)胞固定就是將微生物種在一個(gè)不溶的細(xì)胞性或非細(xì)胞性模塊上，模塊可以是合成的聚合物、生物聚合物或微生物體本身。 微生物固定有 種常用的方法，包括在模塊中誘導(dǎo)、模塊上吸附、壓縮入模塊、與模塊以共價(jià)鍵結(jié)合、細(xì)胞間的化學(xué)交叉結(jié)合以及絮凝，最常用的是誘導(dǎo)。,基因突變的種類,根據(jù)遺傳信息的改變方式，可分為同義突變、錯(cuò)義突變和無義突變?nèi)N。 同義突變：改變后的密碼子和改變前的密碼子是簡(jiǎn)并密碼子，它們編碼同一種氨基酸，這種基因突變稱為同義突變 錯(cuò)義突變：由于一對(duì)或幾對(duì)堿基對(duì)的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變?yōu)闆Q定另一種氨基酸的密碼子的基因突變叫錯(cuò)義突變。這種基因突變有可能使它所編碼的蛋白質(zhì)部分或完全失活 無義突變：由于一對(duì)或幾對(duì)堿基對(duì)的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變成一個(gè)終止密碼子的基因突變叫無義突變。其中密碼子改變?yōu)閁AG的無義突變又叫琥珀突變，密碼子改變成UAA的無義突變又叫赭石突變,基因突變的特點(diǎn),1、基因突變?cè)谏锝缰惺瞧毡榇嬖诘?2、基因突變是隨機(jī)發(fā)生的。它可以發(fā)生在生物個(gè)體發(fā)育的任何時(shí)期和生物體的任何細(xì)胞 3、在自然狀態(tài)下，對(duì)一種生物來說，基因突變的頻率是很低的 4、大多數(shù)基因突變對(duì)生物體是有害的 5、基因突變是不定向的。一個(gè)基因可以向不同的方向發(fā)生突變，產(chǎn)生一個(gè)以上的等位基因,基因突變與藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用,在基因水平上尋找藥物靶標(biāo)過程： 1 尋找疾病相關(guān)生物分子線索：利用基因突變技術(shù)獲取疾病相關(guān)的生物分子信息，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲取線索。 2 對(duì)相關(guān)的生物分子進(jìn)行功能研究，以確定候選藥物作用靶標(biāo)。 3 候選藥物作用靶標(biāo)，設(shè)計(jì)基因突變的DNA及其多肽在分子、細(xì)胞和整體動(dòng)物水平上進(jìn)行藥理學(xué)研究。 4 驗(yàn)證靶標(biāo)的有效性。,Microarray 或 Biochip （生物芯片）是一種微型多參數(shù)生物傳感器。它通過在一微小的基片表面固定大量的分子識(shí)別探針，或構(gòu)建微分析單元和系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物、蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞或其它生物組分準(zhǔn)確、快速、大信息量的篩選或檢測(cè)。 A microarray is an ordered array of microscopic elements on a planar substrate that allows the specific binding of genes or gene products.,蛋白質(zhì)芯片,蛋白質(zhì)芯片是將各種蛋白質(zhì)有序地固定在玻片、凝膠、微孔板等各種載體上形成密集蛋白質(zhì)芯片，用來高通量地測(cè)定蛋白質(zhì)的生物活性，如酶活性、蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)問及蛋白質(zhì)一其它分子，如蛋白質(zhì)一DNA、蛋白質(zhì)一配基問的相互作用。,免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation),免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 其基本原理是:細(xì)胞裂解液中加入抗體，與抗原形成特異免疫復(fù)合物，經(jīng)過洗脫，收集免疫復(fù)合物，然后進(jìn)行SDS-PAGE及Western blotting分析。,特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： （1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)； （2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響； （3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)為： 缺點(diǎn)： （1）可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用； （2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； （3）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。,放射免疫性檢測(cè)(RIA，Radioimmunoassay）,放射免疫性檢測(cè)(RIA，Radioimmunoassay)的基本原理是 利用標(biāo)記抗原(Ag* )和非標(biāo)記抗原(Ag)對(duì)特異性抗體(Ab)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，用已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物和一定量的Ag*及限量的Ab反應(yīng)，采取一定方法將Ag*-Ab與Ag*分開，即可算出該標(biāo)準(zhǔn)物在各濃度下Ag*-Ab復(fù)合物的結(jié)合百分率。 然后，加入要篩選的目標(biāo)物在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查出樣品中是否含有要篩選的目標(biāo)物及其濃度。,親和閃爍檢測(cè)法Scintillation Proximity Assay, SPA,該技術(shù)使用能產(chǎn)生冷光的特制平板或圓球微粒，其底部或外層包被著連接分子，通過化學(xué)處理可使抗體、受體蛋白質(zhì)和酶偶聯(lián)到含閃爍的微球體（熒光微球體或SPA）的表面上，當(dāng)其和同位素標(biāo)記的配體特異性結(jié)合，近距離釋放射線能量激發(fā)產(chǎn)生冷光，繼而被探測(cè)器所監(jiān)測(cè)；不能特異性結(jié)合的小分子，其標(biāo)記同位素所發(fā)出的射線能量大部分被水溶液散射，而不足以激發(fā)產(chǎn)生冷光?？墒褂瞄W爍計(jì)數(shù)器方便地測(cè)定。,Homogeneous Assays One-pot assays with no transfer or wash steps All the reagents are added in one step or in multisteps The signal is read in a plate reader Heterogeneous Assays 多步篩選：multiple additions/incubations/washings/ transfers/filtrations/readings of the signal Labor intensive, complicated step, hard to automate,SPR基本原理,它利用P偏振光在玻璃與金屬薄膜界面處發(fā)生全內(nèi)反射時(shí)滲透到金屬薄膜內(nèi)的消失波,引發(fā)金屬中的自由電子產(chǎn)生表面等離子體, 當(dāng)表面等離子體與消失波的頻率相等時(shí),二者將發(fā)生共振,界面處的全反射條件將被破壞, 呈現(xiàn)衰減全反射現(xiàn)象，入射光被金屬表面電子吸收,使反射光能量急劇下降,SPR的優(yōu)點(diǎn),待測(cè)物無需標(biāo)記 適用于混濁、不透明或者有色溶液 能實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)動(dòng)態(tài)過程 檢測(cè)方便、快捷 應(yīng)用范圍廣，檢測(cè)靈敏度高 始終保持生物分子的活性,SPR缺點(diǎn),難以區(qū)分非特異性吸附 對(duì)溫度、樣品組成等干擾因素敏感 多步結(jié)合和多價(jià)結(jié)合的干擾 空間位阻效應(yīng) 配體或者分析物的不均一 擴(kuò)散速度的限制 重結(jié)合現(xiàn)象,SPR的應(yīng)用,對(duì)生物分子進(jìn)行識(shí)別及定量檢測(cè) 研究生物分子間的相互作用,用SPR可獲得的信息： 兩個(gè)分子之間結(jié)合的特異性 目標(biāo)分子的濃度 結(jié)合以及解離過程的動(dòng)力學(xué)參數(shù) 結(jié)合的強(qiáng)度,報(bào)告基因檢測(cè),報(bào)告基因檢測(cè)（report gene assay） 報(bào)告基因 (reporter gene) 是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。,報(bào)告基因的特點(diǎn)： (1)已被克隆和全序列已測(cè)定； (2)表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中不存在，即無背景，在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中無相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物； (3)其表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行定量測(cè)定。,報(bào)告基因的種類,1、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 2、半乳糖苷酶 3、人生長(zhǎng)激素 4、熒光素酶 5、熒光蛋白,熒光產(chǎn)生的原因,原子熒光光譜的產(chǎn)生 氣態(tài)自由原子吸收光源的特征輻射后，原子的外層電子躍遷到較高能級(jí)，然后又躍遷返回基態(tài)或較低能級(jí)，同時(shí)發(fā)射出與原激發(fā)波長(zhǎng)相同或不同的發(fā)射即為原子熒光。原子熒光是光致發(fā)光，也是二次發(fā)光。當(dāng)激發(fā)光源停止照射之后，再發(fā)射過程立即停止。,時(shí)間分辨熒光（HTRF）,一般熒光技術(shù)的缺點(diǎn)是熒RF光壽命短，背景熒光高，激發(fā)光和發(fā)射光容易相互干擾 HTRF主要是利用堿土金屬壽命長(zhǎng)的特點(diǎn)，可以在激發(fā)和檢測(cè)之間延緩一段時(shí)間，使具有不同熒光壽命的物質(zhì)達(dá)到分別檢測(cè)的目的。同時(shí)通過熒光諧振能量傳遞原理，區(qū)分開激發(fā)光和發(fā)射光,熒光偏振（Fluorescence Polarization，F(xiàn)P） 1926年P(guān)errin首次在研究論文中描述他所觀察到的熒光偏振現(xiàn)象。以一束單一波長(zhǎng)的偏振光照射溶液中的熒光物質(zhì)，后者可吸收并釋放出相應(yīng)的偏振熒光。如果被激發(fā)的熒光物質(zhì)處于靜止?fàn)顟B(tài)，該物質(zhì)仍將保持原有激發(fā)光的偏振性，如果其處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，該物質(zhì)發(fā)出的偏振光將區(qū)別于原有激發(fā)光的偏振特性，也就是所謂熒光去偏振現(xiàn)象。當(dāng)熒光染料被單極光激發(fā)釋放熒光，產(chǎn)生水平和垂直方向光束。水平和垂直方向光通量的比值即為偏振值（mP）。mP大小主要由熒光物質(zhì)分子旋轉(zhuǎn)速度決定，而旋轉(zhuǎn)速度與分子大小呈反比。小分子熒光染料與其他分子結(jié)合后，分子量增加而旋轉(zhuǎn)速度降低，則熒光偏振值（Mp）升高；相反，如小分子熒光染料從已結(jié)合的分子上解離，則熒光偏振值降低。由于FP 直接檢測(cè)水平和垂直方向光通量比值，Mp 值不受絕對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，具有操作簡(jiǎn)單、快速；分析結(jié)果穩(wěn)定；成本低、高通量和易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。,酶聯(lián)免疫吸附 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。,雙抗體夾心ELISA,1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。 2）加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。 洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。 3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。 4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。 在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原。,競(jìng)爭(zhēng)性ELISA,當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，從而反映出抗體的量,PCR引物的設(shè)計(jì)原則總述,引物長(zhǎng)度（primer length） 產(chǎn)物長(zhǎng)度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G+C含量（composition） 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu) （duplex formation and hairpin） 閱讀框,質(zhì)粒的定義,中文名稱： 質(zhì)粒 英文名稱： plasmid,質(zhì)粒是一類存在于細(xì)菌和真菌細(xì)胞中，能獨(dú)立于染色體DNA而自主復(fù)制的共價(jià)，閉合，環(huán)狀DNA分子，其大小通常在1-100kb范圍內(nèi)。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能存活，而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,具有對(duì)受體細(xì)胞的可移植性或親和性 具有與特定細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)和整合位點(diǎn) 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn) 具有合適的選擇性標(biāo)記,一個(gè)理想載體應(yīng)具備的條件,質(zhì)粒的改造和構(gòu)建：指導(dǎo)思想,刪除不必要的DNA區(qū)域，盡量縮小質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量，以提高外源DNA片段的裝載量。 滅活某些質(zhì)粒的編碼基因，如促進(jìn)質(zhì)粒在細(xì)菌種間轉(zhuǎn)移的mob基因，杜絕質(zhì)粒擴(kuò)散污染環(huán)境，保證DNA重組實(shí)驗(yàn)的安全 加入易于識(shí)別的選擇標(biāo)記基因，最好是雙重或多重標(biāo)記，便于檢測(cè)含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。 在選擇性標(biāo)記基因內(nèi)引入具有多種限制性內(nèi)切酶識(shí)別及切割位點(diǎn)的DNA序列，同時(shí)刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)。 根據(jù)外源基因克隆的不同要求，分別加裝特殊的基因表達(dá)調(diào)控元件或用于表達(dá)產(chǎn)物親和層析分離的標(biāo)簽編碼序列。 非結(jié)合型，即要求質(zhì)粒不會(huì)從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌。,腫瘤的發(fā)生不僅是分裂失控導(dǎo)致的細(xì)胞過度增生，同時(shí)也可能是細(xì)胞凋亡通路受阻，使本該死亡的細(xì)胞繼續(xù)存在而產(chǎn)生腫瘤，因此，選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡為目標(biāo)的技術(shù)已成為腫瘤治療的重要策略之一。細(xì)胞凋亡是存在于細(xì)胞中的自毀機(jī)制，細(xì)胞凋亡能夠使機(jī)體清除衰老和異常的細(xì)胞，在維持許多細(xì)胞功能方面起到重要作用。 1972年kerr等首先提出“細(xì)胞凋亡”這一概念，是由體內(nèi)外因素觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)置的死亡程序誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，自己結(jié)束其生命的過程，具有嚴(yán)格的基因時(shí)控性和選擇性。生物體各種細(xì)胞的數(shù)量都是通過增殖與死亡之間的平衡來完成的。,細(xì)胞周期,細(xì)胞周期指由細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，所需的時(shí)間叫細(xì)胞周期時(shí)間。 G1期(gap1)，指從有絲分裂完成到期DNA復(fù)制之前的間隙時(shí)間。 S期(synthesis phase)，指DNA復(fù)制的時(shí)期，只有在這一時(shí)期H3-TDR才能摻入新合成的DNA中。 G2期(gap2)，指DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始之前的一段時(shí)間。 M期又稱D期(mitosis or division)，細(xì)胞分裂開始到結(jié)束。,微管的功能,細(xì)胞內(nèi)，微管以胞質(zhì)微管和紡錘體微管兩種形式存在，主要參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞器的定位、胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸及真核細(xì)胞的有絲分裂過程。 細(xì)胞進(jìn)入分裂期，其胞質(zhì)微管解聚成微管蛋白后再組裝成紡錘體微管。 在分裂后期，紡錘體微管牽引著姊妹染色單體從赤道面移向紡錘體的兩極。 在有絲分裂結(jié)束后，紡錘體微管解聚再組裝成胞質(zhì)微管。,抗結(jié)核藥物的篩選,What is 結(jié)核病?,結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病。結(jié)核菌可能侵入人體全身各種器官，但主要侵犯肺臟，稱為肺結(jié)核病。 是青年人容易發(fā)生的一種慢性和緩發(fā)的傳染病。一年四季都可以發(fā)病，15歲到35歲的青少年是結(jié)核病的高發(fā)峰年齡。潛伏期48周。其中 結(jié)核桿菌80發(fā)生在肺部，其他部位(頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼)也可繼發(fā)感染。人與人之間呼吸道傳播是本病傳染的主要方式。傳染源是接觸排菌的肺結(jié)核患者。,結(jié)核桿菌,當(dāng)前抗結(jié)核治療藥物,Screen ing,臨床常用治療藥物,當(dāng)常規(guī)治療失敗后可使用二線抗結(jié)核藥物,臨床常用治療藥物及耐藥靶點(diǎn),一線抗結(jié)核藥物作用靶點(diǎn)的突變使原有藥物的作用蛋白構(gòu)像發(fā)生了改變,利福平，異煙肼，鏈霉素，乙胺丁醇和吡嗪酰胺 這些藥物不良反應(yīng)多、殺菌作用不強(qiáng)、療程必須使用個(gè)月以上，患者依從性差。,卷曲霉素、乙硫異煙胺、對(duì)氨基水楊酸、環(huán)絲氨酸、環(huán)丙沙星、阿米卡星和卡那霉素 不良反應(yīng)較大，治療時(shí)間更長(zhǎng)（個(gè)月），花費(fèi)昂貴，治愈率也更低,年我國(guó)總耐藥率為，其中初始耐藥率為.，獲得性耐藥率為.,抗結(jié)核藥物新靶點(diǎn),與胞壁合成相關(guān)的新靶點(diǎn),01,與持留態(tài)有關(guān)的新靶點(diǎn),02,與結(jié)核桿菌毒性相關(guān)的靶點(diǎn),04,05,06,與核酸相關(guān)的靶點(diǎn),03,與胞壁合成相關(guān)的新靶點(diǎn)- 肌醇-1-磷酸合成酶,肌醇存在于分枝桿菌中,與其生長(zhǎng)繁殖密切相關(guān)。 肌醇是合成細(xì)胞壁的必須前體 結(jié)核桿菌利用肌醇合成其體內(nèi)主要的硫醇分枝硫醇。分枝硫醇在維持分枝桿菌的氧化還原平衡、保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的傷害和半胱氨酸的保存方面起著重要的作用, 對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和毒力具有重要意義。 肌醇在細(xì)菌體內(nèi)合成的第一步是葡萄糖-6-磷酸在肌醇-1-磷酸合成酶(ino1 , 酶編號(hào)5. 5. 1. 4)的催化下形成肌醇-1-磷酸。肌醇-1-磷酸合成酶基因突變的結(jié)核桿菌，在正常的培養(yǎng)基上無法生長(zhǎng)。,肌醇-1-磷酸合成酶,故肌醇-1-磷酸合成酶可以作為抗結(jié)核藥物的靶位，而由此產(chǎn)生的藥物可能對(duì)結(jié)核桿菌具有較強(qiáng)的特異性。 肌醇-1-磷酸合成酶也是真核生物中非常重要的多元醇。在設(shè)計(jì)和篩選結(jié)核桿菌肌醇-1-磷酸合成酶抑制劑的時(shí)候，應(yīng)盡量避免抑制劑對(duì)真核生物的肌醇-1-磷酸合成酶產(chǎn)生抑制作用，影響人體的正常生理功能，從而產(chǎn)生藥物副作用。,磷酸肌醇合成酶抑制劑 在37攝氏度下，0.5 mM 2-3H肌醇(12,000 cpm/nmol) (用3H標(biāo)記) 用CHCl3作溶劑，同時(shí)加入Tris-HC1 (pH 8.3) 48mM MgCl2, 0.5 mM Ptd-CMP, 0.25%聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100), 5 mM 類似物, 和 0.05 mg 的微粒體蛋白，配置成0.1mL的溶液。反應(yīng)20分鐘后加入0.5 mL 的 0.1 N HCl （含有MeOH)和0.5mL of CHCl3。用0.5mL的水分離。 有機(jī)質(zhì)層的放射性用閃爍探測(cè)器來測(cè)定。,肌醇抑制劑放入F111細(xì)胞 將F111細(xì)胞放入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一晚上，培養(yǎng)皿中加入10%經(jīng)透析的胎牛血清和10微克的肌醇。附著在玻蓋上的細(xì)胞用Krebs-Ringer 緩沖液(135 mM NaC1, 4.6 mM KC1,1.2 mM CaCl2,l mM 磷酸鈉, 1.3 mM MgSO4, 5 mM HEPES pH 7.41）沖洗兩次，然后浸在含有10 pM 3H】肌醇 (l000 cpm/pmol) 和5 mM 類似物中，放入含有5%CO2的恒溫箱恒溫在37攝氏度。 120分鐘后將細(xì)胞用140mM NaCl沖洗六次，一份溶解在1%SDS中，另一份溶解在10%三氯乙酸中，然后離心分離。 最后細(xì)胞溶解液在閃爍探測(cè)器中測(cè)定放射性，用蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)。,與毒性有關(guān)的靶點(diǎn)-泛酸合成酶,泛酸是一種B族維生素(Vit&)，它是輔酶A(CoA)和?；d體蛋白(ACP)的生物合成的關(guān)鍵前體，CoA和ACP分子結(jié)構(gòu)中的磷酸泛酰巰基乙胺來源于泛酸；CoA和ACP參與生物體內(nèi)碳水化合物、脂肪酸、蛋白質(zhì)和能量代謝，是細(xì)胞生長(zhǎng)過程中重要的輔因子；阻斷泛酸的合成將抑制結(jié)核桿菌的生長(zhǎng)。此外，泛酸的生物合成對(duì)于結(jié)核桿菌的毒性也是至關(guān)重要的，敲除泛酸合成酶基因panC和panD所得的泛酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株毒性比卡介苗還低。并且，微生物和植物都必須通過自身生物途徑合成泛酸，而哺乳動(dòng)物自身不能合成泛酸，必須從食物中獲得。因此，泛酸合成途徑是一個(gè)理想的抗結(jié)核藥物作用靶點(diǎn)。,結(jié)核桿菌泛酸合成途徑中，主要有4個(gè)酶參與反應(yīng)，酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(PanB),泛酸合成酶(PanC) L-天冬氨酸-脫羧酶(PanD)和酮泛解酸還原酶(PanE),四種酶協(xié)同催化下完成的。它們分別由panB、panC、panD和panE編碼。 這其中泛酸合成酶(pantothenatesynthetase，IX3)是關(guān)鍵的限速酶，催化泛酸合成的最后一步反應(yīng)，因此，泛酸合成酶成為抗結(jié)核藥物合適靶位。,篩選方法,建立泛酸合成酶活力的測(cè)定方法：原理是泛酸合成酶催化反應(yīng)得到的產(chǎn)物之一為AMP,AMP可反應(yīng)得到ADP,ADP和磷酸烯醇式丙酮酸鉀作用生成丙酮酸，丙酮酸生成乳酸消耗NADH,還原態(tài)的NADH在340nm有吸光，而氧化態(tài)的沒有。由分光光度計(jì)測(cè)吸光度的變化，從而測(cè)定泛酸合成酶活性。,與核酸相關(guān)的靶點(diǎn)DNA回旋酶,DNA回旋酶，又稱促旋酶，旋轉(zhuǎn)酶。屬拓?fù)洚悩?gòu)酶II(type II ），它的作用是在水解ATP的同時(shí)能使松弛態(tài)環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋DNA,與細(xì)菌體內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄復(fù)制重組和修復(fù)等生理過程密切相關(guān)。 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 （DNA topoisomerase ）為催化DNA拓?fù)鋵W(xué)異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)變的酶之總稱。催化DNA鏈斷開和結(jié)合的偶聯(lián)反應(yīng)，為了分析體外反應(yīng)機(jī)制，用環(huán)狀DNA為底物。在閉環(huán)狀雙鏈DNA的拓?fù)鋵W(xué)轉(zhuǎn)變中，要暫時(shí)的將DNA的一個(gè)鏈或兩個(gè)鏈切斷，根據(jù)異構(gòu)體化的方式而分為二個(gè)型。切斷一個(gè)鏈而改變拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的稱為型拓?fù)洚悩?gòu)酶（top- oisomerase），通過切斷二個(gè)鏈來進(jìn)行的稱為型拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）。,超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu) DNA在二級(jí)結(jié)構(gòu)雙螺旋的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步扭曲、折疊，螺旋形成超螺旋的三級(jí)結(jié)構(gòu)。螺旋變緊的稱為正超螺旋，變松的稱為負(fù)超螺旋。這是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的一種常見形式。,酶活性測(cè)定 在緩沖液中，加入超螺旋PcDNA質(zhì)粒及回旋酶酶提液和不同濃度的藥物(設(shè)空白對(duì)照組及加酶不加藥對(duì)照組)，混勻后，37溫孵30 min。加入及蛋白酶K。中止反應(yīng)；繼續(xù)于37溫孵30min后，加入溴酚藍(lán)；點(diǎn)樣于08瓊脂糖凝膠板，在70 V電壓下電泳1 h，以溴化乙啶(EB)溶液染色至少30 min，置凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并照像記錄。,以異檸檬酸裂解酶（ICL）為靶點(diǎn),異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）是乙醛酸循環(huán)途徑中的關(guān)鍵限速酶之一，研究表明異檸檬酸裂解酶對(duì)于持留結(jié)合桿菌的存活起關(guān)鍵作用，決定了結(jié)核桿菌的持留性，最終導(dǎo)致結(jié)核病療程過長(zhǎng)。敲除了ICL基因的結(jié)核分支桿菌不再具有持留性。而人等高等動(dòng)物中不存在乙醛酸代謝途徑。,篩選模型的建立 以D（s）型異檸檬酸作為底物，利用ICL參與的酶促反應(yīng)產(chǎn)物（乙醛酸和苯腙反應(yīng)后的復(fù)合物）在324nm處有吸收的特性，測(cè)定25酶促反應(yīng)體系在324nm處吸光度的變化，即可測(cè)得異檸檬酸裂解酶的活力。 異檸檬酸裂解酶可催化底物異檸檬酸產(chǎn)生琥珀酸和乙醛酸，產(chǎn)物乙醛酸可與苯肼反應(yīng)生成苯腙，苯腙在324nm波長(zhǎng)下產(chǎn)生光吸收峰，因此測(cè)定酶促反應(yīng)體系在324nm波長(zhǎng)下光吸收的變化即可測(cè)定異檸檬酸裂解酶的酶活力。,以蛋白激酶G為靶點(diǎn)的篩選,研究表明，結(jié)核分枝桿菌（MTB）自身基因組內(nèi)的pknG基因所編碼的蛋白激酶G（PknG）對(duì)持留狀態(tài)的形成起著關(guān)鍵性的作用。當(dāng)MTB被巨噬細(xì)胞吞噬，形成吞噬體厚，PknG可以阻止吞噬體與細(xì)胞內(nèi)溶酶體的融合，從而使MTB在細(xì)胞內(nèi)免于被溶酶體的水解酶類降解。,-糖尿病治療的作用靶點(diǎn),1.定義：糖尿病是一組由于胰島素分泌缺陷及（或）其生物學(xué)作用障礙引起的高血糖為特征的某些疾病。慢性高血糖常導(dǎo)致各種臟器，尤其是眼、腎、神經(jīng)及心血管的長(zhǎng)期損害、功能不全和衰竭 2.分類： 1型（B細(xì)胞被破壞，常導(dǎo)致胰島素絕對(duì)缺乏） 2型（胰島素抵抗或分泌缺陷） 特異型 妊娠,胰島素受體 廣泛分布于全身各組織細(xì)胞膜。約有l(wèi)，000300，000個(gè)受體，大多數(shù)含有1萬個(gè)受體。 胰島素受體是糖蛋白，由2個(gè)a和2個(gè)B亞基即a2b2構(gòu)成。 胰島素受體是由位于第19號(hào)染色體短臂上的IR基因，a和B亞單位是由單個(gè)基因所編碼的，seino等發(fā)現(xiàn)IR基因是120kb，22外顯子。11個(gè)外顯子編碼a亞單位，共90多個(gè)kb，11外顯子編碼B亞單位，共30多個(gè)kb。三個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)定位于翻譯起始點(diǎn)的上游276bp，282bp和283bp。 不同組織胰島素受體存在著異質(zhì)性。,蛋白質(zhì)激酶在與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和增值有關(guān)鍵作用的信號(hào)級(jí)聯(lián)中擔(dān)當(dāng)著管理者的角色。這些酶在底物特定的蛋白位點(diǎn)將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)變成ATP。PI3K家族被認(rèn)為是控制細(xì)胞這些進(jìn)程的長(zhǎng)官。一些外部的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，比如表皮生長(zhǎng)因子受體，胰島素受體和G蛋白偶聯(lián)受體，信號(hào)的傳遞直接通過PI3K。族PI3K根據(jù)其活性機(jī)制被分成兩種亞基，A和B。 PIP3連接著許多有用的分子，比如絲氨酸-蘇氨酸激酶、酪氨酸激酶和G蛋白管理者。這些