證明膜蛋白流動(dòng)性的經(jīng)典實(shí)驗(yàn).doc

證明膜蛋白流動(dòng)性的經(jīng)典實(shí)驗(yàn) 免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。熒光是指一個(gè)分子或原子吸收了給予的能量后，即刻引起發(fā)光；停止能量供給，發(fā)光亦瞬即停止。熒光素是一種可吸收激發(fā)光的光便能產(chǎn)生熒光，并能作為染料使用的有機(jī)化合物，亦稱熒光色素。發(fā)生原理-基態(tài)激發(fā)態(tài)產(chǎn)生特點(diǎn)：激發(fā)-即刻產(chǎn)生 停止激發(fā)-瞬間消失種類-光致熒光，化學(xué)熒光，X線熒光，陰極射線熒光該技術(shù)的主要優(yōu)缺點(diǎn) 主要優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。 主要缺點(diǎn)：非特異性染色問題尚未完全解 決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜免疫熒光技術(shù)- 基本原理 免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。 直接法將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。 間接法如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原抗體抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。 標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于雞任何抗原的診斷。技術(shù)分類1 熒光抗體技術(shù)(熒光顯微鏡技術(shù))抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。 2 免疫熒光測定技術(shù)抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法 熒光物質(zhì) 1、熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。 常用的熒光色素有： （1）異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490-495nm，最大發(fā)射光波長520-530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：人眼對(duì)黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。 (2)四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。結(jié)構(gòu)式：最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595600nm，呈橘紅色熒光。 (3)四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式：最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。 2、其他熒光物質(zhì) 1）酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-D半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對(duì)羥基苯乙酸等。 2）鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3 ）、鋱（Tb3 ）、鈰（Ce3 ）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應(yīng)用最廣。Eu3 螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時(shí)間長，最適合用于分辨熒光免疫測定。免疫熒光技術(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟1. 直接免疫熒光法測抗原（1）基本原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。 （2）試劑與儀器：磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4、熒光標(biāo)記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋、緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制、搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）、有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|）、熒光顯微鏡、玻片架、濾紙、37溫箱等。 （3）實(shí)驗(yàn)步驟 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。 滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其完全覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一定時(shí)間（參考：30min）。 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時(shí)振蕩。 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，一般可用“+”表示：（-）無熒光；（）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（+）熒光明亮；（+ -+）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“+”以上，而各種對(duì)照顯示為（）或（-），即可判定為陽性。 （4） 注意事項(xiàng) ：1對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20，抗體濃度過低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。2染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時(shí)間可以從10 min到數(shù)小時(shí)，一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25左右），高于37可加強(qiáng)染色效果，但對(duì)不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2的低溫，延長染色時(shí)間。低溫染色過夜較3730 min效果好的多。3為了保證熒光染色的正確性，首次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。 標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。 特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。 陽性對(duì)照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。 如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無熒光或弱熒光，陽性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽性染色。 4一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。 2.間接免疫熒光法測抗體（1）基本原理：染色程序分為兩步，第一步，用未知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原標(biāo)本上，在濕盒中37保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。第二步，加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第一步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會(huì)和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體。 （2）試劑與儀器：磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4、緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋 。搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml） 有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|）、熒光顯微鏡、玻片架、濾紙 、37溫箱等。 （3）實(shí)驗(yàn)步驟 11 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去，使標(biāo)本片保持一定濕度。 2 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本，覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37保溫30min。 3 取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時(shí)振蕩 。 4 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。 5 將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37保溫30min。 6 重復(fù)操作3。 7 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。 8 熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法。 （4） 注意事項(xiàng) 1. 熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4保存4h，時(shí)間過長 ，會(huì)使熒光減弱2. 每次試驗(yàn)時(shí) ，需設(shè)置以下三種對(duì)照： 陽性對(duì)照：陽性血清+熒光標(biāo)記物 陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物 熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物 3. 已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。 4. 所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。淋巴細(xì)胞的成斑和成帽現(xiàn)象 當(dāng)熒光抗體標(biāo)記時(shí)間繼續(xù)延長，已均勻分布在細(xì)胞表面的標(biāo)記熒光會(huì)重新排列，聚集在細(xì)胞表面的某些部位，即所謂成斑現(xiàn)象。繼而聚集在細(xì)胞的一端，即成帽現(xiàn)象。 淋巴細(xì)胞通過產(chǎn)生抗體對(duì)外源蛋白進(jìn)行應(yīng)答,抗體分子位于細(xì)胞質(zhì)膜上。蛋白質(zhì)能夠在不同的動(dòng)物中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，如果將小鼠的抗體注入兔子中,兔子將會(huì)產(chǎn)生抗小鼠抗體的抗體?？梢詮耐米拥难褐蟹蛛x這種抗體,并將這種抗體共價(jià)連接到熒光染料上,就可以通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。當(dāng)兔子的抗小鼠的抗體與小鼠的淋巴細(xì)胞混合時(shí),帶有標(biāo)記的抗體就會(huì)同小鼠淋巴細(xì)胞質(zhì)膜上的抗體結(jié)合,并分布在整個(gè)淋巴細(xì)胞的表面,但很快就會(huì)成塊或成斑。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因是抗體是多價(jià)的,每一個(gè)兔子的抗體能夠同小鼠細(xì)胞質(zhì)膜表面的多個(gè)抗體分子反應(yīng),也就是說小鼠的每一個(gè)膜抗體將同多個(gè)兔子的抗體反應(yīng)。這樣, 在小鼠淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜表面形成“兔抗小鼠抗體分子-小鼠膜結(jié)合抗體”的斑。斑逐漸聚集擴(kuò)大,當(dāng)小鼠淋巴細(xì)胞質(zhì)膜表面抗體全部同兔子的抗小鼠抗體結(jié)合后,將會(huì)在細(xì)胞表面的一側(cè)形成“帽子”結(jié)構(gòu),最后通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。很顯然,如果小鼠細(xì)胞質(zhì)膜中的抗體蛋白不能自由的進(jìn)行側(cè)向擴(kuò)散的話,斑和帽都是不能形成的。光脫色熒光恢復(fù)技術(shù)(fluorescence recovery after photobleaching FRAP) 這種方法不僅能夠證明膜的流動(dòng)性，同時(shí)也能測量膜蛋白擴(kuò)散的速率。 這一技術(shù)是研究膜流動(dòng)性的一種方法。首先用熒光物質(zhì)標(biāo)記膜蛋白或膜脂, 然后用激光束照射細(xì)胞表面某一區(qū)域, 使被照射區(qū)域的熒光淬滅變暗形成一個(gè)漂白斑。由于膜的流動(dòng)性,漂白斑周圍的熒光物質(zhì)隨著膜蛋白或膜脂的流動(dòng)逐漸將漂白斑覆蓋，使淬滅區(qū)域的亮度逐漸增加, 最后恢復(fù)到與周圍的熒光光強(qiáng)度相等。細(xì)胞膜蛋白的標(biāo)記方法有很多種?？梢杂梅翘禺愋缘娜玖?如異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)將細(xì)胞膜蛋白全部進(jìn)行標(biāo)記。也可用特異性的探針,如熒光抗體,標(biāo)記特 異的膜蛋白。膜蛋白一旦被標(biāo)記就可用激光束進(jìn)行局部照