編制說明-糧油檢驗(yàn) 大豆水溶性蛋白含量的測定-征求意見稿

糧油檢驗(yàn) 大豆水溶性蛋白含量的測定國家編制說明（一）工作簡況1 任務(wù)來源 根據(jù)國家糧食局2015年糧油標(biāo)準(zhǔn)制修訂計劃的要求，由南京財經(jīng)大學(xué)等單位負(fù)責(zé)糧油檢驗(yàn) 大豆水溶性蛋白質(zhì)含量的測定（計劃號:20140342）制定工作。起草單位成立的標(biāo)準(zhǔn)起草組負(fù)責(zé)進(jìn)行本標(biāo)準(zhǔn)的各項(xiàng)工作。2制定本標(biāo)準(zhǔn)的意義大豆富含脂肪和蛋白質(zhì)，是重要的油料作物，因其含有3050%的蛋白質(zhì)，也是重要的植物蛋白資源，含有所有必需氨基酸，其加工功能，營養(yǎng)和風(fēng)味特性在食品工業(yè)中發(fā)揮著重要作用，常用作來制作各種豆制品、釀造醬油、提取蛋白質(zhì)及加工飼料。新收獲大豆中所含蛋白質(zhì)通常90%以上可溶于水，這部分蛋白稱之為水溶性蛋白。只有能溶解的蛋白才能更好的被加工利用，所以大豆蛋白質(zhì)的溶解性是豆制品加工和大豆蛋白生產(chǎn)最重要的特性。大豆水溶性蛋白主要由大豆球蛋白和大豆清蛋白組成，隨著儲存時間延長，大豆蛋白的水溶性降低，因此，我國將大豆水溶性蛋白含量作為是否適宜儲存的重要判定指標(biāo)。另外，GB/T19541-2017 飼料原料 豆粕標(biāo)準(zhǔn)中也將氫氧化鉀蛋白質(zhì)溶解度作為豆粕質(zhì)量的一項(xiàng)主要質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行了規(guī)定。為規(guī)范統(tǒng)一、提高分析檢測效率，有必要制定大豆水溶性蛋白質(zhì)含標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。3標(biāo)準(zhǔn)主要工作過程為了更好的完成標(biāo)準(zhǔn)任務(wù)，查閱了國內(nèi)外相關(guān)資料。目前，蛋白質(zhì)含量測定的主要方法有凱氏定氮法、光譜法、比色法和近紅外等。而大豆水溶性蛋白質(zhì)含量測定主要采用凱氏定氮法，涉及到的標(biāo)準(zhǔn)有GB/T 5511-1985附錄、NY/T 1205-2006、GB/T 31785-2015附錄和AOCS Officoal Method Ba 11-65，其中GB/T 31785-2015大豆儲存品質(zhì)判定規(guī)則中附錄給出的水溶性蛋白質(zhì)測定方法完全等同于GB/T 5511-1985附錄。研究表明，水溶性蛋白的提取是大豆水溶性蛋白含量測定的關(guān)鍵，振蕩方式、振蕩頻率、提取溫度、樣品細(xì)度等因素均能影響水溶性蛋白的提取。在比較現(xiàn)行的研究文獻(xiàn)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，確定了本方法標(biāo)準(zhǔn)制定方案和工作計劃。（二）標(biāo)準(zhǔn)的編制原則和標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容1標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)GB/T1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)與編寫規(guī)則、GB/T20001.4-2009標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：化學(xué)分析方法的規(guī)定進(jìn)行編制的。2確定國家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)內(nèi)容包括范圍、規(guī)范性引用文件、原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、試樣制備、分析步驟、結(jié)果計算及精密度等。3主要研究內(nèi)容及試驗(yàn)結(jié)果3.1標(biāo)準(zhǔn)研究的內(nèi)容及原理本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大豆中水溶性蛋白質(zhì)含量測定的原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、試樣制備、分析步驟、結(jié)果計算和精密度。測定原理：用水提取大豆中的水溶性蛋白，含氮化合物在催化加熱條件下被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，加堿蒸餾使氨逸出，用硼酸吸收后用硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量計算含氮量，再乘以換算系數(shù)，計算出大豆中水溶性蛋白的含量。3.2 試驗(yàn)結(jié)果以國產(chǎn)東北大豆為原料，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)合參加起草單位驗(yàn)證數(shù)據(jù)，并綜合考慮各因素在實(shí)際中的簡便、可行性，確定了大豆水溶性蛋白提取的最佳提取條件：料液比 140、提取時間 2 h、提取溫度 30 、離心轉(zhuǎn)速 3000 r/min。3.2.1 水溶性蛋白提取取混合均勻的樣品80g100g，粉碎（一次通過CQ24篩的90%），稱取粉碎試樣1g（精確到0.001g）于50 mL離心管中，吸取40 mL蒸餾水于離心管中，搖混使樣品均勻分散。在可控溫往復(fù)式搖床上， 35 2溫度下振蕩2 h。取下離心管，以3000 r/min的速度離心10 min。3.2.2 凱氏定氮法消化：準(zhǔn)確吸取離心管中的上清液10mL于250mL凱氏定氮瓶中，加入0.4g硫酸銅、6g硫酸鉀及12mL硫酸，充分混合。先水炎加熱，后大火加熱至消化完全，放冷后定容至100mL。蒸餾吸收：連接好定氮蒸餾裝置。取10.00mL試樣處理液蒸餾吸收。滴定 ：以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至淺灰紅色。3.2.3自動凱氏定氮儀法準(zhǔn)確吸取上清液10mL于消化管中，于消化爐進(jìn)行消化，消化完成后加入50mL水，再在自動凱氏定氮儀上進(jìn)行蒸餾、滴定等。根據(jù)滴定時，耗的硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積、稀釋位數(shù)、蛋白質(zhì)換算系數(shù)等計算試樣中水溶性蛋白質(zhì)含量。（三）本標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的論據(jù)定氮法測定蛋白質(zhì)含量方法業(yè)已成熟，并已列為ISO標(biāo)準(zhǔn)方法和世界各國的國家標(biāo)準(zhǔn)方法。在大豆水溶性蛋白質(zhì)含量測定過程中，主要的影響是水溶性蛋白質(zhì)的提取分離。本標(biāo)準(zhǔn)起草過程中主要對提取條件進(jìn)行方法學(xué)研究和驗(yàn)證。1 測定方法研究1.1 振蕩提取時間對大豆水溶性蛋白質(zhì)含量的影響取5.000 g(精確到0.001 g)樣品于50 ml離心管中，取50 ml蒸餾水加入至離心管中。將離心管固定至恒溫（35 ）水浴鍋振蕩（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min）。以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液倒入250 ml容量瓶中定容。從圖1中可以看出，恒溫振蕩提取大豆水溶蛋白質(zhì)，隨著提取時間的延長大豆水溶性蛋白溶解的比率在3090 min內(nèi)顯著增加，在90 min以后大豆水溶性蛋白的提取量變化不大，幾乎處于平穩(wěn)。大豆水溶性蛋白與蒸餾水之間的溶質(zhì)濃度的平衡關(guān)系最終決定大豆水溶蛋白的提取時間，為了保證大豆水溶蛋白提取的比率和穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)選用120 min為最佳提取時間。圖1提取時間對大豆水溶性蛋白提取率的影響1.2加水提取量(料液比)對大豆水溶性蛋白提取率的影響取1.000 g(精確到0.001 g)磨碎的大豆樣品于50 ml離心管中，分別加入體積10、15、20、25、30、35、40、45、50ml的蒸餾水，搖勻。水浴鍋震蕩60 min（35 ），以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。圖2 料液比對大豆水溶性蛋白提取率的影響從圖2中可以看出，加水量對大豆水溶性蛋白的提取有著顯著的影響。當(dāng)加水量較低時，大豆水溶性蛋白不能完全從打大豆中析出，有一小部分殘留在殘渣中，使得測定的水溶性蛋白質(zhì)含量偏低，所以隨著加量逐漸增加，大豆水溶性蛋白質(zhì)含量整體趨勢先傾斜上升，直到料液比達(dá)到1:35時，大豆水溶性蛋白質(zhì)含量才趨于穩(wěn)定。為了確保穩(wěn)定并較為準(zhǔn)確的提取大豆水溶性蛋白，本實(shí)驗(yàn)采用料液比為1:40為最佳條件。1.3提取溫度對大豆水溶性蛋白提取率的影響取5.000 g(精確到0.001g)樣品于50 ml離心管中，加入30 ml蒸餾水，搖勻。水浴鍋震蕩60 min（25 、30 、35 、40 ），3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。圖3提取溫度對大豆水溶性蛋白提取率的影響從圖3中可以看出溫度對大豆水溶性蛋白質(zhì)的提取也具有重要的影響，當(dāng)溫度在低于25時，隨著溫度的升高，水溶性蛋白質(zhì)的提取率明顯上升，當(dāng)溫度在2530時，溫度升高，水溶性蛋白質(zhì)的提取率都有小幅度的提高。隨著溫度的升高，一些難溶于水的蛋白質(zhì)（如球蛋白）溶解于水，造成實(shí)驗(yàn)測定的水溶性蛋白質(zhì)含量增多。當(dāng)溫度在3040時，大豆水溶性蛋白質(zhì)的提取穩(wěn)定，此時溫度對大豆水溶性蛋白質(zhì)含量的測定，影響可以忽略不計。為了提高實(shí)驗(yàn)效率并較為并準(zhǔn)確地測定大豆中水溶性蛋白質(zhì)的含量，本實(shí)驗(yàn)選擇35為試驗(yàn)條件。1.4正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取溫度、提取時間、料液比進(jìn)行三因素三水平L9(34 )正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。表 1 正交試驗(yàn)因素水平表因素水平A-提取溫度B-提取時間/minC-料液比130901:352351201:403401501:45表 2 正交試驗(yàn)設(shè)計實(shí)驗(yàn)號因素提取率（%）ABC111133.20212233.06313329.96421233.29522331.32623129.86731233.36832331.92933131.71K132.07331.6632.077K231.4932.132.687K332.3331.54731.723極差R0.842.7731.14從表2可以看出，在3個因素中影響大豆水溶性蛋白質(zhì)提取率的最主要因素是時間，其次是料液比，最后為提取溫度。綜合各因素作用，得到提取大豆水溶性蛋白最佳工藝條件為：提取溫度30 ，提取時間120 min,料液比1:40。 在此條件下，進(jìn)行3次重復(fù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得蛋白質(zhì)提取率為34.63%。表3 正交試驗(yàn)的方差分析因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性溫度1.11224.24419時間11.62244.35119*料液比2.36629.03119*誤差0.262由于時間和料液比的F值均大于F0.01=8.650或F0.05=4.460，所以均為顯著因素。而溫度的F值小于F0.05=4.460，所以提取溫度為不顯著因素。表2表明，在大豆水溶性蛋白的提取過程中，提取溫度為不顯著因素，提取時間和料液比為顯著因素。2方法精密度實(shí)驗(yàn)按照前述的最佳提取條件，選取2份大豆樣品在同一實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，測定結(jié)果見表4。表4 大豆水溶性蛋白質(zhì)含量測定方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品123456均值極差標(biāo)準(zhǔn)偏差臨界極差樣品130.8231.0631.2630.9530.6631.2531.00 0.60 0.24 0.95 樣品235.6435.8736.0535.8636.3335.7735.92 0.69 0.24 0.97 由表4可見，兩份樣品的極差值均小于試驗(yàn)樣品的平均值的2%，重復(fù)性臨界極差CrR95(6)分別為0.95和0.97，重復(fù)性限（r）為0.67和0.68。按照前述的最佳提取條件，選取2份大豆樣品在四個標(biāo)準(zhǔn)參加單位進(jìn)行再現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，測定結(jié)果見表5。表5 大豆水溶性蛋白質(zhì)含量測定方法再現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品實(shí)驗(yàn)室1實(shí)驗(yàn)室2實(shí)驗(yàn)室3實(shí)驗(yàn)室4均值極差標(biāo)準(zhǔn)偏差臨界極差樣品131.00 31.43 30.75 31.50 31.17 0.75 0.36 1.28 樣品235.92 35.76 36.18 36.75 36.15 0.99 0.43 1.56 由表5可見，兩份樣品的極差值均小于試驗(yàn)樣品的平均值的3%，再現(xiàn)性臨界極差CrR95(6)分別為1.28和1.56，再現(xiàn)性限（R）為1.00和1.21。（四）采用國際標(biāo)準(zhǔn)和國外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的情況，以及與國際、國內(nèi)同類標(biāo)準(zhǔn)水平的對比，或者與測試的國外樣品、樣機(jī)的有關(guān)數(shù)據(jù)對比情況目前，大豆水溶性蛋白質(zhì)含量測定主要采用凱氏定氮法，涉及到的標(biāo)準(zhǔn)有GB/T 5511-1985附錄、NY/T 1205-2006、GB/T 31785-2015附錄和AOCS Official Method Ba 11-65，其中GB/T 31785-2015大豆儲存品質(zhì)判定規(guī)則中附錄給出的水溶性蛋白質(zhì)測定方法，完全等同于GB/T 5511-1985附錄。AOCS Official Method Ba 11-65方法與GB/T 31785-2015之間的差異主要是AOCS Official Method Ba 11-65規(guī)定了提取溫度為30，而GB/T 31785-2015為2530。本標(biāo)準(zhǔn)起草過程中進(jìn)行了不同標(biāo)準(zhǔn)間的比較試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖4。農(nóng)業(yè)部頒布的NY/T1205-2005需要對大豆水溶性蛋白多次提取，步驟較為繁瑣。國標(biāo)GB/T19514-2017附錄A，用氫氧化鉀提取大豆水溶蛋白的方法雖然過程簡單，用時較短，但穩(wěn)定性較差。國標(biāo)GB/T31785-2015中所采用的提取大豆水溶性蛋白的方法，提取率較低，僅為30.69 %。對比三種現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)，本研究的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)操作更加簡便。從圖4可以看出，優(yōu)化的方法大豆水溶性蛋白的提取率更高，說明大豆水溶性蛋白在此方法下溶解的更加充分。而且從平行實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)上看，實(shí)驗(yàn)誤差更小，水溶性蛋白質(zhì)的提取更加穩(wěn)定。（五）與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系大豆是我國的主要糧食品種之一，也是油脂加工業(yè)、豆制品加工業(yè)、飼料工業(yè)的主要原料，目前，我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中NY/T1205-2005需要對大豆水溶性蛋白多次提取，步驟較為繁瑣。國標(biāo)GB/T19514-2017附錄A，用氫氧化鉀提取大豆水溶蛋白的方法雖然過程簡單，用時較短，但穩(wěn)定性較差。國標(biāo)GB/T31785-2015中所采用的提取大豆水溶性蛋白的方法，提取率相對較低。對比三種現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)，本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的實(shí)驗(yàn)操作更加簡便、檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，頒布實(shí)施后，將更有利于行業(yè)應(yīng)用，與現(xiàn)行的法律、法規(guī)及其他國家標(biāo)準(zhǔn)沒有矛盾。（六）重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)無。（七）按照標(biāo)準(zhǔn)化法的有關(guān)規(guī)定，提出強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)或推薦性標(biāo)準(zhǔn)的建議建議將本