課件：人類疾病動物模型(2).ppt

,1,第九章 人類疾病動物模型,第一節(jié) 概述 第二節(jié) 誘發(fā)性疾病動物模型 第三節(jié) 自發(fā)性疾病動物模型 第四節(jié) 免疫缺陷動物模型 第五節(jié) 中醫(yī)證候動物模型與辨證論治,2,第一節(jié) 概 述,一、定義 模型（Model） 動物模型（Animal models） 人類疾病動物模型(Animal models of human diseases） 是指為生物醫(yī)學研究和闡明人類疾病的病因、發(fā)病機理，建立預防、診斷和治療方法而制作的具有人類疾病模擬表現(xiàn)的實驗動物。,3,為什么要在動物身上進行試驗？ 在人身上進行試驗存在的問題 受倫理學的制約，許多實驗不能直接在人體上進行試驗 以人本身作為實驗對象來推動醫(yī)學發(fā)展是緩慢的 臨床所積累的經(jīng)驗在時間和空間上都存在著局限性,4,二、疾病動物模型的發(fā)展史 人類用動物進行試驗，最初主要是通過觀察、比較動物與動物之間以及動物與人之間在解剖結構和功能上的共同點和差異點來認識人類自身。“健康”的動物實際上充當了“健康”的人類模型。 疾病動物模型的發(fā)展可追溯到： 18世紀，英國醫(yī)生詹納（Edward Jenner）通過實驗發(fā)現(xiàn)并證實了給人接種牛痘可使之獲得天花免疫。 1876年，德國醫(yī)生郭霍（Robert Koch）從病牛的脾臟中得到了致炭疽病的細菌，并且移種到老鼠身上，使老鼠相互感染，最后又重新分離獲得相同的桿菌。 1884年，法國化學家和生物學家巴斯德（Louis Pasteur）研制出狂犬病病毒疫苗后成功地在狗身上進行了試驗。,5,1911年，美國病理學家勞斯 (F. P. Rous)用雞肉瘤的無細胞濾液注射到健康雞皮下，結果在接種部位出現(xiàn)新生腫瘤，從而發(fā)現(xiàn)這種腫瘤具有“傳染性”。隨后的研究發(fā)現(xiàn)這種腫瘤是由病毒引起的，這是病毒引起腫瘤理論的最早研究。-1966年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎 1914年，日本科學家山極和市川用瀝青長期涂抹家兔耳朵成功誘發(fā)皮膚癌，進一步研究發(fā)現(xiàn)瀝青中的3,4-苯并芘為化學致癌物，從而證實了化學物質可以致癌的理論。 20世紀50年代中期，美國科學家加德賽克(Daniel Carleton Gajdusek)對發(fā)生在巴布亞新幾內(nèi)亞土著部落的庫魯（Kuru）病進行研究，發(fā)現(xiàn)庫魯病是一種類似于人類克雅氏病的傳染病。美國科學家普魯西納(StanleyB.Prusiner)對庫魯病的病原體作了進一步的研究，發(fā)現(xiàn)變異的普里昂蛋白(prion protein)才是庫魯病的病原體，從而揭示了本病由朊蛋白（prion）感染因子所引起的本質，這一發(fā)現(xiàn)對其他神經(jīng)系統(tǒng)疑難雜癥的解決提供了新的途徑。-1976年和1997年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎,6,20世紀60年代，動物模型開始作為專題進行開發(fā)研究。 目前，疾病動物模型已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學特別是藥效學、腫瘤學、免疫學以及臨床實驗醫(yī)學深入發(fā)展不可缺少的工具，且有良好的發(fā)展前景和很高的實用價值。 可以說，一個好的疾病動物模型的建立可極大地促進該疾病發(fā)病機理、診斷、預防及治療研究的進展以及相關新藥開發(fā)的進程；而一種疑難病、烈性傳染病如無相應的動物模型，則是限制該病深入研究的瓶頸。,7,三、應用疾病動物模型的意義 減少了在人身上進行實驗所帶來的風險； 縮短實驗研究周期； 便于實驗樣品的收集； 便于研究結果分析； 可提供稀缺疾病的材料； 全面認識疾病的本質,8,四、疾病動物模型的制作原則 制作一個好的動物模型除了模擬人的相應疾病表現(xiàn)外，還應掌握以下原則： （1）確定性：能通過各種觀察指標得到明確診斷； （2）完整性：能顯示某種疾病從發(fā)病到轉歸的整個變化過程； （3）可重復性：相近條件下，能夠復制和再現(xiàn)；最好能在兩種以上不同種屬動物上得到證實。 （4）規(guī)范性：在研制與復制過程中有基本同一的操作規(guī)程、技術參數(shù)與觀察指標等； （5）實用性：可應用于藥物藥效學和毒理學檢測，對藥物療效和安全性評價有實用價值；或可應用于醫(yī)學實驗研究，對臨床診治工作有理論指導意義等； （6）易行性：能充分保障所需動物和試劑的來源，并做到制作方法簡便，儀器設備普及，造模價格適中。在同等條件下優(yōu)先使用標準化實驗動物。,9,動物模型評價的注意點 動物體畢竟不是人體的真實摹本，沒有一種動物模型能完全復制人類疾病的狀況。模型實驗只是一種間接性研究，只可能在局部或幾個方面與人類疾病相似。 對動物模型實驗結果的評價應是相對的，不可絕對外推的人身上。因此，模型實驗結論的正確性只是相對的，最終必須在人體上得到驗證，即最標準的終極“模型”只能是患者本身。所以復制過程中一旦出現(xiàn)與人類疾病不同的情況，必須分析其差異的性質和程度，找出相平行的共同點，正確評估哪些是有價值的內(nèi)容。,10,五、人類疾病動物模型的分類 （一）按疾病動物模型制作方法的分類 誘發(fā)性疾病動物模型 突變系疾病動物模型 1.自發(fā)性疾病動物模型 2.人工致突變疾病動物模型 轉基因動物疾病模型,11,不同人類疾病動物模型的比較,12,（二）按照各系統(tǒng)疾病動物模型的分類 可分為呼吸系統(tǒng)疾病動物模型、消化系統(tǒng)疾病動物模型等。 （三）按照疾病基本病理過程動物模型的分類 可分為發(fā)熱、炎癥、休克、電解質紊亂、酸堿平衡障礙、嘔吐、腹瀉動物模型等。 （四）按照所用動物進行分類 例如小鼠模型、大鼠模型等。 （五）中醫(yī)證候動物模型的分類 利用中醫(yī)獨特理論體系“辨證論治”，在實驗動物身上復制不同的臨床證候，以不同的證型表現(xiàn)出來，如八綱辨證、臟腑辨證、氣血津液辨證、六經(jīng)辨證、六淫辨證、衛(wèi)氣營血辨證動物模型等。,13,第二節(jié) 誘發(fā)性疾病動物模型,一、定義 誘發(fā)性疾病動物模型（experimental animal model）又稱為實驗性動物模型，指通過運用物理、化學、生物等致病因素人為作用于實驗動物，造成其組織、器官或全身的一定損害，出現(xiàn)某些類似人類疾病的行為活動、體表癥狀、功能指標、形態(tài)結構以及新陳代謝等方面的變化。,14,1.物理因素 機械力所致顱腦損傷、骨折 氣壓變化所致高原病、潛水病 溫度改變所致燒傷、凍傷、中暑 放射線所致免疫功能抑制 手術破壞或切除某些器官臟器 模型應用前必須預先摸索條件，應用時必須統(tǒng)一實驗因素，使模型具有重復性。,15,2.化學因素 強酸強堿、重金屬 有毒藥物：環(huán)磷酰胺、慶大霉素等 化學致癌劑：二乙基亞硝胺（DEN）、二甲基膽蒽、黃曲霉素等 營養(yǎng)素的過量或缺乏： 維生素、甘油三脂、膽固醇等 注意劑量的選擇 3.生物因素 接種細菌、病毒、寄生蟲、腫瘤組織 注意動物的易感性和臨床表現(xiàn)的差異,16,優(yōu)點：制作方法簡便，實驗條件可人工控制，且重復性好，從而可在短期內(nèi)獲得大量疾病模型樣品。 缺點：這類模型與自然發(fā)生的動物疾病以及人類疾病本身仍存在某些差異。另外，尚有不少人類疾病至今未能用人工方法復制，需進一步研究。 應用：誘發(fā)性疾病動物模型在醫(yī)學研究中應用較廣，適用于對各類疾病病因和發(fā)病機制的研究，候選藥物活性的篩選，特別在藥理學、腫瘤學和臨床各學科已廣泛被研究者所接受。,17,誘發(fā)性疾病動物模型介紹 1.大鼠心肌梗死模型制作： 大鼠麻醉后固定，連接人工呼吸機和心電記錄裝置，開胸暴露心臟及大血管根部，切開心包，擠出心臟，在左冠脈前降支起始部縫針，回納心臟入胸廓，收線打結，止血后逐層關胸。分別于開胸后、縫針后、結扎后和關胸后四個點記錄導聯(lián)心電圖變化。術后26周，進行心電圖、心功能以及組織病理學檢查。 模型特征：ST段弓背向上抬高，QRS波群幅度降低；心功能顯著下降；左室前壁形成大量邊界清楚的圓形梗死灶，梗塞區(qū)心肌大量壞死，壞死心肌結構紊亂，部分梗塞區(qū)出現(xiàn)肉芽組織。心梗面積在冠脈結扎后6周時較2周時明顯增加。 模型特點：該模型制作方法簡單，成模動物心電圖變化與臨床相似，可作較長時間觀察。但大鼠冠脈側枝循環(huán)豐富，模型變異性較大，實驗所需標本量較多。,18,2. 四氯化碳（CCl4）致肝纖維化模型 模型制作：成年雄性大鼠，按3ml/kg體重的劑量sc 60%CCl4 溶液，首劑加倍，每周2次，共9周。造模期間，每日觀察動物的一般情況，每周稱重一次。造模過程中，動態(tài)抽取全血制備血清作生化檢測。造模畢，處死動物，摘取肝、脾等臟器稱重，計算臟器系數(shù)，并作組織形態(tài)學檢查。 模型特征：注射CCl4后，模型動物活動逐漸減少，精神萎糜，毛發(fā)蓬亂無光澤，進食量減少，體重增長減慢。在造模1周時，血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）升高；3周時，肝臟開始腫大，肝細胞出現(xiàn)大面積的脂肪變性；5周時，ALT，天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、透明質酸（HA）同時升高，血清總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）下降，球蛋白（GLO）增高，肝臟明顯腫大，質較硬且脆，油膩感較重，肝實質內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，膠原纖維從匯管區(qū)升始向實質延伸；7周時，肝細胞約半數(shù)細胞發(fā)生壞死，小部分視野中出現(xiàn)纖維包裹形成假小葉；9周時，肝臟仍腫大變硬，但增大程度和肝重指數(shù)上升程度稍有下降，肝細胞大部分發(fā)生變性壞死，膠原纖維包裹肝組織形成假小葉。 模型特點：首選雄性大鼠作為受試動物。皮下注射法雖成模率有所提高，且受干擾因素影響相對較少，但成模時間較長。該模型致模機理明確、病變典型、操作簡便，但造模周期過長，動物死亡率較高，且停藥后有一定自然恢復趨勢。,19,型糖尿病模型 制作方法：成年大鼠，用含20%蔗糖和10%豬油的高糖高脂飼料飼養(yǎng)，4周后按30mg/kg體重的劑量一次性ip或iv鏈脲佐菌素（STZ）溶液。 模型特征：注射STZ后7、14、21d時，模型動物體重增長曲線、血清膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、空腹和餐后血糖（Glu）、糖化血紅蛋白（HbAlc）水平均明顯升高，其中空腹血糖均值高于6.78mmol/L。 模型特點：該模型表現(xiàn)為胰島素抵抗、高血糖等型糖尿病的特征，但有時高胰島素（RI）并不明顯，故不適宜于胰島素增敏劑的研究。,20,定義：自發(fā)性疾病動物模型是指在自然情況下正常染色體上的基因發(fā)生突變，從而出現(xiàn)具有某種遺傳缺陷或某種遺傳特點的動物，通過合理的遺傳育種和檢測手段加以定向培育，保持其遺傳性狀，培育出有研究價值的突變系動物。 自發(fā)性疾病動物模型是突變系疾病動物模型中的一種，后者還包括人工用物理、化學方法致基因突變，導致動物出現(xiàn)異常疾病表現(xiàn)，通過定向培育而保留下來的疾病模型。,第三節(jié) 自發(fā)性疾病動物模型,21,優(yōu)點： 在一定程度上減少了人為的因素，因此更接近于自然發(fā)病的人類疾病。 缺點: 自發(fā)突變自然發(fā)生率低，目前所有的自發(fā)性疾病動物模型數(shù)量有限； 發(fā)現(xiàn)和驗證基因突變需要專業(yè)知識，培育費時，專業(yè)性強； 有的疾病動物難以飼養(yǎng)繁殖。 有的疾病沒有自發(fā)性疾病動物模型 應該指出，很多自發(fā)性疾病動物在飼育過程中往往被當作為患病劣質動物而淘汰，這是很可惜的。通過分析和定向培育，保留其疾病特征，人們可能從中獲得更多的疾病材料。,22,自發(fā)性疾病動物模型介紹,一、自發(fā)性糖尿?。╯pontaneous diabetes mellitus）動物模型 世界衛(wèi)生組織（WHO）于1985年將糖尿病分為胰島素依賴型（insulin dependent diabetes mellitus，IDDM）和非胰島素依賴型（non insulin dependent diabetes mellitus，NIDDM）。目前已培育出上述兩種類型糖尿病的動物模型，其中以NIDDM動物模型居多。 1db/db（Diabetes）小鼠 是由近交系C57BL/KS小鼠單隱性基因突變后培育而成，屬NIDDM糖尿病模型。該模型具有肥胖、胰島素抵抗、高血糖、高胰島素血癥、高甘油三酯血癥等特征，臨床癥狀包括肥胖、高血糖、糖尿、蛋白尿、煩渴、多尿，最后可因酮尿而死亡。 2ob/ob（Obese） 小鼠 常染色體隱性遺傳，純合子動物，表現(xiàn)肥胖、高血糖和高胰島素血癥，屬NIDDM糖尿病模型。該小鼠因Leptin（ob基因產(chǎn)物）缺乏引起肝脂肪生成和肝糖原異生，高血糖又刺激胰島素分泌，引起胰島素抵抗的惡性循環(huán)。,23,3BB（Biobreeding）大鼠 選育自 Wistar大鼠，是型糖尿病的良好模型。其發(fā)病與自身免疫性毀壞胰島細胞引發(fā)胰腺炎和胰島素缺乏有關。大鼠通常在60120日齡時發(fā)病，數(shù)天后就出現(xiàn)嚴重的高血糖、低胰島素和酮血癥。給予免疫抑制劑、切除新生鼠胸腺等方法可預防糖尿病的發(fā)生，說明自身免疫參與發(fā)病過程。 4. GK大鼠 屬通過選擇糖耐量處于上限的Wistar大鼠近交繁殖重復數(shù)代培育而成。表現(xiàn)為胰島素分泌不全、胰島素抵抗、胰島纖維化等典型的NIDDM糖尿病特征。大鼠在長期糖尿病后會出現(xiàn)各種并發(fā)癥，如視網(wǎng)膜病、微血管病、神經(jīng)病、腎病等。和其它嚙齒類II型糖尿病動物模型相反，GK大鼠是非肥胖的。,24,二、自發(fā)性高血壓（spontaneous hypertension）動物模型 目前已培育出兔、大鼠和小鼠自發(fā)性高血壓模型 自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）: 由具有顯著高血壓癥狀的遠交Wistar雄性鼠與帶有輕微高血壓癥狀的雌性鼠交配選育而成。該鼠毛色為白色，其后代患有高血壓，一般在出生后血壓會隨著年齡的增長而升高。10周齡雄鼠平均血壓為18417 mmHg，雌鼠平均血壓為17814mmHg（23.71.9kPa）最高可超過200mmHg。該鼠高血壓形成機制與人類有許多相似之處，如血壓的升高與外周血管阻力的增加有關，高血壓性心血管病變多發(fā)，無明顯原發(fā)性腎臟或腎上腺損傷，對抗高血壓藥物有反應等，因此，它是目前國際公認的最接近于人類高血壓病的動物模型，亦是目前最為成熟、使用最多的自發(fā)性高血壓動物模型，適用于人類原發(fā)性高血壓研究及高血壓藥物活性篩選。,25,三、自發(fā)性快速老化（senescence accelerated mouse，SAM）小鼠 日本京都大學胸部疾患研究所老化生物研究室竹田俊男教授，在美國引進的AKR/J小鼠（胸腺腫瘤模型小鼠）中發(fā)現(xiàn)突變小鼠，用20年時間精心培育成功快速老化模型小鼠（SAM）。 主要特性 SAM系列中的一個品系在4-6月齡以前與普通小鼠的生長一樣，4-6月齡以后則迅速出現(xiàn)老化諸特征。如免疫功能紊亂，肺泡擴張，聽力損傷，退行性骨關節(jié)炎，骨質疏松，老化淀粉樣變，伴有或不伴有腦萎縮的學習記憶功能障礙等。該小鼠是研究老年病的理想動物模型。,26,免疫缺陷動物模型在腫瘤學、免疫學、遺傳學研究中的重要性 免疫缺陷動物發(fā)現(xiàn)前研究移植腫瘤模型的方法 接種 1.直接接種動物體內(nèi)： 2.移植到動物某些免疫反應較弱的器官，如眼球前房或腦組織、倉鼠頰囊以及雞胚等。 免疫抑制劑 全身射線照射 切除新生動物的胸腺、脾臟,第四節(jié) 免疫缺陷動物模型,27,免疫缺陷動物的發(fā)現(xiàn)歷史 1962年蘇格蘭醫(yī)師首先發(fā)現(xiàn)無毛裸小鼠，后來發(fā)現(xiàn)是基因突變導致胸腺發(fā)育不良。1966年確定裸基因位于第11條染色體上；1969年丹麥Rygaard教授將人結腸癌移植到裸小鼠獲得成功。 1953年英國Rowett研究所發(fā)現(xiàn)裸大鼠，在普通環(huán)境下僅維持15-16代。1975年再次發(fā)現(xiàn)裸大鼠，并證明是常染色體隱性遺傳。1978年用于人癌移植。 1983年美國Bosma發(fā)現(xiàn)Scid小鼠。 通過回交-互交人工培育的聯(lián)合免疫缺陷小鼠。,28,一、免疫缺陷動物的分類 （一）先天性免疫缺陷動物 T淋巴細胞功能缺陷動物：裸小鼠、裸大鼠、裸豚鼠 B淋巴細胞功能缺陷動物：CBA/N小鼠 NK細胞功能缺陷動物：Beige小鼠 聯(lián)合免疫缺陷動物：Scid小鼠、人工培育的聯(lián)合免疫缺陷動物,29,（二）獲得性免疫缺陷動物： 1小鼠AIDS模型：SCID小鼠的AIDS模型，轉基因小鼠的AIDS模型； 2猴AIDS模型：猴免疫缺陷病毒（SIV）急性感染模型， SIV慢性感染模型，D型離轉錄病毒感染模型； 3黑猩猩AIDS模型：黑猩猩人免疫缺陷病毒（HIV）感染模型。,30,二、免疫缺陷動物模型介紹 T淋巴細胞缺陷動物：裸小鼠 基因突變符號及定位：nu，第11對染色體 主要特性： 體表：被毛生長異常，呈裸體外表。隨著年齡增長，皮膚逐漸變薄、頭頸部皮膚出現(xiàn)皺折、生長發(fā)育遲緩。其中，BALB/c裸小鼠為淺紅色、白眼睛，C3H裸小鼠為灰白色，黑眼睛，C57BL裸小鼠為黑灰色或黑色； 免疫： T淋巴細胞功能缺陷，淋巴細胞轉化試驗為陰性；B淋巴細胞功能一般正常，但分泌的免疫球蛋白以IgM為主，僅含少量的IgG；NK細胞活力正常，6-8周齡時細胞活性還高于一般小鼠；,31, 生理：無胸腺，僅有胸腺殘跡或異常胸腺上皮，不能使T淋巴細胞正常分化，缺乏成熟的T淋巴細胞；抵抗力差，容易患病毒性肝炎和肺炎，必須飼養(yǎng)在屏障系統(tǒng)內(nèi)。,32, 生殖：一般采用純合子雄性小鼠與雜合子雌性小鼠交配繁育，可以獲得1/2 純合型仔鼠。 nu/nu +/nu nu/nu(+) + +/nu(+) 壽命：在SPF環(huán)境下可活15-26個月； T細胞缺陷可通過移植成熟T細胞、胸腺細胞或正常胸腺上皮得到校正。 常用裸小鼠品系：BALB/c-nu、NIH-nu、NC-nu、Swiss-nu、C3H-nu、C57BL-nu等。 主要用途： 廣泛應用于腫瘤學、免疫學、毒理學等 基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學的實驗研究。,33,2. B淋巴細胞功能缺陷動物：CBA/N 基因突變符號及定位：xid，X性染色體 品系特征： 免疫：B細胞發(fā)育先天性缺陷， B細胞功能缺乏，對非胸腺依賴性型抗原沒有體液免疫反應，血清IgG、IgM含量低； 生理：有x-連鎖免疫缺陷（x-linked immune defect），其病理改變與人類Bruton氏丙種球蛋白缺乏癥及Wiskott-Aidsch氏綜合征等相似； 移植正常鼠骨髓到xid 宿主，B淋巴細胞缺損可得到恢復。 用途：適用于研究x-染色體對免疫功能的影響，是研究B淋巴細胞的發(fā)生、功能與異質性的理想動物模型。,34,3. NK細胞功能缺陷動物：Beige小鼠 基因突變符號及定位：bg，13號染色體 品系特征： 體表：毛色變淺，耳朵和尾巴色素減少，尤其是出生時眼睛色淡，表型特征與人色素缺乏易感性增高綜合癥即齊-希二氏綜合征（Chedian-Higashi syndrome）相似； 免疫：NK細胞發(fā)育和功能缺陷，細胞毒T細胞功能損傷，粒細胞趨化性和殺菌活性降低，巨噬細胞抗腫瘤活性、移植物抗宿主（GVH）反應欠缺； 生理：溶酶體功能缺陷，對化膿性細菌敏感，必須飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中； 若將bg和nu非等位基因的小鼠(C57BL/6J)，通過雜交-互交，即可培育出T與NK細胞功能聯(lián)合缺陷的Beige/nude小鼠。 用途：Beige小鼠適用于作為色素缺乏易感性增高綜合征動物模型進行實驗研究。Beige/n