實驗用培養(yǎng)基適用性檢查標準操作規(guī)程

1、起草人Prepared by: 起草日期Date:_QC審核人Reviewed by: 審核日期Date:_QC審核人Reviewed by: 審核日期Date: QA批準人Approved by: 批準日期Date: 質(zhì)量部QD頒發(fā)部門Issued byQC執(zhí)行日期Effective Date替換文件Replaced ForSOP-QC-562-02實驗用培養(yǎng)基適用性檢查標準操作規(guī)程復(fù)審日期Review Date分發(fā)部門：Distributed toQA,QC分發(fā)號Distribution No.:目的 Purpose為保障微生物檢驗的準確性及相關(guān)工作特制定本規(guī)定。范圍 Scope 本程序適

2、用于微生物限度測定培養(yǎng)基的適用性檢查及相關(guān)工作。 職責 Responsibility 分析員：嚴格按照本操作規(guī)程執(zhí)行。及時完成各類相關(guān)記錄。在主管的指導(dǎo)下進行任何可能的OOS及偏差調(diào)查。主管：監(jiān)督本操作規(guī)程的執(zhí)行。對檢驗員進行必要的培訓(xùn)。指導(dǎo)任何可能的OOS和偏差調(diào)查。內(nèi)容procedure 1 檢驗員應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基配制程序或培養(yǎng)基各自的說明書配制培養(yǎng)基。2 試驗用菌種及培養(yǎng)基2.1 菌種:2.1.1 培養(yǎng)基靈敏度測試所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代，從國家藥檢所或菌種保藏中心購買。2.1.2 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 66332.1.3 大腸埃希菌(Escher

3、ichia coli) ATCC 87392.1.4 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 65382.1.5 白色念珠菌(Candida albicans) ATCC 102312.1.6 黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 164042.1.7 傷寒沙門菌(Salmonella) ATCC 140282.1.8 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 90272.2 培養(yǎng)基2.2.1 按照培養(yǎng)基說明書進行配制滅菌。2.2.2 大豆酪蛋白消化肉湯 Soybean-Casein Digest Broth2.2.

4、3 大豆酪蛋白消化瓊脂 Soybean-Casein Digest Agar2.2.4 沙氏葡萄糖瓊脂 Sabouraud Dextrose Agar2.2.5 腸道菌增菌肉湯 Enterobacteria Enrichment Broth Mossel2.2.6 紫紅色膽汁葡萄糖瓊脂 Violet Red Bile Glucose Agar2.2.7 麥康凱肉湯 MacConkey Broth2.2.8 麥康凱瓊脂 MacConkey Agar2.2.9 RV沙門氏菌富集肉湯 Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth2.2.10 木糖

5、賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂 Xylose Lysine Deoxycholate Agar2.2.11 甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基 Mannitol Salt Agar2.3 微生物計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查2.3.1 微生物計數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進行培養(yǎng)基適用性檢查。2.3.2 菌懸液的制備名稱金黃色葡萄球菌ATCC 6538銅綠假單胞菌ATCC 9027菌株制備大豆酪蛋白消化肉湯或大豆酪蛋白消化瓊脂30-35，18-24小時大豆酪蛋白消化肉湯或大豆酪蛋白消化瓊脂30-35，18-24小時名稱枯草芽孢桿菌ATCC 6633白色念珠菌ATCC 10231菌株制備大豆酪蛋白消化

6、肉湯或大豆酪蛋白消化瓊脂30-35，18-24小時沙氏葡萄糖瓊脂20-25，2-3天名稱黑曲霉ATCC 16404菌株制備沙氏葡萄糖瓊脂20-25，5-7天 或者直到形成良好的孢子狀態(tài)2.3.3 上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.2磷酸鹽緩沖液制成每1ml含菌數(shù)不大于100cfu的菌懸液，制備黑曲霉孢子懸浮液時，添加3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.2磷酸鹽緩沖液，將孢子洗脫。然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%菌氯化鈉溶液或pH7.2磷酸鹽緩沖液制成每1ml含孢子數(shù)不大于100c

7、fu的孢子懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在28可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2-8，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。2.4 大豆酪蛋白消化肉湯促生長試驗2.4.1 取以上前3種菌懸液各0.1ml(不大于100cfu)，分別注入滅過菌的含有10ml大豆酪蛋白消化肉湯的試管中，于30-35培養(yǎng)不超過3天。同時用相應(yīng)的上一批通過促生長試驗的培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。培養(yǎng)結(jié)束后進行觀察，如果肉眼能清晰看到的微生物的生長與上一批通過促生長試驗的培養(yǎng)基的生長情形基本一致，則判定此培養(yǎng)基通過促生長試驗。反之則判定此培養(yǎng)基不符合規(guī)定，未通過促生長試驗。2.5 大豆酪蛋白消化瓊脂和

8、沙氏葡萄糖瓊脂促生長試驗2.5.1 取以上5種菌懸液各1ml（不大于于100cfu），分別注入無菌平皿中，立即傾注大豆酪蛋白消化瓊脂，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻、凝固，置30-35培養(yǎng)不超過3天，計數(shù)，后2種菌懸液不超過5天，計數(shù)。再取后2種菌懸液各少于100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻、凝固，置20-25培養(yǎng)不超過5天，計數(shù)。同時用相應(yīng)的上一批通過促生長試驗的培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。進行促生長試驗的培養(yǎng)基平皿上，微生物生長情況必須與已通過促生長試驗的培養(yǎng)基平皿上的微生物生長情況一致或者更好，同時將待測定的培養(yǎng)基上的菌落數(shù)

9、與已通過促生長試驗的培養(yǎng)基上的菌落數(shù)對比，兩者之間的比值應(yīng)處于70%-200%之間,則判定此培養(yǎng)基通過促生長試驗；反之則判定該培養(yǎng)基不符合規(guī)定，未通過促生長試驗。2.6 控制菌測試所用培養(yǎng)基的適用性檢查2.6.1 控制菌檢查用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進行培養(yǎng)基適用性檢查。2.6.2 菌懸液的制備序號試驗菌種菌株培養(yǎng)1金黃色葡萄球菌ATCC 6538大豆酪蛋白消化肉湯或大豆酪蛋白消化瓊脂 30-35，18-24小時2銅綠假單胞菌 ATCC 9027大豆酪蛋白消化肉湯或大豆酪蛋白消化瓊脂 30-35，18-24小時3枯草芽孢桿菌 ATCC 6633大豆酪蛋白消化肉湯或大豆

10、酪蛋白消化瓊脂 30-35，18-24小時4大腸埃希菌 ATCC 8739大豆酪蛋白消化肉湯或大豆酪蛋白消化瓊脂 30-35，18-24小時5鼠傷寒沙門菌 ATCC 14028大豆酪蛋白消化肉湯或大豆酪蛋白消化瓊脂 30-35，18-24小時2.6.3 上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.2磷酸鹽緩沖液制成適宜濃度的菌懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在28可在24小時內(nèi)使用。2.6.4 控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查項目包括培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力及指示能力的檢查。各培養(yǎng)基的檢查測試項目及所用菌株見下表控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗菌株膽汁耐受革蘭氏陰性菌的檢測腸道菌增菌

11、肉湯培養(yǎng)基促生長能力大腸埃希菌 銅綠假單胞菌抑制能力金黃色葡萄球菌紫紅色膽汁葡萄糖瓊脂促生長能力+指示能力大腸埃希菌銅綠假單胞菌大腸桿菌的檢測麥康凱肉湯促生長能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示能力大腸埃希菌沙門氏菌的檢測RV沙門氏菌富集肉湯促生長能力鼠傷寒沙門菌抑制能力金黃色葡萄球菌木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示能力鼠傷寒沙門菌銅綠假單胞菌的檢測溴化十六烷三甲基銨瓊脂促生長能力銅綠假單胞菌抑制能力大腸埃希菌金黃色葡萄球菌的檢測甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示能力金黃色葡萄球菌抑制能力大腸埃希菌2.7 液體培養(yǎng)基促生長能力檢查取試驗菌各0.1

12、ml（含菌數(shù)不大于100cfu）（見上表）于被檢培養(yǎng)基和上一批檢驗并通過的培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。兩者比較，被檢培養(yǎng)基與上一批檢驗并通過的培養(yǎng)基比較，微生物生長良好并且相當。2.8 固體培養(yǎng)基促生長能力檢查取試驗菌各0.1ml（含菌數(shù)不大于100cfu）（見上表）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和上一批檢驗并通過的培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。兩者比較，被檢培養(yǎng)基與上一批檢驗并通過的培養(yǎng)基比較，微生物生長良好并且相當。2.9 液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基的抑制能力檢查取試驗菌各0.1ml（含菌數(shù)不小于100cfu）（見上表）于被檢培養(yǎng)基中，在

13、相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最長時間下培養(yǎng)，試驗菌應(yīng)不得生長。2.10 培養(yǎng)基指示能力檢查取試驗菌各0.1ml（含菌數(shù)不大于100cfu）（見上表）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和上一批檢驗并通過的培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及時間范圍內(nèi)培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基中生長的菌落在外觀和指示反應(yīng)上與從此前已檢測并批準的培養(yǎng)基批次所獲得的菌落是相當?shù)摹? 參考文件 Current USP、BP、EP 附件及相關(guān)文件Attachment and related documentsR01 微生物計數(shù)固體培養(yǎng)基適用性檢查記錄R02 微生物計數(shù)液體培養(yǎng)基適用性檢查記錄R03 微生物控制菌培養(yǎng)基適用性檢查記錄歷史H

14、istory修訂號生效日期修訂內(nèi)容001.培養(yǎng)基促生長、抑制能力等規(guī)定了試驗菌的取樣量。附件編號Attachment No.:R01 微生物計數(shù)固體培養(yǎng)基適用性檢查記錄Growth promotion test of solid media for Microbial enumeration test 培養(yǎng)基名稱廠家/批號配制后批號有效期至檢驗日期培養(yǎng)溫度培養(yǎng)箱編號有效期至對照批號有效期至檢驗員1 操作步驟1.1使用0.9%無菌氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液制備測試菌懸液，制備黑曲霉孢子懸浮液時，可以添加0.05%的聚山梨脂80到緩沖液中。測試菌懸液應(yīng)在兩小時內(nèi)使用，或者在2-8的條件下24小時內(nèi)使

15、用。1.2取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種菌懸液各少于100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注大豆酪蛋白消化瓊脂，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻、凝固，置30-35培養(yǎng)不超過3天，計數(shù)；后2種菌懸液不超過5天，計數(shù)。再取后2種菌懸液各少于100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻、凝固，置20-25培養(yǎng)不超過5天，計數(shù)。取銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌2種菌懸液各少于100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注R2A, 每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻、凝固，置30-35培養(yǎng)不超過3天。同時用相應(yīng)的上一批通過促生

16、長測試的培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。1.3進行促生長試驗的培養(yǎng)基平皿上，微生物生長情況必須與已通過促生長測試的培養(yǎng)基平皿上的微生物生長情況一致或者更好，同時將待測定的培養(yǎng)基上的菌落數(shù)與已通過促生長測試的培養(yǎng)基上的菌落數(shù)對比，兩者之間的比值應(yīng)處于70%-200%之間,則判定此培養(yǎng)基通過促生長測試；反之則判定該培養(yǎng)基不符合規(guī)定，未通過促生長測試。2 記錄： 菌種菌液批號開始培養(yǎng)時間/溫度結(jié)束培養(yǎng)時間/溫度測試培養(yǎng)基菌落數(shù)對照培養(yǎng)基菌落數(shù)對比生長情況（基本一致或更好）兩者比值（70%-200%之間）觀察員結(jié)果判定平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均附件編號Attachment No.:R02微生物

17、計數(shù)液體培養(yǎng)基適用性檢查記錄Growth promotion test of liquid media for Microbial enumeration test 培養(yǎng)基名稱廠 家批 號配制后批號有效期至培養(yǎng)箱編號有效期至對照批號有效期至檢驗員檢驗日期1 操作步驟1.1使用0.9%無菌氯化鈉溶液或PH7.2磷酸鹽緩沖液制備測試菌懸液。測試菌懸液應(yīng)在兩小時內(nèi)使用，或者在2-8的條件下24小時內(nèi)使用。1.2取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3種菌懸液各少于100cfu，分別注入滅過菌的含有10ml大豆酪蛋白消化肉湯的試管中，于30-35培養(yǎng)不超過3天。同時用相應(yīng)的上一批通過促生長測試的

18、培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。培養(yǎng)結(jié)束后進行觀察。1.3如果肉眼能清晰看到的微生物的生長與上一批通過靈敏度測試的培養(yǎng)基的生長情形相同的話，則判定此培養(yǎng)基通過促生長測試。反之則判定此培養(yǎng)基不符合規(guī)定，未通過促生長測試。2 記錄：開始培養(yǎng)時間/溫度_ 結(jié)束培養(yǎng)時間/溫度_菌種菌液批號測試培養(yǎng)基生長情況對照培養(yǎng)基生長情況對比生長情況（基本一致或更好）觀察員結(jié)果判定符合不符合符合不符合符合不符合附件編號Attachment No.:R03 微生物控制菌培養(yǎng)基適用性檢查記錄Growth promotion test of media for Specified Microorganisms tests 培養(yǎng)基名稱廠家/批號配制后批號有效期至檢驗日期培養(yǎng)溫度培養(yǎng)箱編號有效期至對照批號有效期至檢驗員1 操作步驟1.1使用0.9%無菌氯化鈉