dna測序儀【精制材料】

1、第十四章 全自動DNA測序儀和 蛋白質自動測序儀,1,實操應用,元素周期表的發(fā)現(xiàn)奠定了二十世紀物理、化學研究和發(fā)展的基礎,元素周期表,“基因組序列圖”將奠定二十一世紀生命科學研究和生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎！,“基因組”-生命科學的“元素周期表”,人體解剖圖奠定了現(xiàn),代醫(yī)學發(fā)展的基礎,2,實操應用,生命的奧秘蘊藏于 “四字天書”之中,GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCA TCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCT CCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTC GCTTTC

2、TTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT,3,實操應用,了解生命現(xiàn)象、解釋疾病的發(fā)生、診斷和治療疾病，是生命科學的核心內(nèi)容之一 核酸和蛋白質是控制生命過程的兩種重要大分子，其結構或功能異常是導致遺傳性疾病或遺傳相關性疾病的主要因素或相關因素，是生命科學研究的主要對象,4,實操應用,核酸分子攜帶生命活動的全套信息，其基本結構核苷酸的線性排列構成它的一級結構 蛋白質的一級結構是指構成蛋白質的基本單位氨基酸的排列順序，研究蛋白質的一級結構是了解蛋白質功能的基礎,5,實操應用,第一節(jié) 全自動DNA測序儀,DNA測序 核苷酸序列 早期：小片段重疊法 通過測定RNA序列來

3、推測DNA序列 缺點：既費時又不準確 20世紀80年代以后 ：DNA自動測序儀 Sanger雙脫氧鏈末端終止法 Maxam-Gilber化學降解法 優(yōu)點：操作簡單、安全、快速、準確,6,實操應用,Sanger雙脫氧鏈末端終止法 Maxam-Gilber化學降解法 都是根據(jù)在某一固定的點開始核苷酸鏈的延伸，隨機在某一個特定的堿基處終止，產(chǎn)生A、T、C、G四組不同長度的一系列核苷酸鏈，在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳進行片段的分離和檢測，從而獲得DNA序列 雙脫氧鏈末端終止法更簡便和更適合于光學自動探測，故在全自動DNA測序儀中應用廣泛,7,實操應用,原理 一個末端標記的DNA片段在4組互相獨立的化學反

4、應中分別得到部分降解，其中每一組反應特異的針對某一種或某一類堿基。因此生成4種放射性標記的分子，從共同起點（放射性標記末端）延續(xù)到發(fā)生化學降解的位點。每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應所針對的堿基在原DNA全片段上位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標記的分子。,Maxam-Gilber化學降解法,8,實操應用,基本步驟 第一步，對特定堿基（或特定類型的堿基）進行化學修飾； 第二步，修飾堿基從糖環(huán)上脫落，修飾堿基5和3的磷酸二酯鍵斷裂； 第三步，比較G、A+G、C+T、C以及AC各個泳道，可從測序凝膠的放射自顯影片上讀取DNA序

5、列。,9,實操應用,10,實操應用,特點,重現(xiàn)性好，所用試劑簡單，易于掌握； 所測長度比Sanger法短一些，對放射性標記末端250個核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果較好； 序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應所生成的拷貝； 可對合成的寡核苷酸進行測序，用以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，通過化學保護及修飾干擾實驗來研究DNA的二級結構及蛋白質-DNA相互作用。 無需延伸反應及克隆 更適于含有稀有堿基或GC含量高及短鏈寡核苷酸的測序，可雙向標記并測序。 比較繁瑣費時，過長序列有困難。,11,實操應用,12,實操應用,13,實操應用,14,實操應用,（一）雙脫氧鏈末端終止法測序原理,利用DNA的體

6、外合成過程聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR） DNA聚合酶的催化 以目的DNA為模板 按照堿基互補配對原則 在引物的引導下,單核苷酸聚合形成新DNA鏈,15,實操應用,普通的PCR反應體系中，加入的核苷酸單體為 4種2-脫氧核苷三磷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）,dNTP結構示意圖,16,實操應用,測序反應體系中，加入的核苷酸單體為 2,3-雙脫氧核苷三磷酸 （ddNTP）,ddNTP結構示意圖,17,實操應用,PCR（聚合酶鏈式反應）原理,反應所需物質：DNA模板、引物、DNA聚合 酶、dNTP、緩沖液 每個循環(huán)包括：變性（90）、退火

7、（54 ）、延伸（72 ）,18,實操應用,與dNTP相比，ddNTP在脫氧核糖的位置上缺少一個羥基，反應過程中雖然可以在DNA聚合酶作用下，通過其磷酸基團與正在延伸的DNA鏈的末端脫氧核糖-OH發(fā)生反應，形成磷酸二酯鍵而摻入到DNA鏈中，但它們本身沒有-OH，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，從而使正在延伸的DNA鏈在此終止。,19,實操應用,據(jù)此原理分別設計四個反應體系，每一反應體系中存在相同的DNA模板、引物、四種dNTP和一種ddNTP(如ddATP)，則新合成的DNA鏈在可能摻入正常dNTP的位置都有可能摻入ddNTP而導致新合成鏈在不同的位置終止。 由于存在ddNTP與dNTP的

8、競爭，生成的反應產(chǎn)物是一系列長度不同的多核苷酸片段。,20,實操應用,dNTPs,雙脫氧鏈末端終止法測序反應原理（1）,21,實操應用,雙脫氧鏈末端終止法測序反應原理（2）,22,實操應用,雙脫氧鏈末端終止法測序反應原理（3）,23,實操應用,雙脫氧鏈末端終止法測序反應原理（4）,24,實操應用,25,實操應用,雙脫氧鏈末端終止法測序反應原理（5）,26,實操應用,（二）新生鏈的熒光標記原理,早期采用同位素法標記新生鏈，因其具有放射性危害、背景高等缺點而很快被熒光染料標記法所取代 熒光染料的熒光和散射背景較弱，提高了信噪比；它們的激發(fā)光譜較接近而發(fā)射光譜均位于可見光范圍，且不同染料的發(fā)射光譜相

9、互分開，易于監(jiān)測，故在DNA自動測序中得到廣泛應用,27,實操應用,熒光染料 標記法,單色熒光標記法 多色熒光標記法,熒光標記引物法 熒光標記終止底物法,熒光標記引物法 熒光標記終止底物法,28,實操應用,多色熒光標記法 - 熒光標記引物法 定義：將熒光染料預先標記在測序反應所用引物的5端 一組（4種）熒光標記引物，其序列相同，但標記的熒光染料顏色不同 測序反應中，模板、反應底物、DNA聚合酶及標記引物等按A、T、C、G編號被置于4支微量離心管中，A、T、C、G四個測序反應分管進行，上樣時合并在一個泳道內(nèi)電泳。特定顏色熒光標記的引物則與特定的雙脫氧核苷酸底物保持對應關系,29,實操應用,熒光標

10、記引物法,圖18-8 熒光標記引物法原理,30,實操應用,多色熒光標記法 - 熒光標記終止底物法 定義：將熒光染料標記在作為終止底物的雙脫氧單核苷酸上 反應中將4種ddNTP分別用4種不同的熒光染料標記，帶有熒光基團的ddNTP在摻入DNA片段導致鏈延伸終止的同時，也使該片段端標上了一種特定的熒光染料 經(jīng)電泳后將各個熒光譜帶分開，根據(jù)熒光顏色的不同來判斷所代表的不同堿基信息,31,實操應用,模板：T C C A T G A T 產(chǎn)物：A A G A G G A G G T A G G T A A G G T A C A G G T A C T,新生鏈的熒光標記原理,32,實操應用,都確定了4種

11、熒光染料與4種ddNTP所終止的DNA片段之間的專一對應關系 熒光標記引物法使熒光有色基團標記在長短不同的DNA片段的端，可理解為熒光染料標記過程和延伸反應終止分別發(fā)生在同一DNA片段的兩端，且標記發(fā)生在引物與模板的退火過程中，而終止是發(fā)生在片段延伸過程中，兩者在時間上有一定間隔 熒光標記終止底物法使標記和終止過程合二為一，兩者在同一時間完成 在具體操作中，前者要求A、C、G、T四個反應分別進行，而后者的四種反應可以在同一管中完成,熒光標記引物法和熒光標記終止底物法的異同點：,33,實操應用,單色熒光標記法 也包括熒光標記引物法和熒光標記終止底物法 與多色熒光標記法不同的是單色熒光標記引物法和

12、熒光標記終止底物法均需將A、C、G、T四個反應分別在不同擴增管中進行，電泳時各管產(chǎn)物也分別在不同泳道中電泳,34,實操應用,均可分為熒光標記引物法和熒光標記終止底物法 單色熒光標記法需將A、C、G、T四個反應分別在不同擴增管中進行，電泳時各管產(chǎn)物也分別在不同泳道中電泳 多色熒光標記引物法需將A、C、G、T四個反應分別在不同擴增管中進行，電泳時可合并在同一泳道中電泳 多色熒光標記終止底物法可將A、C、G、T四個反應在同一擴增管中進行，電泳時在同一泳道中電泳,單色熒光標記法與多色熒光標記法的異同點：,35,實操應用,（三）熒光標記DNA的檢測原理,測序反應一般以單引物進行DNA聚合酶延伸反應，絕大

13、多數(shù)產(chǎn)物均為單鏈 反應結束后，樣品經(jīng)簡單純化處理就可以放置到自動測序儀中開始電泳 兩極間極高的電勢差推動著各個熒光DNA片段在凝膠高分子聚合物中從負極向正級泳動并達到相互分離，且依次通過檢測窗口 由激光器發(fā)出的極細光束，通過精密的光學系統(tǒng)被導向檢測區(qū)，在這里激光束以與凝膠垂直的角度激發(fā)熒光DNA片段,36,實操應用,DNA片段上的熒光發(fā)色基團吸收了激光束提供的能量而發(fā)射出特征波長的熒光 代表不同堿基信息的不同顏色熒光經(jīng)過光柵分光后再投射到CCD攝像機上同步成像。收集的熒光信號再傳輸給計算機加以處理 整個電泳過程結束時在檢測區(qū)某一點上采集的所有熒光信號就轉化為一個以時間為橫軸坐標，熒光波長種類和

14、強度為縱軸的信號數(shù)據(jù)的集合 經(jīng)測序分析軟件對這些原始數(shù)據(jù)進行分析，最后的測序結果以一種清晰直觀的圖形顯示出來,37,實操應用,多色熒光標記技術檢測優(yōu)點： 一個樣本的四個測序反應產(chǎn)物可以同時在一個泳道內(nèi)電泳，避免單一標記時四個泳道測序因泳道間遷移率不同對精確度的影響，提高了測序精度 一個樣品所有反應產(chǎn)物只需進樣一次，所以一次實驗便可以處理較之手工方法更多的樣品。在相同樣品數(shù)的情況下，加樣的工作量也大大減少,38,實操應用,DNA序列測定的策略,克隆亞克隆的方法 (clone-by-clone) 全基因組散彈法(鳥槍法) (whole-genome shotgun method),39,實操應用,

15、兩種大規(guī)?；蚪M測序策略的比較,40,實操應用,克隆亞克隆的方法 (clone-by-clone),是以物理圖譜為基礎、以大插入片斷克隆為單位的定向測序策略。其方法是先構建議染色體為單位的遺傳圖譜，再利用高覆蓋率的大片斷基因組文庫（BAC、YAC等）獲得精細的物理圖譜，選擇合適的BAC或YAC克隆進行亞克隆測序，用計算機拼裝，通過引物步移等手段填補BAC內(nèi)的空洞，形成一條完整的BAC序列。然后參照物理圖譜，將相互關聯(lián)、部分重疊的BAC克隆聯(lián)成一個大的重疊群(Contig)。但一些長串聯(lián)的高度重復序列區(qū)域和克隆或測序所不能獲得的區(qū)域，仍會存在一些物理空洞（Physical Gap）。與Shot-

16、gun方法相比較，Clone by Clone的技術難度較高，尤其是大片段基因組文庫（如BAC文庫）的精細物理圖譜的構建是技術性極強的工作；并且測序費用和所需的時間也相對較多。,41,實操應用,人類基因組計劃研究的主要成果和進展表現(xiàn)在這“四張圖”,遺傳圖譜 又稱為連鎖圖譜（linkage map），指基因或DNA標志在染色體上的相對位置與遺傳距離 物理圖譜 以定位的DNA標記序列如STS作為路標，以DNA實際長度即bp、kb、Mb為圖距的基因組圖譜。 轉錄圖譜 利用EST（expressed sequence tags 表達序列標簽）作為標記所構建的分子遺傳圖譜 序列圖譜 通過基因組測序得到的

17、，以A、T、G、C為標記單位的基因組DNA序列,42,實操應用,43,實操應用,全基因組散彈法(鳥槍法)(whole-genome shotgun method),是借助物理和化學的手段，將整個基因隨機打斷成一定大小的片段進行測序，再根據(jù)序列間的重疊關系進行計算機拼接和組裝，確定它們在基因組中的位置。Shot-gun的優(yōu)點是速度快、簡單易行、成本較低，可在短時間內(nèi)通過集中設備和人力獲得海量的基因組序列。缺點在于序列的拼接組裝比較困難，在重復序列較多的區(qū)域難度更大；由于缺少基因組的物理圖譜，有些序列難以準確定位，成為游離片段；此外，受文庫的隨機性和測序的覆蓋度的影響，某些區(qū)域會形成較大的空洞（G

18、ap）,44,實操應用,45,實操應用,二、全自動DNA測序儀的結構與功能,全自動DNA測序儀 平板型電泳的凝膠灌制在兩塊玻璃板中間，聚合后厚度一般小于0.4mm或更少，因此又稱為超薄片層凝膠電泳 毛細管電泳技術將凝膠高分子聚合物灌制于毛細管中（內(nèi)徑50m100m），在高壓及較低濃度膠的條件下實現(xiàn)DNA片段的快速分離,平板型電泳 毛細管電泳,46,實操應用,310型全自動遺傳分析儀,ABI Prism 3100遺傳分析儀,3700型全自動遺傳分析儀,安瑪西亞DNA序列分析系統(tǒng)型號：MegaBACE 500/1000/4000,47,實操應用,（一）儀器的組成,主機： 主要包括電泳系統(tǒng)、激光器和

19、熒光檢測系統(tǒng) ；大致可分為自動進樣器區(qū) 、凝膠塊區(qū)和檢測區(qū)等結構功能區(qū) 微型計算機 各種應用軟件,48,實操應用,PE310 基因分析儀的結構,49,實操應用,凝膠塊區(qū),自動進樣器區(qū),檢測區(qū),PE310 基因分析儀的主機分區(qū),50,實操應用,熱板,毛細管,雷射檢測器,注射器驅動桿,毛細管和電極,注射器,正極緩沖液,泵塊,自動進樣器,負極緩沖液,PE310 基因分析儀的基本結構,51,實操應用,（二）儀器各組成部分的功能,1. 主機功能 具有自動灌膠、進樣、電泳、熒光檢測等功能 (1)自動進樣器區(qū)功能 自動進樣器受程序控制進行三維移動，因負極電極和毛細管均固定不動，故許多操作如毛細管進入樣品盤標

20、本孔中進樣、電極和毛細管在電極緩沖液瓶、洗滌液和廢液管中移動等均依靠自動進樣器的移動完成；,52,實操應用,電極為電泳的負性電極，測序過程中，正、負極之間的電勢差可達15000伏，如此高的電勢差可促進DNA分子在毛細管中很快泳動，達到快速分離不同長度DNA片段的目的； 樣品盤有48孔和96孔兩種，可一次性連續(xù)測試48或96個樣本 電極固定螺母起固定電極及毛細管的作用。,53,實操應用,(2)凝膠塊區(qū)功能 注射器驅動桿：給注射器提供正壓力，將注射器內(nèi)的凝膠注入毛細管中。在分析每一個樣品前，泵自動沖掉上一次分析用過的膠，灌入新膠； 樣品盤按鈕：控制自動進樣器進出； 注射器固定平臺：起固定注射器的作

21、用； 電極：為電泳的正性電極，始終浸泡在正極緩沖液中；,54,實操應用,正極緩沖液閥：當注射器驅動桿下移，將注射器內(nèi)的凝膠壓入毛細管時，緩沖液閥關閉，以防止膠進入緩沖液；電泳時此閥打開，提供電流通道； 玻璃注射器：儲存凝膠高分子聚合物以及在填充毛細管時提供必要的壓力； 毛細管固定螺母：固定毛細管； 廢液閥：在清洗泵塊時控制廢液流。,55,實操應用,(3)檢測區(qū)功能 激光檢測器窗口及窗蓋： 激光檢測器窗口正對毛細管檢測窗口，從儀器內(nèi)部的氬離子激光器發(fā)出的激光可通過激光檢測器窗口照到毛細管檢測窗口上。電泳時，當熒光標記DNA鏈上的熒光基團通過毛細管窗口時，受到激光的激發(fā)而產(chǎn)生特征性的熒光光譜，熒光

22、經(jīng)分光光柵分光后投射到CCD攝像機上同步成像。 窗蓋起固定毛細管的作用，同時可防止激光外泄；,56,實操應用,激光檢測器檢測特征性的熒光光譜,激光檢測器檢測特征性的熒光光譜,57,實操應用,加熱板：電泳過程中起加熱毛細管的作用，一般維持在50； 毛細管：為填充有凝膠高分子聚合物的玻璃管，直徑為50m，電泳時樣品在毛細管內(nèi)從負極向正極泳動； 熱敏膠帶：將毛細管固定在加熱板上。,58,實操應用,DNA測序圖,59,實操應用,2. 微型計算機功能 控制主機的運行，并對來自主機的數(shù)據(jù)進行收集和分析。設置測序條件（樣品的進樣量、電泳的溫度、時間、電壓等），同步監(jiān)測電泳情況并進行數(shù)據(jù)分析 3.各類軟件功能

23、 承擔數(shù)據(jù)收集、DNA序列分析及DNA片段大小和定量分析等功能。其結果可由彩色打印機輸出,60,實操應用,三、全自動DNA測序儀的常見 故障及維護,毛細管電泳型DNA測序儀 平板電泳型DNA測序儀,電泳時儀器顯示無電流 電極彎曲 電泳時產(chǎn)生電弧 其它,電泳時儀器顯示無電流 傳熱板粘住膠板 其它,61,實操應用,（一）毛細管電泳型DNA測序儀的常見故障及維護,電泳時儀器顯示無電流 電泳緩沖液蒸發(fā)使液面降低，而未能接觸到毛細管 電極彎曲而無法浸入緩沖液中 毛細管未浸入緩沖液中 毛細管內(nèi)有氣泡等,62,實操應用,電極彎曲 安裝、調整或清洗電極后未進行電極定標操作就直接執(zhí)行電泳命令，電極不能準確插入各

24、管中 運行前未將樣品盤歸位、或雖然執(zhí)行了歸位操作，但X/Y軸歸位尚未結束就運行Z軸歸位等,63,實操應用,電泳時產(chǎn)生電弧 主要原因是電極、加熱板或自動進樣器上有灰塵沉積 其它 測序結束后應將毛細管負極端浸在蒸餾水中，避免凝膠干燥而阻塞毛細管 定期清洗泵塊 定期更換電極緩沖液、洗滌液和廢液管,64,實操應用,（二）平板電泳型DNA測序儀的常見故障及維護,電泳時儀器顯示無電流 電泳緩沖液配制不正確 電極導線未接好或損壞 正極或負極鉑金絲斷裂 正極或負極的膠面未浸入緩沖液中 傳熱板粘住膠板 主要原因為上方的緩沖液室漏液,65,實操應用,其它 倒膠前應按照操作要求認真清洗玻璃板 配制凝膠時應注意膠的濃

25、度、TEMED含量、尿素濃度等 倒膠時需注意不能有氣泡 將待測樣品加入各孔前，應使用緩沖液沖洗各孔，把尿素沖去，以免影響電泳效果,66,實操應用,Smith等于1986年首次建立了一種使用四種不同熒光分別標記四種不同堿基的方法 同年，Ansorge建立了一種使用單色熒光四甲基羅丹明作為標記染料的自動測序方法 平板法電泳是經(jīng)典的電泳技術，具有樣品判讀序列長（600bp900bp）、一塊凝膠板上可同時進行多個樣品測序（可達96個）的優(yōu)點 毛細管電泳為近20年來建立的一種快速、高效、進樣量少、靈敏度高的新技術，可測序列達到750bp左右,67,實操應用,四、全自動DNA測序儀的進展,單色熒光標記 四

26、色熒光標記 平板型電泳 毛細管電泳,芯片實驗室（lab-on-a-chip） 縮微生物處理器（microfabricated bioprocessor），成功完成納升級標本的Sanger DNA測序,68,實操應用,縮微生物處理器結構示意圖,2006年，美國科學院院報（PANS）上公布了Blazej等建立的縮微生物處理器測序技術?？s微生物處理器基本結構為3層玻璃薄片和一層聚二甲基硅氧烷薄片，各層間緊密粘合形成圓盤狀，直徑僅10厘米。聚二甲基硅氧烷是一種新型材料，具有能調控水合作用、通透性好等特點，保證了縮微生物處理器能夠準確進行反應。該材料最近在蛋白結晶結構分析中也發(fā)揮了重要作用。,69,實操

27、應用,五、全自動DNA測序儀的主要應用,人類基因組測序 人類遺傳病、傳染病和癌癥的基因診斷 法醫(yī)的親子鑒定和個體識別 生物工程藥物的篩選 動植物雜交育種,70,實操應用,第二節(jié) 蛋白質自動測序儀,蛋白質順序指肽鏈中氨基酸的排列順序 通常從左至右表示肽鏈從氨基酸氨基端（N末端）到羧基端（C末端） 蛋白質測序儀工作原理：執(zhí)行全自動化的Edman化學降解反應和游離氨基酸的分離與鑒定過程,71,實操應用,一、蛋白質測序儀的工作原理,Edman降解法,多肽鏈N末端NH2 PITC,弱堿,苯異硫甲氨酰肽,TFA,噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物 剩余多肽,弱 堿,苯異硫甲氨酰肽,TFA,噻唑啉酮苯胺（ATZ）

28、衍生物 剩余多肽,PTH氨基酸,PTH氨基酸,HPLC,HPLC,苯異硫氰酸酯,三氟乙酸,經(jīng)酸作用，再進一步環(huán)化,苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH）衍生物,72,實操應用,上述降解循環(huán)的偶聯(lián)和環(huán)化發(fā)生在測序儀的反應器（筒）中，轉化則在轉化器進行。 轉化后的PTH氨基酸經(jīng)自動進樣器注入高效液相色譜(high performance liquid chromatogram, HPLC)進行在線檢測。 根據(jù)PTH氨基酸的洗滌滯流時間確定每一種氨基酸。,73,實操應用,二、蛋白質測序儀的結構及其各部件的功能,測序反應系統(tǒng) 主要部件為反應器 氨基酸分析系統(tǒng) 由高效液相色譜毛細管層析柱組成 信息軟件處理系統(tǒng) 根據(jù)氨基酸的層析峰來判斷為何種氨基酸,74,實操應用,三、蛋白質測序儀的主要應用,新蛋白質的鑒定 在凝膠電泳中出現(xiàn)的未知條帶可以利用蛋白質測序儀來測定其序列 分子克隆探針的設計 用蛋白質序列信息設計PCR引物和寡核苷酸探針?？梢岳眠@些探針進行cDNA文庫或基因組文庫的篩選 抗原的人工多肽合成,75,實操應用,本 章 小 結,DN