第十一章 轉(zhuǎn)錄.ppt

1、第十一章RNA的生物合成,RNA Biosynthesis,在生物界，RNA合成有兩種方式：,DNA指導(dǎo)的RNA合成（轉(zhuǎn)錄）,RNA指導(dǎo)的RNA合成（RNA復(fù)制）,轉(zhuǎn)錄（transcription） 指生物體以DNA為模板合成RNA的過程 本質(zhì)：酶促核苷酸聚合反應(yīng) 原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 產(chǎn)物: mRNA、tRNA、rRNA 酶: RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA-pol),轉(zhuǎn)錄,第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄的模板和化學(xué)機(jī)制,轉(zhuǎn)錄模板 DNA雙鏈中的一股鏈 轉(zhuǎn)錄有時(shí)空特異性 結(jié)構(gòu)基因（structural gene）:能轉(zhuǎn)錄出RNA的DNA區(qū)段稱結(jié)構(gòu)基因。

2、,mRNA，tRNA，rRNA,不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄,5 3,3 5,編碼鏈,模板鏈,模板鏈,編碼鏈,不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetric transcription) 轉(zhuǎn)錄是有選擇的，在細(xì)胞不同發(fā)育時(shí)序、按生存條件和需要才轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄的這種選擇性稱不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄。包含兩個(gè)含有： 在DNA雙鏈分子上一股鏈可轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄； 模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一單鏈上。,DNA雙鏈中按堿基配對(duì)規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈(template strand) 。相對(duì)的另一股單鏈?zhǔn)蔷幋a鏈(coding strand) 。,轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系 模板：DNA的模板鏈 原料：NTP（ATP、UTP、CTP、GTP） 酶 ：

3、RNA聚合酶 其他：Mg2+、Mn2+ 其它蛋白因子 化學(xué)機(jī)制,( NMP )n + NTP ( NMP ) n+1 + PPi,RNA,延長(zhǎng)的RNA,小 結(jié),復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的異同點(diǎn),相同點(diǎn)：,酶促核苷酸聚合過程,DNA為模板,依賴DNA的聚合酶,核苷酸間形成磷酸二酯鍵,方向5 3,遵守堿基配對(duì)規(guī)律,小 結(jié),復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的異同點(diǎn),不同點(diǎn)：,第二節(jié) 原核生物轉(zhuǎn)錄酶及啟動(dòng)子,原核生物RNA聚合酶 全稱：依賴DNA的RNA聚合酶（RNA-pol）,全酶 (holoenzyme),轉(zhuǎn)錄起始階段,核心酶 (core enzyme),轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)階段,利福平,Z,原核生物啟動(dòng)序列 操縱子（operon）：原核生物絕

4、大多數(shù)基因按功能相關(guān)性成簇地串聯(lián)、密集于染色體上，共同組成的轉(zhuǎn)錄單位，由啟動(dòng)序列、操縱序列、結(jié)構(gòu)基因及調(diào)節(jié)基因所組成。,I,P,O,Y,A,調(diào)控序列,啟動(dòng)子（promoter）: 是RNA聚合酶結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的特異DNA序列，也是控制轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位。 對(duì)啟動(dòng)子的研究，常采用一種巧妙的方法即RNA聚合酶保護(hù)法,RNA聚合酶保護(hù)法,開始轉(zhuǎn)錄,-10 區(qū),T A T A A T Pu A T A T T A Py,(Pribnow box),-35 區(qū),T T G A C A A A C T G T,RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn) (recognition site),第三節(jié) 原核生物轉(zhuǎn)錄過程,轉(zhuǎn)錄起始,轉(zhuǎn)

5、錄延長(zhǎng),轉(zhuǎn)錄終止,轉(zhuǎn)錄起始,需解決兩個(gè)問題：,RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。 DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。,RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合形成閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(closed transcription complex) :,2. DNA雙鏈局部解開，形成開放轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(open transcription complex) ； 解鏈范圍：小于20bp,3. 在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)（不需引物），形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物：,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi,轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物:,RNApol (2) - DNA

6、 - pppGpN- OH 3,轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng),第一個(gè)磷酸二酯鍵生成后亞基脫落，RNApol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；,2. 在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長(zhǎng)。,(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi,轉(zhuǎn)錄空泡(transcription bubble)：,RNA-pol （核心酶） DNA RNA,原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象,5,3,DNA,核糖體,RNA,RNA聚合酶,這種形狀說明：,在同一DNA模板上，有多個(gè)轉(zhuǎn)錄同時(shí)在進(jìn)行； 轉(zhuǎn)錄尚未完成，翻譯已在進(jìn)行。,轉(zhuǎn)錄終止,轉(zhuǎn)錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

7、RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來。,依賴Rho 因子的轉(zhuǎn)錄終止,非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止,（一）依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止 常見于噬菌體中,因子：,因子是由相同亞基組成的六聚體蛋白質(zhì)，亞基分子量46kD。 因子能結(jié)合RNA，又以對(duì)poly C的結(jié)合力最強(qiáng)。 因子還有ATP酶活性和解螺旋酶的活性。,因子的作用原理：,（二） 非依賴 Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止,DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。,DNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3,5UUGCAGCCUGAC

8、AAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,RNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,近終止區(qū)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)是非依賴因子終止的普遍現(xiàn)象。,莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理：,使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓； 使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。,第四節(jié) 真核生物轉(zhuǎn)錄過程,真核生物RNA聚合酶,RNA聚合酶（RNA Po

9、l）,RNA聚合酶（RNA Pol）,RNA聚合酶（RNA Pol ）,真核生物的RNA聚合酶,真核生物調(diào)控序列 順式作用元件（cis-acting element ）： 指可以影響自身基因表達(dá)活性的DNA序列，分為啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和沉默子。 啟動(dòng)子：指的是RNA-pol結(jié)合位點(diǎn)周圍的一組轉(zhuǎn)錄控制組件，每一組件含7-20bp的DNA序列，至少包括至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)以及一個(gè)以上的功能組件。,TATA盒,GC盒,CAAT盒,TATA盒:是最具典型意義的組件，共有序列為TATAAAA，通常位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-30-25bp,控制轉(zhuǎn)錄起始的準(zhǔn)確性及頻率。由TATA盒和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)即可構(gòu)成最簡(jiǎn)單的啟動(dòng)子。

10、多在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)約-40-100nt的位置，比較常見的是GC盒和CAAT盒 典型啟動(dòng)子由TATA盒及其上游CAAT盒和（或）GC盒組成，通常具一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及較高轉(zhuǎn)錄活性,增強(qiáng)子：是遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、決定基因的時(shí)間和空間特異性表達(dá)、增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，其發(fā)揮作用的方式通常與方向、距離無關(guān)。 沉默子：有的基因含有負(fù)性調(diào)節(jié)元件沉默子，當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子時(shí)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。,順式作用元件(cis-acting element),轉(zhuǎn)錄因子 反式作用因子（trans-acting factors）:能通過與特異的順式作用元件的識(shí)別、結(jié)合，反式激活另一基因的轉(zhuǎn)錄的蛋白。 轉(zhuǎn)錄因子（tran

11、scription factors）：反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的因子。,真核生物參與RNA-pol轉(zhuǎn)錄的TF,轉(zhuǎn)錄過程 轉(zhuǎn)錄起始 RNA聚合酶II與啟動(dòng)子的結(jié)合、啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄需要多種蛋白質(zhì)因子的協(xié)同作用，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物(pre-initiation complex, PIC) 。 轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng) 真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程轉(zhuǎn)錄與翻譯非同步， 可見核小體移位和解聚現(xiàn)象。 轉(zhuǎn)錄終止 真核生物的轉(zhuǎn)錄終止和加尾修飾同時(shí)進(jìn)行,3加尾,-GUGUGUG,5-AAUAAA-,5 -AAUAAA-,AAAAAAA 3 mRNA,核酸酶,轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān),第五節(jié) 真核生物轉(zhuǎn)錄后加工,幾乎所有的

12、初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物都要經(jīng)過加工，才能成為具有功能的成熟的RNA 部位：主要在細(xì)胞核 對(duì)象:,mRNA,tRNA,rRNA,幾種主要的修飾方式：,1. 剪接(splicing),2. 剪切(cleavage),3. 修飾(modification),4. 添加(addition),mRNA前體的加工 （一）真核生物mRNA生成特點(diǎn) 1.單順反子：一個(gè)mRNA分子只編碼一種蛋白 2.斷裂基因（split gene）：真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱斷裂基因。,編碼區(qū) A、B、C、D,外顯子：在

13、斷裂基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列。 內(nèi)含子：隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過程中被除去的核酸序列。 具5-帽子結(jié)構(gòu) 具3-polyA尾結(jié)構(gòu),（二）mRNA加工過程,5加帽,3加尾,剪接,編輯,加帽 5-末端有7-甲基鳥嘌呤的帽結(jié)構(gòu),5 pppGp,加尾 剪接作用：去除初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的內(nèi)含子，把外顯子連接為成熟mRNA的過程。 場(chǎng)所:剪接體 由小分子核糖核蛋白組成，將hnRNA結(jié)合，使內(nèi)含子形成套索并拉近上、下游外顯子。 套索RNA：內(nèi)含子區(qū)段彎曲，使相鄰兩個(gè)外顯子互相靠近而利于剪接。 反應(yīng)：二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng),4. mRNA的編輯(mRNA editing), RNA編輯作用說明，基因的編碼序列經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后加工，是可有多用途分化的，因此也稱為分化加工(differential RNA processing)。,二、rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工,三、tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工,tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶、連接酶,ATP,ADP,堿基修飾,小結(jié)：原核與真核轉(zhuǎn)錄的不同,原核為多順反子，含多個(gè)結(jié)構(gòu)基因 真核為單順反子 原核轉(zhuǎn)錄酶只