酵母表達培養(yǎng)基介紹

1、畢赤酵母表達的培養(yǎng)基配制52.1 LB（LuriaBertani）培養(yǎng)基：Trypton lYeast Extract 0.5NaCl lPH 7.0制作平板時加入 2瓊脂粉。121高壓滅菌 20min?？捎谑覝乇４?。用于培養(yǎng)pPICZA原核宿主菌TOP10F時可加入Zeocin 25ug / ml。2.2 LLB（Low Salt LB）培養(yǎng)基：Trypton lYeast Extract 0.5NaCl 0.5PH 7.0制作平板時加入 2瓊脂粉。121高壓滅菌 20min?？捎谑覝乇４鏀?shù)月。用于培養(yǎng)pPICZA原核宿主菌TOP10F時，加入Zeocin 25ug / ml，可以4條件下保

2、存12周。2.3 YPD （又稱YEPD）Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培養(yǎng)基）Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100 g/ml 液體YPD培養(yǎng)基可常溫保存；瓊脂YPD平板在4可保存幾個月。加入Zeocin 100ug / ml，成為YPDZ培養(yǎng)基，可以4條件下保存12周。2.4 YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose M

3、edium）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol （山梨醇）1 M+agar 2%+ Zeocin 100 g/ml不管是液體 YPDS培養(yǎng)基，還是YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基，都必須存放4條件下，有效期12周。2.5 MGYMinimal Glycerol Medium （最小甘油培養(yǎng)基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。將800ml滅菌水、100ml的 10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混勻即可，4保存，保存期為2個月。2.6 MGYHMinimal Glyc

4、erol Medium + Histidine （最小甘油培養(yǎng)基 + 0.004%組氨酸）在1000ml的MGY培養(yǎng)基中加入 10ml的100*H母液混勻，4保存，保存期為2個月。2.7 RDRegeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培養(yǎng)基）（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）1. 將186g的山梨醇定容至700ml，高壓滅菌；2. 冷卻后于45水??；3. 將100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml無菌水混勻，預熱至45后，與步驟2 的

5、山梨醇溶液混合。4保存。2.8 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培養(yǎng)基 + 0.004%組氨酸）在RD培養(yǎng)基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同時無菌水的體積減少至78ml即可，其余配制方法與RD相同。4保存。2.9 RD及RDH平板的制備1. 將186g的山梨醇和15-20g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌；冷卻后于60水浴；2. 參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）

6、ml無菌水混勻，預熱至45后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；3. 迅速制備平板。4可保存數(shù)月。2.10 RD及RDH 的TOP 瓊脂的制備（常用于酵母菌的包被）1.將186g的山梨醇和 7.510g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌；冷卻后于60水浴；2.參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10*D、 100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml無菌水混勻，預熱至 45后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；3.將該TOP瓊脂置于45水浴冷卻、保溫，備用。2.11 MD與MDHMinimal Dextros

7、e Medium +（Histidine） 最小葡萄糖培養(yǎng)基 +（ 0.004 %組氨酸）（含有：1.34%YNB；4*10-5% 生物素；2%葡萄糖）1. 100ml的10*YNB；2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的無菌水定容至1000ml即可；2. 如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可；3. 如配制平板，可無菌水的滅菌前，加入1520g的瓊脂。4可保存數(shù)月。2.12 SOC培養(yǎng)基：Trypton lYeast Extract 0.5NaCl 0.05Glucose (1mol / L) 2%121高壓滅菌 20min，冷卻后，4保存 2.13

8、MM培養(yǎng)基：M9母液：64g磷酸氫二鈉，15g磷酸二氫鉀，2.5g氯化鈉，5.0g氯化銨加1L水滅菌取M9母液200ml加水700ml,加2ml1mol/l已滅菌的硫酸鎂，加100微升已滅菌的1mol/l氯化鈣（可加可不加）。注意硫酸鎂和M9母液要分開滅菌不然會有沉淀。在M9培養(yǎng)基基礎上添加0.5%葡萄糖即為MM培養(yǎng)基。2.14 BMGY /BMMY培養(yǎng)基：酵母粉：1.0克，蛋白胨：2.0克，YNB：1.34克，0.1mol/L pH6.0(或者pH7.0)磷酸緩沖液，甘油：1.0毫升，加蒸餾水到100mL 2.15 BMM培養(yǎng)基，全稱：Buffered minimal methanol 即最

9、小緩沖甲醇培養(yǎng)基，常用于表達分泌型蛋白的培養(yǎng)基。配制：100mM pH6.0磷酸鉀 1.34%YNB 410-5%生物素 0.5%甲醇1. 滅菌700ml 水，2. 冷至室溫，加入下列：100ml 1M pH6.0磷酸鉀緩沖液, 100ml 10YNB, 2ml 500B, 100ml 10M3. 放置于4 度，可放2 個月 10YNB （13.4%酵母氮源堿（YNB）含硫酸銨不含氨基酸）溶解134gYNB于1000ml水中，過濾除菌，加熱至YNB 完全溶解，存于4 度?；蛘哂?4gYNB（不含硫酸銨不含氨基酸），100g 硫酸銨進行配制，可放1年。注意畢赤酵母在高濃度YNB下生長更好。YPD

10、：最基本的培養(yǎng)用；BMGY：誘導表達前培養(yǎng)用；BMMY：誘導表達用；MD：電轉(zhuǎn)化后篩選his用。YEPD是不能代替BMGY的，因為有葡萄糖，這樣殘留的葡萄糖會影響下一步的誘導表達。不過有一種方法是可行的，就是用YPG培養(yǎng)基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。搖瓶畢竟不能和發(fā)酵罐比，甘油殘余會抑制甲醇利用。BMGY、BMMY滅菌后才能加甲醇、磷酸鉀、生物素。配制BMMY時也沒必要用5%過濾除菌的甲醇，在滅菌后使用前加100%甲醇至你要的濃度。YNB可以高壓滅菌，沒問題的，也可以0.22um過濾處理，天冬氨酸和蘇氨酸要待培養(yǎng)基高壓滅菌后加入；配YPD時可以加入YPD一起

11、滅菌，但時間不能太長，溫度不能太高，一般121-125度12-15分鐘足夠了。若時間過長，溫度過高，可能導致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易產(chǎn)生美拉德反應，這是配制培養(yǎng)基中的禁忌。顏色很深的話，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培養(yǎng)基108度35min高壓滅菌。小量發(fā)酵其實可以把培養(yǎng)基成分中的YNB和生物素去除，培養(yǎng)基價格便宜，操作又方便，可以直接滅菌，效果也很好（效果不比含YNB的差）。如果是用自己配置的培養(yǎng)基，如玉米浸提液、麥芽浸提液、麥麩浸提液等等，可以不用換液，采取添料來維持酵母對培養(yǎng)基的營養(yǎng)需要。用無機鹽進行大規(guī)模發(fā)酵，更省錢。大規(guī)模發(fā)酵時，甲醇的流加速度增

12、加不要太快。另外使用純氧并不昂貴，在武漢買個鋼瓶600元左右，一瓶純氧20元。一個批次100h左右估計34瓶氧氣。關于Tryptone和Peptone的選擇：1）用培養(yǎng)E.coli的Tryptone替代Peptone對有些酵母菌可以,例如一般的表達酵母.但是對有酵母菌些絕對不行.例如做雙雜交的AH109,Y187之類表達酵母，根本就長不好2）Tryptone和Peptone雖然都是營養(yǎng)胨，但營養(yǎng)成分不一樣即使是一般的表達酵母可以在Tryptone生長，生長狀態(tài)也沒有在Peptone中好但tryptone和peptone就是含量上有點不同外，其他沒什么區(qū)別，用peptone的目的不是為了提供氮源

13、，提供氮源的是培養(yǎng)基里面的YNB。3）如果要求不高，一般使用也還湊合盡可能的用Peptone，difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它國產(chǎn)的蛋白胨都可以很正常的培養(yǎng)絕大多數(shù)酵母菌4）用含Peptone的培養(yǎng)基顏色很深，純化表達蛋白時顏色要去掉，所以還要進行麻煩的后續(xù)處理。而改用Tryptone后，培養(yǎng)基顏色變得很淺，和LB（液體）顏色差不多，后續(xù)處理要簡單些。invitrogen說明書說 peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶類水解，加入peptone的目的就是競爭性抑制目的蛋白的水解，因為peptone是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。培養(yǎng)畢赤酵母,書上說BIOTIN儲液是水溶液,

14、但事實上BIOTIN很難溶于水, 可以稍稍水浴加熱一下。配制500BIOTIN stock solution（0.02）有這么3種方案：1）、懶人是將Biotin直接溶在去離子水中，放過夜，基本就能溶；2）、急性子是將溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3）、水浴加熱，溫度不能高于50度。D生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在畢赤酵母代謝過程中，作為多種酶的輔基起作用。天然培養(yǎng)基中一般可以不單獨添加，因為YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度發(fā)酵還是必須要添加的。MD、MM屬于基礎培養(yǎng)基，沒有哪種成分會含有微量生長因子（如生物素）。所以肯定要加的。附：無機培養(yǎng)基配方BSM無機培養(yǎng)基：85% H3PO4 26.7ml/LCaSO4 ?2H2O 0.93g/LK2SO4 18.2g/LMgSO4?2H2O 14.9g/LKOH 4.13g/L甘油 40g/LPMT1 4.0ml/L100%氨水調(diào)pH5.0(1瓶50ml加800ul氨水)或10g/L硫酸銨調(diào)pH5.0，氨水用于上罐調(diào)pH（便宜，方便）。誘導表達前調(diào)pH6.0。pH5.0是為了防止BSM形成磷酸鈣沉淀，pH6.0是表達HSA融合蛋白的最適pH。BSM高壓滅菌后再