臨床檢驗中的發(fā)光免疫分析.ppt

1、由于化學(xué)反應(yīng)（通常是氧化）或生物化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生電子能級處于激發(fā)態(tài)的物質(zhì)，后者通過躍遷釋放能量并產(chǎn)生光子，從而導(dǎo)致的發(fā)光現(xiàn)象。與熒光最大的區(qū)別在于無需激發(fā)光，因此后者也被稱為光致發(fā)光。,發(fā)光（Luminescence）化學(xué)發(fā)光（Chemiluminescence）生物發(fā)光（Bioluminescence）,生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光均屬于冷光，即發(fā)光不是由于發(fā)光體溫度升高所致，因此其反應(yīng)能量絕大部分用于發(fā)光而不是發(fā)熱，發(fā)射波長也與溫度無關(guān)。,發(fā)光測定屬發(fā)射光譜分析，多采用動力/速率法或積分法，無需終止反應(yīng)，也不受朗伯-比爾定律限制； 而酶標(biāo)顯色測定屬吸收光譜分析，多采用終點法，需終止反應(yīng)，并受朗伯-比爾定

2、律限制。,按化學(xué)反應(yīng)類型,化學(xué)發(fā)光的分類,酶促化學(xué)發(fā)光： 辣根過氧化物酶系統(tǒng) 堿性磷酸酶系統(tǒng) 黃嘌呤氧化酶系統(tǒng) 非酶促化學(xué)發(fā)光： 吖啶酯系統(tǒng) 草酸酯系統(tǒng) 三價鐵-魯米諾系統(tǒng),閃光（Flash）:,按發(fā)光持續(xù)時間,發(fā)光時間在數(shù)十分鐘以上，如： HRP-Luminol系統(tǒng) AP-AMPPD系統(tǒng) 黃嘌呤氧化酶系統(tǒng) 無須原位進樣、 以速率法測量。,發(fā)光時間在數(shù)秒內(nèi)，如吖啶酯 以原位進樣(In Situ Injector) 和時間積分法測量,輝光（Glow）:,時間,發(fā)光信號,輝光坪區(qū),速率法測量,原位進樣,積分法測量,閃光尖峰,閃光與輝光及其測量方式的差別,魯米諾及其衍生物的增敏化學(xué)發(fā)光系統(tǒng),商業(yè)化產(chǎn)

3、品中常見的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（一）,AMPPD及其衍生物的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng),+,*,光子(477nm),AP,O,O,OCH3,OPO32-,O-,O,O,OCH3,商業(yè)化產(chǎn)品中常見的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（二）,商業(yè)化產(chǎn)品中常見的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（三）,吖啶酯化學(xué)發(fā)光系統(tǒng),發(fā)光檢測的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線,信號強度（Y）,實際曲線,標(biāo)記物濃度（X）,理論/校正曲線,由于：不同發(fā)光體系和免疫分析模式具有不同的實際信號曲線 因此：科學(xué)準(zhǔn)確的特定校正技術(shù)是衡量設(shè)備和試劑匹配性的關(guān)鍵,發(fā)光信號檢測,光敏二極管、光敏電池、光電偶合器（CCD）,結(jié)構(gòu)簡單、性能穩(wěn)定 但靈敏度低、線性范圍較窄。,主要特點,原理：,光信號,光電轉(zhuǎn)換器件

4、,電壓或電流信號,放大,單光子計數(shù)器是目前高靈敏度 發(fā)光分析儀的核心部件,光電倍增管,高壓,高速放大器,高速比較器,高速分頻器,發(fā)光樣品 產(chǎn)生光子,激發(fā)光陰極 產(chǎn)生光電子,在陽極上形成較強信號,脈沖信號,相對發(fā)光單位 數(shù)字脈沖(RLU),在各打拿極之間得到 能量和數(shù)目的倍增,單光子計數(shù)器的工作特性,光子計數(shù)（Y）,發(fā)光強度（X）,飽和點,理論/校正曲線,實際計數(shù)曲線,由于：單光子計數(shù)是在檢測隨機光子事件 因此：隨光子數(shù)量增多檢測效率持續(xù)下降 所以：準(zhǔn)確的校正技術(shù)是設(shè)備品質(zhì)的關(guān)鍵,模擬（光電流）測量曲線,單光子計數(shù)式發(fā)光檢測儀,計 算 機,打 印 機,發(fā)光儀控制模塊,發(fā)光儀執(zhí)行模塊,控制器,程控

5、高壓,計數(shù)/貯存器,單光子計數(shù)器,樣品運動/定位裝置,程控自動門鎖及檢測裝置,原位注射泵,光生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用范圍,軍事偵測 公安稽查 衛(wèi)生檢疫 藥物篩查 醫(yī)學(xué)診斷 環(huán)境檢測 航天遙感 生命科學(xué) ,已成為現(xiàn)代生物技術(shù)最活躍的領(lǐng)域之一,光生物學(xué)檢測技術(shù)的優(yōu)越性,徹底消除了放射性危害 無半衰期限制，試劑穩(wěn)定性和有效期大大延長 容易實現(xiàn)連續(xù)、動態(tài)、重復(fù)測定,適合于復(fù)合標(biāo)記系統(tǒng)進行多指標(biāo)并行測定 操作簡單，反應(yīng)速度快，容易實現(xiàn)自動化 靈敏度和線性范圍超過以往技術(shù),幾種標(biāo)記/檢測技術(shù)理論極限靈敏度的比較,酶標(biāo),熒光,放免,發(fā)光,靈敏度(mol/L),10-18 10-15 10-12 10-9,幾種標(biāo)記/

6、檢測技術(shù)理論線性范圍的比較,酶標(biāo),熒光,放免,發(fā)光,線性范圍,105 104 103 102,幾種標(biāo)記/檢測試劑的有效期比較,酶標(biāo),熒光,放免,發(fā)光,有效期（月）,18 15 12 9 6 3 0,人民幣,人民幣,三種免疫測定技術(shù)的成本及費用,三種免疫測定技術(shù)的成本及費用,放免,酶標(biāo),發(fā)光,夾心法的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線,信號強度（Y）,線性范圍,待測物濃度（X）,Hook(前滯)效應(yīng),分析靈敏度（最低檢測限）（95%可信度）： S0+2SD在該曲線上所對應(yīng)的濃度值。 功能靈敏度： 測定誤差（變異）20%的最低可檢測濃度。 線性范圍： （分析）功能靈敏度-變異20%的最高檢測濃度 相關(guān)系數(shù)0.99

7、的曲線范圍,競爭法的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線,待測物濃度（ X ）,信號強度（ Y ）,線性范圍,分析靈敏度（最低檢測限）（95%可信度）： S0-2SD在該曲線上所對應(yīng)的濃度值 功能靈敏度： 測定誤差（變異）20%的最低可檢測濃度 線性范圍： （分析）功能靈敏度-變異20%的最高檢測濃度 相關(guān)系數(shù)0.99的曲線范圍,發(fā)光免疫分析技術(shù) 的現(xiàn)狀及應(yīng)注意的問題,商品化光生物學(xué)標(biāo)記檢測技術(shù)性能比較,化學(xué)發(fā)光：Chemiluminescence 時間分辨熒光（也稱時間延遲光致發(fā)光）Time Resolved Fluorescence（Time Delayed Photoluminescence） 標(biāo)記物為稀

8、土元素絡(luò)合物，通常采用解離增強熒光免疫分析（DEFIA） 電化學(xué)發(fā)光（也稱場致發(fā)光）Electrochemiluminescence（Electroluminescence）標(biāo)記物為稀土元素絡(luò)合物,例如：電化學(xué)發(fā)光TSH檢測試劑的分析靈敏度為0.005mIU/L 第四代化學(xué)發(fā)光TSH檢測試劑的分析靈敏度為0.001mIU/L 原因在于抗體的親合力，而不是檢測技術(shù)。,抗體篩選、干擾屏蔽，生產(chǎn)工藝、管理水平和技術(shù)服務(wù)是決定產(chǎn)品性能的關(guān)鍵,某些產(chǎn)品宣稱的靈敏度遠超過免疫反應(yīng)的理論極限10-19mol/L 即：六個待測物分子/ 100ul樣品,就發(fā)光分析而言，制約靈敏度的瓶頸在于抗體親合力和干擾因素，

9、而不是檢測技術(shù)。,所以，片面宣揚檢測技術(shù)靈敏度和線性范圍的強弱，不僅毫無意義，而且也是荒謬的。,商品化發(fā)光免疫分析產(chǎn)品的某些宣傳誤區(qū),C肽,胰 島 素,免疫源性胰島素,胰 島 素,胰島素原,真胰島素,胰島素,針對掩蔽性抗原,抗體選擇胰島素,多抗或無選擇性單抗, 亞 單 位, 亞 單 位, 亞 單 位,普通HCG, 亞 單 位,HCG, 亞 單 位, 亞 單 位,HCG游離亞單位, 亞 單 位,X,抗體選擇HCG (TSH、PRL、LH、FSH類似),多抗或無選擇性單抗,針對掩蔽性抗原, 亞單位特異,亞單位特異, 亞單位特異, 亞單位特異,結(jié)合蛋白,PSA,總PSA,PSA,游離PSA,抗體選擇

10、游離PSA,針對掩蔽性抗原,針對非掩蔽性抗原 與結(jié)合和游離PSA等分子結(jié)合,小分子性激素測定方法的進展,減少 結(jié)合蛋白 類似物 前體 代謝產(chǎn)物 干擾,直接測定法,經(jīng)典方法,消化樣品 萃取有機相 分子篩柱分離各類甾體 測定,血清直接測定 + 高特異性單抗 + 結(jié)合蛋白屏蔽技術(shù),男女性激素和皮質(zhì)激素均來源于共同的前體和合成、代謝途徑，其結(jié)構(gòu)也非常相似；而且普遍與血清中的某些蛋白結(jié)合。 因此，皮質(zhì)功能紊亂、肝腎功能紊亂、某些遺傳缺陷、血清蛋白異常、服用類固醇藥物等均可造成這些激素測定結(jié)果的異常。,游離甲狀腺激素測定方法的進展,常見甲功指標(biāo)：TSH、FT3、FT4、TT3、TT4 對甲亢的診斷價值依次

11、為：TSH=FT3FT4TT3TT4 對甲低的診斷價值依次為：FT4=TSHTT4FT3TT3,但FT3 、 FT4靈敏度要求高，且易受干擾 發(fā)光法提高了靈敏度，使得其臨床應(yīng)用普遍性超過TT4和TT3,兩步法 操作時間長 靈敏度差 準(zhǔn)確性差,類似物法 操作時間短 靈敏度較好 準(zhǔn)確性較好,反向競爭法 （標(biāo)記抗體） 操作時間短 靈敏度更好 準(zhǔn)確性更好,第一代（放免）,第二代,第三代,血清FT3 、 FT4試劑盒的發(fā)展 （消除結(jié)合蛋白對測定的影響）,測定游離激素的參考方法（“金”標(biāo)準(zhǔn)）：平衡透析法（透析液過多可導(dǎo)致測值偏高） 操作復(fù)雜、采樣量大，不適于臨床常規(guī),游離激素測定法的試金石稀釋實驗 以游離

12、T4為例,樣品稀釋20倍以內(nèi)測值無明顯變化 （應(yīng)扣除實驗本身對樣品的稀釋度并注意基質(zhì)效應(yīng),建議用6-8%BSA稀釋）,FT4 + TBG,K,T4TBG,游離 T4,游離結(jié)合蛋白,結(jié)合常數(shù),結(jié)合T4,其中：K=,由于絕大部分T4呈結(jié)合狀態(tài)，因此：T4TBGTT4(總T4); TBG總TBGTT4,故， K,所以，樣品被稀釋N倍后，,T4TBG FT4 TBG,TT4 FT4 (總TBGTT4),(固定常數(shù)，不變),TT4 K(總TBGTT4),TT4/N K (總TBG/NTT4 /N),FT4,=,TT4/N K (總TBGTT4)/N,=,TT4 K(總TBGTT4),相 同,即， FT4

13、,發(fā)光技術(shù) 臨床免疫分析劃時代的進步,以TSH(促甲狀腺素)為例,第一代 TSH檢測試劑盒,普通放免 功能靈敏度1-2mIU/L 基本無法測到正常值 下限以下的血清TSH 對甲亢的診斷意義不大,固相放免 功能靈敏度 0.1-0.2mIU/L 在甲亢的診斷中 開始發(fā)揮作用,第二代 TSH檢測試劑盒,發(fā)光免疫 功能靈敏度 0.01-0.02mIU/L 成為甲亢診斷的 首選指標(biāo)之一,新型發(fā)光免疫 功能靈敏度 0.001-0.002mIU/L 更新了部分臨床概念 改寫了甲功的調(diào)控理論,第三代 TSH檢測試劑盒,第四代 TSH檢測試劑盒,目前商品化發(fā)光免疫分析產(chǎn)品的幾個特點,大多采用全自動工作方式，部分

14、采用微孔板半自動方式 多采用磁性或非磁性微粒包被，以增加表面積，使反應(yīng)時間縮短 使用內(nèi)建標(biāo)準(zhǔn)曲線加校正的辦法產(chǎn)生工作曲線 部分產(chǎn)品采用流動池測定方式(適合于閃光型發(fā)光或電化學(xué)發(fā)光),流動池檢測方式示意圖,檢測器,檢測池,負壓泵,廢液,四通閥,沖洗液,樣品管,計量泵,干燥空氣,原位進樣泵,氧化劑,優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單，運行成本低 缺點：易產(chǎn)生交叉污染，工作效率受限,標(biāo)準(zhǔn)化自動化免疫分析系統(tǒng)對試劑盒的技術(shù)要求,對儀器的要求：結(jié)構(gòu)簡單、運行效率高、故障率低、維護費用少 對試劑盒的相應(yīng)要求：標(biāo)準(zhǔn)化、成套化、簡單化，具體為： 反應(yīng)/洗滌/測定條件一致；操作步驟少且趨于一致 反應(yīng)時間短； 通用成分多、專用成分少

15、 措施 統(tǒng)一標(biāo)記/檢測系統(tǒng) 重新優(yōu)化并統(tǒng)一反應(yīng)/洗滌/測定條件和操作步驟 改變包被模式： 微粒包被：反應(yīng)效率，反應(yīng)時間；散射干擾 、離子干擾 （磁珠） 間接包被：反應(yīng)效率，反應(yīng)時間；散射干擾 、檢測效率 注意內(nèi)源性物質(zhì)干擾?。ㄉ锼?親合素系統(tǒng)） 微粒+間接包被：,間接包被夾心法原理,包被體,待測抗原,間接包被物,標(biāo)記抗體,俘獲抗體,特點：所有試劑盒均采用同一包被物和結(jié)合配體,結(jié)合配體,工作曲線的特點與校正原理,工作曲線四要素 擬合方式：描述曲線基本形狀，取決于實驗?zāi)Ｊ胶蛣┝?效應(yīng)關(guān)系走向。 截距：描述曲線位置，修正依據(jù)為本底信號和系統(tǒng)誤差，修正后導(dǎo)致曲線平移。 斜率：描述曲線俯仰角度，修正依

16、據(jù)為結(jié)合/反應(yīng)/檢測效率。修正后導(dǎo)致曲線旋轉(zhuǎn)。 變形因子：調(diào)整曲線形狀（取決于抗體活性和特異干擾因素變化）,信 號 強 度 （Y）,待測物濃度（X）,基本形狀,平移,旋轉(zhuǎn),變形,常見擬合方式的性質(zhì)及其參數(shù)的含義,X：待測物濃度； Y：信號強度； Y0：零濃度樣品信號強度; N：非特異結(jié)合信號強度（NSB）,漂亮的擬合曲線決不是實驗結(jié)果準(zhǔn)確的唯一保證！ 定值/非定值質(zhì)控血清才是監(jiān)控數(shù)據(jù)可靠性的主要手段?。ㄖ敺雷鞅总浖?使用商品化發(fā)光免疫分析產(chǎn)品 可能遇到的幾個問題,與以往方法（放免等）在檢測指標(biāo)的正常值及臨床意義上的差異。 如：免疫源性胰島素與真胰島素、HCG、性激素等 采用不同的單抗或多抗時

17、檢測結(jié)果也有較大差異。 （單抗特異性好，受干擾小，因此測值低） 不同廠家產(chǎn)品測定結(jié)果之間一致性差（未與國家標(biāo)準(zhǔn)品比對）。 所使用的內(nèi)建標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合校正的方法不盡完善。 部分產(chǎn)品不顯示原始數(shù)據(jù)，無法監(jiān)控其準(zhǔn)確性。,免疫分析結(jié)果的干擾因素,溫度,氧化劑,還原劑,光線,磁場,金屬離子,防腐劑,雜質(zhì),本底物質(zhì),結(jié)合蛋白 （測定小分子）,同一干擾因素對不同檢測方法的不同影響,待測物,包被（結(jié)合）抗體,放免法,免放或發(fā)光法,標(biāo)記抗原,TBG,離心沉降,洗 滌 祛 除,以甲狀腺素結(jié)合蛋白（TBG）干擾競爭法測定T3為例,信號 結(jié)果,信號 結(jié)果,使用商品化發(fā)光免疫分析產(chǎn)品 必須做好的幾個工作,在廠家提供的數(shù)據(jù)

18、基礎(chǔ)上，自行建立正常參考值系統(tǒng)。 明確各個試劑盒的特異性及交叉反應(yīng)情況 如：小分子激素之間，以及與自身前體或代謝物之間的交叉 胰島素與C-肽、胰島素原之間的交叉 FSH、LH、HCG之間的交叉。,充分利用現(xiàn)有國標(biāo)參考品校正結(jié)果（注意防腐劑干擾） （可以從國家藥品生物制品檢定所或臨床檢驗中心得到） 自行建立多點質(zhì)控（2-3點）監(jiān)控每次實驗的準(zhǔn)確性。,盡可能避免干擾因素 采樣：清潔樣品管（防止還原劑干擾）、不使用酶抑制劑、及時送檢 實驗室：恒溫、避免強光和強磁場、嚴(yán)格操作規(guī)程、及時維護、報修,正常值參考的意義及灰色區(qū)域的存在,如果測定結(jié)果處于灰色區(qū)域（約在正常值上下限以內(nèi)20%）內(nèi)，則需要進一步追

19、蹤檢查。,95%或99%,-20%,+20%,自身基礎(chǔ)數(shù)據(jù) 最佳“正常參考值”,對于患者來講，最佳的參考值是自己以往的測定數(shù)據(jù)，即自身對照； 因此積累病人的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)非常重要。 尤其是性激素、生長激素、胰島素等具有周期性分泌或釋放規(guī)律的激素。,時間,FSH,卵泡期 排卵期 黃體期 月經(jīng)期,正常人平均值變化規(guī)律,正常參考值范圍,某一患者變化規(guī)律（無排卵峰）,靈敏度（真陽性率）：對真陽性病例的檢出率，即=檢出陽性病例數(shù)/總受檢陽性病例數(shù) 特異度（真陰性率）：對真陰性病例報陰性的比率， 即=報陰性結(jié)果數(shù)/總受檢正常人數(shù) 若某腫瘤篩查法的指標(biāo)達到理論極限，即靈敏度100%，特異度99%（正常值為99%可信限） 而腫瘤的發(fā)病率多在十萬分之三十以下，因此其應(yīng)用于正常人群體檢時，總陽性病例可能為： 30+（100,000-