免疫組化雙重染色技術(shù).ppt

1、1,第八章. 免疫組化雙重染色技術(shù) (Double staining technology in immunohistochemistry) 用免疫組化方法在同一張組織切片上同時(shí)顯示兩種或兩種以上的抗原, 以發(fā)現(xiàn)其定位, 形態(tài)和功能上的相互關(guān)系. 一. 連續(xù)切片雙重染色法 A. 最簡(jiǎn)單最可靠. 用同樣的免疫組化方法, 在兩張相鄰切片上各顯示一種抗原, 然后比較. 由于每張切片上只進(jìn)行一次染色, 所以不會(huì)互相干擾或出現(xiàn)假性雙標(biāo)記. B. 切片厚度13m. 如果較厚如神經(jīng)組織切片(1020m), 可以采用“鏡像”法, 即相鄰切片翻轉(zhuǎn)后貼在載玻片上, 或利用軟件PS.,2,二. 免疫熒光雙重染色法:

2、 用不同的熒光色素標(biāo)記不同的抗體, 染色后觀察, 相應(yīng)的抗原物質(zhì)顯示不同的顏色. A. 直接法: 1. 一步法: 將FITC (490495520530nm, 黃綠色熒光)和TRITC (550620nm, 紅色熒光)分別標(biāo)記的兩種抗體按一定比例混合, 使每個(gè)抗體均為最適稀釋度, 然后孵育切片. 2. 二步法: 先后依次使用兩種熒光抗體分別孵育切片.,3,3. 觀察: 同一個(gè)視野里. a. 對(duì)每一種熒光標(biāo)記物(綠色或紅色)使用不同的濾色板進(jìn)行觀察和照相, 每張照片顯示一種熒光, 比較兩張照片. b. 兩種熒光重疊照相, 則在一張照片上可發(fā)現(xiàn)分別含不同抗原的細(xì)胞(呈綠色或紅色), 如果兩種抗原存

3、在于同一個(gè)細(xì)胞或結(jié)構(gòu), 則呈現(xiàn)兩種紅綠熒光的混合色, 如黃色.,免疫熒光雙重染色法: FITC綠色, TRITC紅色, 混合色為黃色.,4,B. 間接法: 1. 兩種一抗不標(biāo)記, 但來(lái)自不同種屬的動(dòng)物如兔和豚鼠. 2. 兩種來(lái)源于同種動(dòng)物或不同種動(dòng)物的二抗(如羊抗兔IgG和羊抗豚鼠IgG, 或羊抗,兔IgG和豬抗豚鼠IgG)分別以FITC和TRITC標(biāo)記. 3. 染色程序: a. 先用第一種一抗和相應(yīng)的標(biāo)記二抗依次孵育切片, 顯示第一種抗原; 然后再用第二種一抗和相應(yīng)的標(biāo)記二抗依次孵育切片, 顯示第二種抗原. b. 將兩種一抗混合后孵育切片, 再將兩種標(biāo)記的二抗混合后孵育切片, 最后用熒光顯微

4、鏡觀察.,5,免疫熒光雙重染色法: FITC綠色, TRITC紅色, 混合色為黃色.,6,Y.W Lin. USP26 stained by Alexa Fluor 488 and Myc stained by Alexa Fluor 594 in COS7 cells. Nuclei were stained by Hoechst blue,7,三. 免疫酶雙重染色 A. 單酶法: 1. 原理: a. 用一種酶如 HRP標(biāo)記顯示兩種不同的抗原, 但用不同的電子供體如 DAB和CN呈現(xiàn)不同顏色的反應(yīng)終產(chǎn)物. b. 兩種一抗來(lái)自同種屬動(dòng)物, 兩重染色之間需將第一次染色反應(yīng)中的各級(jí)抗體和酶或各級(jí)抗

5、體, 酶和反應(yīng)產(chǎn)物從組織上洗脫. c. 連續(xù)做兩次染色, 所費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng).,8,抗體, 酶和反應(yīng)產(chǎn)物洗脫,9,2. 染色的最佳條件: 先對(duì)兩種待檢抗原分別染色, 以決定合適的抗體稀釋度和反應(yīng)條件等. 3. 雙重染色的先后次序: a. 先顯示含量較少的抗原. b. 先顯示容易受染色過(guò)程和洗脫過(guò)程影響的組織抗原. c. 先用不太敏感的抗體. d. 先用DAB顯色. 4. 對(duì)照試驗(yàn): a. 單染對(duì)照. b. 在進(jìn)行第二次染色前, 要證明第一次染色的各級(jí)抗體和酶活性被完全除去, 而且洗脫后對(duì)第二個(gè)待檢抗原無(wú)影響.,10,5. 抗體洗脫: a. 酸洗法: pH2.2甘氨酸-HCl緩沖液(可加入適量二甲基甲

6、酰胺, DMF)14小時(shí)使抗原-抗體復(fù)合物解離. b. 氧化法: 2.5% KMnO4: 5% H2SO4: DDH2O=1:4:10260, 1分, 氧化除去抗體, 0.5% Na2S2O5漂白液脫色. 第一次染色用CN顯色, 并注意對(duì)第二種抗原的影響. c. 甲醛蒸氣法: 1升容器+3g多聚甲醛+切片, 置80烤箱14小時(shí), 蒸汽破壞抗體的Ig結(jié)合部位.,第一次用ABC法, 氧化法洗脫抗體. 對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)此為假性雙標(biāo).,11,6. 具體操作步驟: a. 方法1: 第一次染色后, 除去抗體和酶而使有色反應(yīng)終產(chǎn)物留在抗原部位, 再用同樣方法進(jìn)行第二次染色. *. 切片處理, 抑制內(nèi)源性酶及正常

7、血清封閉同前. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2顯色. TBS洗兩次, 每次510分. *. 氧化法洗脫. TBS洗如上. *. 用PAP法完成第二次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2顯色. TBS洗如上. 甘油膠封片.,12,一抗來(lái)自同種動(dòng)物的單酶法免疫酶雙重染色,13,大鼠垂體前葉促性腺激素細(xì)胞(藍(lán)色)和生長(zhǎng)激素細(xì)胞(棕色), 免疫酶(PAP法)雙重染色.,14,b. 方法2: 第一次染色后, 照相記錄結(jié)果并記住照相視野的部位. 用有機(jī)溶劑將反應(yīng)終產(chǎn)物溶解除去, 并將第一次染色形成的抗體復(fù)合物洗脫掉, 然后進(jìn)行第二次染色. 對(duì)同一部位再一次照相, 比較先后照相所得

8、照片. *. 切片處理同上. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2顯色. TBS洗兩次, 每次510分. *. 以TBS封片, 照相(注意隨時(shí)從蓋片邊緣補(bǔ)加TBS, 防止切片干燥). *. 去蓋片, TBS洗, 再用酒精-二甲苯-酒精處理, 除去CN藍(lán)色反應(yīng)產(chǎn)物, DDH2O洗. *. 氧化法洗脫, 然后TBS洗兩次如前. *. PAP法完成第2次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2或CN-H2O2顯色. *. TBS洗同上, 封片. *. 找出第一次照相的部位, 再次照相.,15,大鼠垂體前葉GnRH相關(guān)肽陽(yáng)性細(xì)胞(左, 藍(lán)色)與促性腺激素細(xì)胞(右, 棕色)為同一種細(xì)胞,

9、 免疫酶(PAP法)雙重染色.,16,B. 雙酶法: 1. 原理: a. 用兩種無(wú)關(guān)的酶分別標(biāo)記顯示兩種抗原, 常用的酶為HRP和AKP, 或HRP和葡萄糖氧化酶. b. 兩種一抗來(lái)源于不同種屬的動(dòng)物, 如兔和小鼠, 或同種動(dòng)物(如小鼠)的兩種單克隆抗體, 但其Ig亞類不同, 如IgGl和IgG2a. c. 兩種二抗分別是抗兔IgG和抗小鼠IgG, 或抗小鼠IgGl和抗小鼠IgG2a. 可以來(lái)自同種屬動(dòng)物或不同種屬動(dòng)物, 可以是酶標(biāo)抗體(一個(gè)用HRP, 另一個(gè)用AKP標(biāo)記), 也可以是未標(biāo)記抗體(一個(gè)用兔PAP, 另一個(gè)用小鼠APAAP).,17,c. 可避免抗體殘留而引起的假性雙標(biāo)記, 不需

10、中間洗脫處理. 由于無(wú)交叉反應(yīng), 可將兩重染色的同一層抗體混合同時(shí)使用并先后顯示兩種酶的活性, 在同一張切片上獲得不同顏色的反應(yīng)終產(chǎn)物, 如棕色和藍(lán)色. 如兩種抗原共存于同一個(gè)細(xì)胞, 則出現(xiàn)灰紫色的混合色.,18,2. 染色的最佳條件: 先對(duì)兩種待檢抗原分別染色, 以決定合適的抗體稀釋度和反應(yīng)條件等. 3. 雙重染色的先后次序: 先顯示HRP, 再顯示AKP或葡萄糖氧化酶. 4. 對(duì)照試驗(yàn): a. 單染對(duì)照. b. 必需排除兩套抗體系統(tǒng)之間的交叉反應(yīng). 如第二種羊抗兔IgG二抗可能與第一種小鼠IgG一抗結(jié)合而出現(xiàn)假性雙標(biāo)記, 因此應(yīng)事先做抗體進(jìn)行交叉染色實(shí)驗(yàn).,19,5. 染色步驟: 以先后使

11、用PAP法和APAAP法為例. a. 切片處理, 抑制內(nèi)源性酶及正常血清封閉如前. b. 兩種一抗混合液(各自稀釋度由單染色決定), 室溫30分或4過(guò)夜. TBS洗兩次, 每次510分. c. 兩種二抗混合液(各自稀釋度由單染色決定), 室溫30分. TBS洗同上. d. PAP和APAAP混合液(各自稀釋度由單染色決定), 室溫30分. TBS洗同上. e. 顯示HRP, 如用0.05%DAB-0.01%H2O2, 鏡下控制染色. TBS洗同上. f. 顯示AKP, 如用萘酚AS-MX磷酸鹽加固藍(lán)BB, 鏡下控制染色. TBS洗同上. g. 甘油膠封片.,20,6. 注意事項(xiàng): a. 過(guò)厚切

12、片(7m)可能出現(xiàn)混合色(雙標(biāo)記)的假象. b. APAAP法中緩沖液用TBS而不用PBS, 或至少在顯示酶活性的一步中用TBS. c. 內(nèi)源性AKP一般不會(huì)引起問(wèn)題. d. 正常血清封閉用兩種二抗來(lái)源動(dòng)物的正常血清. 四. 免疫酶-免疫熒光雙重染色法: 首先用免疫酶法顯示第一種抗原, 然后用間接免疫熒光法定位第二種抗原. 若兩個(gè)一抗來(lái)自同一動(dòng)物, 需要注意可能發(fā)生的交叉反應(yīng).,21,五. 免疫酶-免疫金(銀)雙重染色法: A. 免疫酶-免疫金雙重染色法: 1. 用PAP法顯示第一種抗原, 為了加強(qiáng)與膠體金的紅色的對(duì)比, 用CN顯色(藍(lán)色), 如該抗原存在于神經(jīng), 則用DAB顯色. 2. 用酸洗法洗脫第一次染色的抗體復(fù)合物, 繼之用IGS法顯示第二種抗原, 在光鏡下監(jiān)視染色, 直到出現(xiàn)滿意的紅色為止. 3. 用PAP法后再用IGS法, 可防止標(biāo)記在二抗的膠體金顆粒與抗體一起洗脫掉. 金標(biāo)抗體穿透組織能力差, 常需用較大的一抗和金標(biāo)抗體濃度并提高其穿透力.,22,B. 免疫酶-免疫金銀雙重染色法: 1. 用IGSS法顯示第一種抗原, 用5nm小