高效液相色譜分類及工作原理.ppt

1、第三章 高效液相色譜法 High Performance Liquid Chromatography，HPLC,生物材料和生物體液是目前所知道撮復(fù)雜的化學(xué)物質(zhì)的混合物，所含成分在一萬種以上，其分子量從18到幾百萬，而且其中有意義的化學(xué)成分的含量又往往很低，因此，必須要有一種高分辨、高靈敏度的分離鑒定手段，氣相色譜和高壓液相色譜具有以上特點，它們可通過對生物樣品和生物體液樣品的有關(guān)成分的提取、分離、分析定量，進行對疾病的早期快速診斷的研究，病理病因的研究，以及藥物在體內(nèi)代謝的研究等。,高壓液相色譜對于揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分子量大的高分子化合物以及離子型化合物的分離尤為有利。如氨基酸、多肽、蛋白

2、質(zhì)、生物堿、核酸、甾體、類脂、維生素、抗菌素等均可進行分離分析定量。,第一節(jié) 高效液相色譜法概述,一、理論基礎(chǔ)：速率理論,A為渦流擴散項 B/u分子擴散項 Cu項即傳質(zhì)阻力項,二、HPLC技術(shù),采用高壓輸液泵，高效微粒固定相和高靈敏度檢測器。 三、HPLC特點 高壓、高速、高效、高靈敏度、樣品回收方便。,經(jīng)典LC與HPLC比較,與氣相色譜法比較，HPLC的優(yōu)點,分析對象廣 氣相色譜只限于分析氣體和沸點較低的化合物；HPLC不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，適用于高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)。原則上講，幾乎可以分析除永久氣體外所有的有機和無機化合物。,流動相對分離起作用 氣相色譜的流動相僅

3、起運載作用，對組分不產(chǎn)生相互作用力；HPLC的流動相對組分產(chǎn)生相互作用力，相當(dāng)于增加了一個控制和改進分離條件的參數(shù)。,經(jīng)常在室溫條件下操作 氣相色譜法一般在較高溫度下進行 缺點：儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴(yán)格。,第二節(jié) HPLC的主要類型,一、液一液分配色譜法（LLPC） 在液-液色譜中,流動相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。,1分離原理 液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進行的，使這種分配平衡可反復(fù)

4、多次進行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。,2.固定相,液液色譜的固定相由載體和固定液組成。常用的載體有下列幾類： （1）全多孔型載體：由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑約100 m的全多孔型顆粒。 這類固定相由于顆粒很細，孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。,（2）表面多孔型載體（薄殼型微珠載體）：由直徑為30 40m的實心玻璃球和厚度約為1 2 m的多孔性外層所組成。目前，這種載體粒度為5 10 m。,這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達平衡，較適

5、合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。,化學(xué)鍵合固定相：它是將各種不同有機基團通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。 它代替了固定液的機械涂漬，因此它的產(chǎn)生對液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以認為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。 據(jù)統(tǒng)計，約有3/4以上的分離問題是在化學(xué)鍵合固定相上進行的。,3流動相,根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。,正相分配色譜：流動相的極性小于固定相的極性， 它適用于極性化合物的分離。其 流出順序是極性小的先流出，極 性大的后流出。,反相分配色譜：流動相的極性大于固定相的極性， 它適

6、用于非極性化合物的分離， 其流出順序與正相色譜恰好相反,二、液一固吸附色譜法(LSAC),液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進行分離的。,1分離原理,當(dāng)流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當(dāng)試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保留就要取代數(shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇┓钟茫┯谑?，在固定相表面發(fā)生競爭吸附: X + nSad = Xad + nS,達平衡時,有,其中Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強，難于

7、洗脫。Kad值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。Kad值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。,2固定相,液固吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，如線性容量較高，機械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多。 目前最廣泛使用的還是510 m的全多孔型微粒填料。,3.流動相,一般把吸附色譜中流動相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對極性大的試樣往往采用極性強的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。,三、離子交換色譜法（IEC）,此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析

8、方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。,1離子交換原理,離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：,陽離子交換：,陰離子交換：,一般形式： R一AB RBA,達平衡時，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：,式中Ar，Br 分別代表樹脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離

9、子（B）的濃度，A、B則代表它們在溶液中的濃度。 KB/A越大，說明B離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說來，B離子電荷越大，水合離子半徑越小， KB/A值就越大。,2.固定相,（l）多孔型離子交換樹脂 它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為520m，有微孔型和大孔型之分。,（2）薄膜型離子交換樹脂 它是在直徑約對30m的固體惰性核上，凝聚12m厚的樹脂層。,（3）表面多孔型離子交換樹脂 它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂。,（4）離子交換鍵合固定相 它是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載

10、體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點是機械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實現(xiàn)快速分離。,3.流動相,離子交換色譜法所用流動相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強度）的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。,有時也使用有機溶劑如甲醇或乙醇同水緩沖溶液混合使用，以提高特殊的選擇性，并改善樣品的溶解度。,鹽離子的濃度影響：,如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。,要視不同情況而定。例如，分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的pH

11、值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低PH值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。,pH值的影響：,四、離子對色譜法（IPC）,離子對色譜法是分離分析強極性有機酸和有機堿的極好方法。 離子對色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。,由于離子對化合物A-B+具有疏水性，因而被非極性固定相（有機相）提取。組分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對的能力大小不同以及形成的離子對流水性質(zhì)不同，導(dǎo)致各組分離子在固定相中滯留時間不同，

12、因而出峰先后不同。這就是離子對色譜法分離的基本原理。,流動相：加有平衡離子（反離子）的極性 溶液通過改變流動相的pH、平 衡離子的濃度和種類可改變分離 的選擇性。,固定相：非極性的疏水鍵合相,五、離子色譜法（IC）,抑制型：抑制柱型、連續(xù)抑制型 分離柱中離子交換樹脂的交換容量通常在 0.010.05毫摩爾/克干樹脂,非抑制型: 當(dāng)進一步降低分離柱中樹脂的交換容量(0.0070.07毫摩爾/克干樹脂),使用低濃度、低電離度的有機弱酸及弱酸鹽作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測器可直接與分離柱相連，不需抑制柱。,離子色譜裝置類型,離子色譜連續(xù)抑制裝置圖：,通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背

13、景電導(dǎo)的流動相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動相，從而用電導(dǎo)檢測器可直接檢測各種離子的含量。 若樣品為陽離子，用無機酸作流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換劑。當(dāng)試樣經(jīng)陽離子交換劑的分離往后，隨流動相進入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個重要反應(yīng)：,R+OHH+Cl- -R+Cl十H2O R+一OH-M+Cl-M+OHR+Cl-,由反應(yīng)可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動相本底電導(dǎo)的影響。同時，又將樣品陽離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的濃度為Cl-離子的26倍，提高了所測陽離子電導(dǎo)的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機理。,離子色譜的應(yīng)用：,陰離子分析: 雙柱：薄殼型

14、陰離子交換樹脂分離柱(3250mm), 流動相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。 七種陰離子在20分鐘內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在350 ppm。,六、空間排阻色譜法（SEC）,主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。,1.固定相,排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。 所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。,（1）軟性凝膠 如葡

15、聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。,（2）半剛性凝膠 如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。,（3）剛性凝膠 如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作。一般控制壓強小于7MPa，流速1cm3s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。,2流動相,排阻色譜所選用的流動相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠。當(dāng)采用軟性凝膠時，溶劑也必須能溶脹凝膠。 溶劑的粘度要小，因為高粘度溶劑往往限制分子擴散作用而影響分離效果。 常用的流動相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。,3分離原理,空間排阻色譜是按分子大