微生物教程yyd第四章非細(xì)胞微生物.ppt

1、第四章 非細(xì)胞微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu),前言 第一節(jié) 病毒（指真病毒） 第二節(jié) 亞病毒,非細(xì)胞生物就是指的病毒（virus）,從歷史上看人們?cè)缫押筒《居羞^(guò)接觸，在公元前23世紀(jì)我國(guó)及印度既有天花記載，而病毒的發(fā)現(xiàn)是在1890，俄國(guó)植物病理學(xué)家D.Ivanovekg(伊萬(wàn)諾夫斯基)的功績(jī)，當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)了煙草花葉病的病原，可通過(guò)細(xì)菌濾器，認(rèn)為是“細(xì)菌的毒素”或極小的“細(xì)菌”。,1898年由荷蘭學(xué)者M(jìn).W.Beijerinek（貝杰林克）首次提出這種病毒是一種“傳染性的活性液”或稱“病毒”，從此揭開(kāi)了現(xiàn)代病毒學(xué)的歷史。此外各種動(dòng)、植物病毒相繼發(fā)現(xiàn)，電鏡的應(yīng)用促進(jìn)了病毒學(xué)的發(fā)展，1971后人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了各種亞病毒

2、類病毒（1971 Diener） 朊病毒（1982 Prusiner）和擬病毒（Gibbs,1983）人們對(duì)病毒本質(zhì)的認(rèn)識(shí)是一個(gè)循序漸進(jìn)的過(guò)程,非細(xì)胞生物 真病毒：至少含有核酸和蛋白質(zhì)兩種組分 亞病毒 類病毒：只含具有獨(dú)立侵 染性的RNA組分 擬病毒：只含不具有獨(dú)立 侵染性的RNA組分 朊病毒：只含單一蛋白質(zhì) 組分,這里把非細(xì)胞生物分成病毒（真病毒）和亞病毒討論,從所給病毒的定義可以總結(jié)出病毒的特點(diǎn)是非細(xì)胞大分子結(jié)構(gòu)亦由此衍化出無(wú)產(chǎn)能代謝系統(tǒng)，無(wú)核糖體，無(wú)離體生長(zhǎng)，無(wú)二等分裂繁殖，對(duì)一般抗生素不敏感等。專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的生物態(tài)和細(xì)胞外無(wú)生物態(tài)的相互交替只含一種核酸或DNA或RNA。,真病毒的定

3、義：由于亞病毒（特別是朊病毒的存在）難以給病毒下確切的定義，這里給“真”病毒的定義為：病毒是一類超顯微的非細(xì)胞生物，每種病毒只含一種核酸；它們只能在活細(xì)胞內(nèi)營(yíng)專性寄生，靠宿主細(xì)胞代謝系統(tǒng)的協(xié)助來(lái)復(fù)制核酸、合成蛋白質(zhì)等組分，然后再裝配而得以增殖；在離體狀態(tài)它們呈無(wú)生命的大分子狀態(tài)長(zhǎng)期存在，并保持侵染活性。,返回目錄,第一節(jié) 病毒（指真病毒）,病毒的特點(diǎn)： 形體極微小必須用電鏡觀察，一般可通過(guò)細(xì)菌濾器 沒(méi)有細(xì)胞構(gòu)造故稱分子生物 主要成分只有核酸和蛋白質(zhì) 每種病毒只有一種核酸或DNA或RNA 既無(wú)產(chǎn)能系統(tǒng)也無(wú)蛋白質(zhì)合成系統(tǒng) 在宿主細(xì)胞協(xié)助下通過(guò)核酸復(fù)制和核蛋白裝配進(jìn)行增殖無(wú)個(gè)體生長(zhǎng)和二分裂繁殖,活細(xì)

4、胞內(nèi)專性寄生 離體狀態(tài)為無(wú)生命的大分子，并可形成結(jié)晶 對(duì)一般抗生素不敏感，但對(duì)干擾素敏感。 凡有生物處（因是活細(xì)胞內(nèi)寄生物）都應(yīng)有其相應(yīng)的病毒，所以隨著研究的進(jìn)展，病毒的數(shù)量是一個(gè)上升的變量。,一、病毒的形態(tài)構(gòu)造和化學(xué)組分 （一）、病毒的大小,絕大多數(shù)病毒能通過(guò)細(xì)菌濾器，須用電鏡觀察測(cè)其形態(tài)和大小，測(cè)量時(shí)以納米（nm 10-9m）為單位，多數(shù)病毒粒子的D（直徑)在100nm左右，最大的牛痘苗病毒的直徑超過(guò)250nm，染色在光鏡下可見(jiàn)。最小的病毒菜豆畸矮病毒只有911nm，比血清白蛋白分子還小（詳見(jiàn)書(shū)64頁(yè)）。,（二）形態(tài),1.典型病毒粒子的構(gòu)造：病毒也稱病毒粒子（virion即病毒體），也叫病

5、毒顆粒（virus）是指成熟結(jié)構(gòu)完整的單個(gè)病毒，主要成分是核酸和蛋白質(zhì)。核酸位于病毒粒子的中心，構(gòu)成核子（core）或基因組（genome）；蛋白質(zhì)包圍在核心周圍，構(gòu)成病毒粒子的衣殼（capsid）。衣殼是病毒粒子的主要支架結(jié)構(gòu)和Ag成分，對(duì)核酸有保護(hù)作用。,衣殼由許多電鏡下可見(jiàn)的形態(tài)單位-衣殼粒（capsomere或capsomer）所構(gòu)成，核心與衣殼合在一起稱核衣殼，它是（真）病毒必須具備的基本結(jié)構(gòu)。有些復(fù)雜的病毒核衣殼外還圍一層由脂類和蛋白組成的包膜。有時(shí)包膜上長(zhǎng)有刺突（spike）等附屬物，其包膜來(lái)自于宿主細(xì)胞膜并被病毒改造成具有獨(dú)特抗原特性的膜狀結(jié)構(gòu)，可被乙醚等有機(jī)溶劑所破壞。,病毒

6、體結(jié)構(gòu)模式圖,殼粒,衣殼,核心（核樣物）,核衣殼,包膜,包膜病毒,包膜子粒,2.病毒粒子的對(duì)稱體制,病毒由相同的蛋白質(zhì)亞基衣殼粒裝配而成的病毒粒子，通常只有形成螺旋對(duì)稱和二十面體對(duì)稱（等軸對(duì)稱）的兩種體制，前者能使核酸與蛋白質(zhì)亞基間的接觸更為緊密，后者則特別有利于核酸分子的高度卷曲的形式包裹在小體積的衣殼中，也有些以螺旋對(duì)稱和二十面體對(duì)稱的相結(jié)合稱之為復(fù)合對(duì)稱。,螺旋對(duì)稱 無(wú)包膜 桿狀：煙草花葉病毒（TMV） 等對(duì)稱體制 絲狀：大腸桿菌的f1,fd,M13噬 菌體等 有包膜卷曲狀：正粘病毒（流感病毒） 等 彈狀：狂犬病毒，水泡性口膜 炎病毒等 二十面體對(duì)稱 無(wú)包膜 小型：脊髓灰質(zhì)病毒，噬菌 體

7、等 大型：腺病毒等 有包膜：皰疹病毒等 復(fù)合對(duì)稱 無(wú)包膜：大腸桿菌的偶數(shù)噬菌體 （蝌蚪狀）等 有包膜：痘病毒（磚塊狀）,3.病毒的群體形態(tài) （1）包涵體,在某些感染病毒的宿主細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)光學(xué)顯微鏡可見(jiàn)的大小形態(tài)數(shù)量不等的小體叫包涵體。多數(shù)位于胞質(zhì)內(nèi)噬酸性；少數(shù)位于胞核噬堿性，或質(zhì)、核中均有之。依包涵體的特點(diǎn)可將它們分成四種類型：,病毒的聚集體 大多數(shù)由動(dòng)物病毒引起的包涵體是病毒的合成部位。 是病毒蛋白和與病毒感染有關(guān)的蛋白質(zhì)構(gòu)成的 非病毒性包涵體：某些化學(xué)因子甚至由于細(xì)菌感染也可形成的不屬于病毒的群體形態(tài)。 包涵體在實(shí)際的應(yīng)用中有兩方面：一是診斷鑒定病毒?。欢怯糜谏锓乐稳缋ハx(chóng)的核型多角體病毒

8、和質(zhì)型多角體病毒。,（2）噬菌斑,將少量噬菌體與大量敏感菌混合然后加入約45的瓊脂中，制平板經(jīng)培養(yǎng)后平板表面長(zhǎng)滿菌苔的背景上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的透明不長(zhǎng)菌的圓斑，這即為噬菌斑。一般是由一個(gè)噬菌體侵染一個(gè)細(xì)菌后增殖后釋放出大量子群代噬菌體，再感染周圍細(xì)菌細(xì)胞，又增殖裂解，多次反復(fù)的結(jié)果，噬菌斑只是聚“負(fù)菌落”。噬菌斑的形成可用于檢出、分離（純化）和計(jì)數(shù)噬菌體。,（3）空斑和病斑,在噬菌斑的啟發(fā)下發(fā)明了單層動(dòng)物細(xì)胞上的空斑計(jì)數(shù)法，在覆蓋一薄層瓊脂的單層細(xì)胞上，如果一細(xì)胞感染有病毒，增殖的病毒只能再擴(kuò)散到鄰近細(xì)胞，最終成為類似噬菌斑的空斑，如用中性紅等活性染料染色，既可區(qū)分死、活細(xì)胞，而且使空斑更清晰。若

9、單層細(xì)胞受致腫瘤病毒感染，細(xì)胞會(huì)劇增，這種類似于菌落的病灶就只能稱為病斑了。,（4）枯斑,是植物葉片上的植物病毒群體，即病毒使植物細(xì)胞產(chǎn)生的壞死灶。,（三）三類典型形態(tài)的病毒 1.螺旋對(duì)稱的代表煙草花葉病毒（TMV）,為桿狀長(zhǎng)300nm，寬15nm，中空（內(nèi)徑4nm）含95%的蛋白質(zhì)和5%單鏈RNA（ssRNA），有2130個(gè)皮鞋狀的衣殼粒，每個(gè)衣殼粒由158個(gè)氨基酸組成，分子量17500。衣殼粒以逆時(shí)針?lè)较蚵菪帕泄?30圈（每圈長(zhǎng)2.3nm，有16.33個(gè)殼粒），ssRNA含6390個(gè)核苷酸，分子量2106，距中心軸4nm以相等的螺距盤繞于蛋白質(zhì)的外殼內(nèi)，每三個(gè)核苷酸和一個(gè)衣殼粒結(jié)合，每周

10、49個(gè)核苷酸。,2.二十面體對(duì)稱的代表腺病毒,為動(dòng)物病毒其外形呈典型的二十面體，呈球狀，無(wú)包膜，直徑7080nm有12個(gè)角，20個(gè)面，30條邊，衣殼由252個(gè)殼粒組成，內(nèi)有稱五鄰體的殼粒12個(gè)分布12個(gè)頂角；還有稱六鄰體的衣殼粒240個(gè)分布在20個(gè)面上，每個(gè)五鄰體上突出一根末端帶有頂球的蛋白纖維稱刺突。其核心是線狀雙股DNA（dsDNA）。所有腺病毒（不分宿主和血清型）基因組均為36500個(gè)核酸對(duì)。,3復(fù)合對(duì)稱的代表T偶數(shù)噬菌體,Ecoli的T偶數(shù)噬菌體共有三種即T2、T4和T6，分布較廣的T4了解最清.T4(圖)由頭部、頸部和尾部三部分組成，頭部為二十面體對(duì)稱，尾部為螺旋對(duì)稱，故稱復(fù)合對(duì)稱。

11、頭部的二十面體共有212個(gè)衣殼粒，核心為線狀dsDNA。頭與尾間有頸環(huán)和頸須結(jié)構(gòu)。頸環(huán)均為六角形盤狀，6根頸須自頸環(huán)發(fā)出，其功能是裹住吸附前的尾絲，尾部由尾鞘、尾管、基板、刺突和尾絲五部分構(gòu)成。尾鞘是由殼粒纏繞24環(huán)的螺旋。尾管中央有孔道，是頭部核酸注入宿主細(xì)胞的必經(jīng)之道。尾管也由24環(huán)螺旋組成，恰好與尾鞘對(duì)應(yīng)，尾部的基板與頸環(huán)一樣為六角、盤狀、中空，尾絲較長(zhǎng)折為等長(zhǎng)的兩段，它能吸附在宿主細(xì)胞的專一性受體上。,（四）病毒的核酸,病毒的核酸種類很多，是分類的分子基礎(chǔ)，病毒的核酸類型可以從以下幾點(diǎn)來(lái)區(qū)分：是DNA還是RNA是單鏈結(jié)構(gòu)（ss single strand）還是雙鏈（ds double

12、strand）是線狀還是環(huán)狀是閉環(huán)還是缺口環(huán)基因組是單組分、雙組分、三組分還是多組分。此外還可對(duì)核酸進(jìn)行更細(xì)致的分析比較，見(jiàn)表。,總的來(lái)說(shuō)動(dòng)物病毒以線狀dsDNA和ssRNA為多，植物病毒以ssRNA為主，噬菌體以線狀dsDNA居多，至今發(fā)現(xiàn)的真菌病毒均為dsRNA，藻類病毒則都是dsDNA。,二 各類（噬菌體）病毒及其繁殖方式,（一）原核生物的病毒噬菌體 1.一般介紹 噬菌體（bacteriophage,phage）,至今絕大多數(shù)微生物都發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的噬菌體，據(jù)Bradley(1967)歸納，噬菌體共有六類形態(tài).,2噬菌體的繁殖,一般可分為吸附侵入增殖（復(fù)制與生物合成）成熟（裝配）裂解（釋放）五

13、個(gè)階段。凡在短期內(nèi)能連續(xù)完成這五個(gè)階段而實(shí)現(xiàn)繁殖的噬菌體稱為烈性噬菌體。反之稱為溫和噬菌體。裂性噬菌體所經(jīng)歷的繁殖過(guò)程稱為裂解性生活周期或增殖性生活周期，現(xiàn)以T偶數(shù)噬菌體為代表介紹這五個(gè)階段,（1）吸附（adsorption）當(dāng)噬菌體與宿主細(xì)胞在溶液中相遇，若尾絲尖端與宿主表面的特異受體接觸，即可觸發(fā)頸須把彎曲的尾絲散開(kāi)，附著在受體上，使尾刺、尾板固著在細(xì)胞表面，每個(gè)細(xì)菌表面約有300個(gè)吸附位點(diǎn)，不同的噬菌體吸附位點(diǎn)不同。,影響吸附的因素： 噬菌體量，宿主細(xì)胞表面特異受體的數(shù)量決定了吸附噬菌體的數(shù)量，每一敏感細(xì)胞所能吸附相應(yīng)噬菌體的數(shù)量稱感染復(fù)數(shù)（m.o.i,multiplicity of i

14、nfection）,感染復(fù)數(shù)一般很大，可達(dá)250360。當(dāng)大量噬菌體同時(shí)吸附一個(gè)敏感細(xì)胞，由于噬菌體尾管口都帶有少量的溶菌酶可使宿主細(xì)胞表面頓時(shí)出現(xiàn)“千瘡百孔”而裂解，這種由超m.o.i的外源噬菌體吸附引起的不能產(chǎn)生子代噬菌體的裂解叫自外裂解（lysisfrom without）,陽(yáng)離子：Ca2+,Mg2+和Ba2+促進(jìn)吸附；Al3+、Fe3+和Cr3+不利于吸附。 輔助因子，如色氨酸，生物素可促進(jìn)吸附 PH：中性有利于吸附，在小于5和大于10時(shí)則不利 溫度：最適生長(zhǎng)溫度有利于吸附。,（2）侵入（penetration）,吸附后，尾板從尾絲中獲得一個(gè)構(gòu)型刺激，尾鞘的亞基發(fā)生復(fù)雜移位，縮成原長(zhǎng)的

15、一半將尾管推出并插入細(xì)胞壁及膜中，接著頭部核酸通過(guò)尾管注入宿主細(xì)胞將蛋白衣殼留在細(xì)胞壁外，這一時(shí)間很短，合適溫度T4只需15s。若有兩種以上噬菌體同時(shí)侵入一個(gè)細(xì)胞，最后只有一種得以增殖。且不影響其子代的數(shù)量。這稱相互排斥；反之被排斥的噬菌體能使增殖的噬菌體的釋放量減少，則稱為抑制作用。,（3）增殖（replication）,增殖包括核酸的復(fù)制和蛋白質(zhì)的生物合成。首先噬菌體以其核酸中的遺傳信息對(duì)宿主細(xì)胞發(fā)出指令并提供“藍(lán)圖”，使宿主的代謝途徑轉(zhuǎn)向合成噬菌體的“組分”和“部件”，其“原料”可通過(guò)宿主原有核酸等的降解，代謝庫(kù)內(nèi)的儲(chǔ)存物或從環(huán)境中攝取，大批的“部件”合成后，則在細(xì)胞“工廠”里突擊裝配，

16、于是產(chǎn)生了一大群大小相等，成熟的子代噬菌體粒子。,烈性噬菌體的增殖以其核酸類型分三類按早期、次早期、晚期基因的順序轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和復(fù)制的dsDNA噬菌體方式。 按滾環(huán)模型復(fù)制ssDNA的二十面體噬菌體（x174）和絲狀噬菌體（f1）的方式 按“花朵”復(fù)制A蛋白（成熟蛋白），衣殼蛋白和復(fù)制酶蛋白的（復(fù)制RNA用）的方式，以第一種方式講解。,當(dāng)噬菌體的dsDNA侵入細(xì)胞，先用宿主原有的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄噬菌體早期的mRNAmRNA再轉(zhuǎn)譯成噬菌體的早期蛋白這種現(xiàn)象又稱早期轉(zhuǎn)錄，其中早期蛋白種類很多，最關(guān)鍵的是一種只能轉(zhuǎn)錄噬菌體次早期mRNA聚合酶。而T4等的早期蛋白則稱更改蛋白，特點(diǎn)是無(wú)RNA聚合酶的能力

17、，但能與原細(xì)胞中的RNA聚合酶結(jié)合，改變后者，使之只能轉(zhuǎn)錄噬菌體的次早期基因，至此噬菌體已能大量合成自己所需的mRNA了。,利用早期蛋白中新合成的或更改后的RNA聚合酶來(lái)轉(zhuǎn)錄噬菌體的次早期基因，借以產(chǎn)生次早期mRNA的過(guò)程稱次早期轉(zhuǎn)錄其mRNA稱次早期mRNA進(jìn)一步的轉(zhuǎn)譯稱次早期轉(zhuǎn)譯 結(jié)果是產(chǎn)生多種次早期蛋白，有分解寄主細(xì)胞DNA的DNA酶，復(fù)制噬菌體DNA的DNA聚合酶，HMC（5-羥基胞嘧啶）合成酶，以及供晚期基因轉(zhuǎn)錄用的晚期mRNA聚合酶。 晚期轉(zhuǎn)錄是指在新的噬菌體DNA復(fù)制完成后對(duì)晚期基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄作用結(jié)果產(chǎn)生晚期mRNA，再經(jīng)晚期轉(zhuǎn)譯就產(chǎn)生一大批可用于子代噬菌體裝酶用的部分-晚期蛋白，

18、即頭部蛋白，尾部蛋白，各種裝配蛋白（約30種）和溶菌酶等，至此核 酸復(fù)制和各種蛋白質(zhì)的生物合成就完工了。,各種核酸型病毒的復(fù)制，關(guān)鍵是新代V的生物學(xué)特性遺傳給子代V，即在不同類型的核酸中將遺傳信息轉(zhuǎn)移到V的mRNA中，Baltimore1971將其分六類。,DNA病毒雙鏈DNA的復(fù)制：復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯均按“中心法則”。DNA可作復(fù)制的模板，以半保留復(fù)制方式復(fù)制出子代DNA，又可轉(zhuǎn)譯成成熟V所需的衣殼蛋白。 +DNA病毒ssDNA的復(fù)制，所有ssDNA病毒的核酸均為+DNA，先由+DNA合成DNA，在以-DNA為模板合成mRNA,RNA雙鏈RNA病毒的復(fù)制 以半保留方式復(fù)制利用其中“-”鏈產(chǎn)生“

19、+”RNA即mRNA，它可轉(zhuǎn)譯出蛋白又可為模板復(fù)制出子代dsRNA。 +RNA侵染性單鏈RNA病毒的復(fù)制，侵染性ssRNA指由病毒粒子中分離出來(lái)的RNA便有侵染性。這種侵染性的RNA即可做mRNA以轉(zhuǎn)譯成蛋白，又可做模板復(fù)制成“-”RNA，再以此鏈作模板來(lái)合成子代“+”RNA。 -RNA非侵染性ssRNA的病毒的復(fù)制：其RNA無(wú)侵染性，也不能起信使作用，稱負(fù)鏈RNA（-RNA），當(dāng)病毒粒子有轉(zhuǎn)錄酶時(shí)-RNA可用做轉(zhuǎn)錄“+”RNA（mRNA）的模板，并轉(zhuǎn)譯幾種蛋白質(zhì)，其中有一種RNA復(fù)制酶，在該酶催化下合成與“-”RNA等長(zhǎng)的“+”RNA再以此為模板合成子代病毒的“-”RNA。,逆轉(zhuǎn)錄病毒單鏈R

20、NA的復(fù)制 特點(diǎn)：逆轉(zhuǎn)錄病毒ssRNA在復(fù)制時(shí)會(huì)形成RNADNA雜交分子和雙鏈DNA兩種中間體。RNADNA雜交分子是由病毒粒子所含有的一種反轉(zhuǎn)錄酶依賴RNA的DNA聚合酶催化合成的，所合成的DNA鏈又在一種依賴DNA聚合酶作用下再合成dsDNA。此DNA具有侵染性，就整合到寄主細(xì)胞的DNA上，以它為模板合成子代單鏈RNA，其子代RNA和親代RNA均可作為mRNA合成各種蛋白質(zhì)（既糖蛋白、內(nèi)部蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)化蛋白等)。這種轉(zhuǎn)化蛋白在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候能將寄主細(xì)胞轉(zhuǎn)化成各種腫瘤細(xì)胞。,（）成熟（裝配）,噬菌體的成熟（maturity）過(guò)程實(shí)際是已合成的各種部件的裝配（assembly）過(guò)程。主要步驟

21、：DNA分子縮合衣殼包裹形成頭部尾絲和尾部的其它部件獨(dú)立裝配完成頭部與尾部相結(jié)合最后裝上尾絲，形成一個(gè)大小相等成熟的噬菌體粒子。,（）裂解（釋放）,大量子代噬菌體已成熟后，由于水解細(xì)胞膜的脂肪酶和水解細(xì)胞壁的溶菌酶作用，從細(xì)胞內(nèi)部促進(jìn)了細(xì)胞的裂解，從而實(shí)現(xiàn)了噬菌體的釋放，E.coli T系噬菌體就是這樣，另外一些纖維狀的噬菌體如E.colifr、fd和M13等其衣殼蛋白合成后沉積于細(xì)胞膜，當(dāng)噬菌體外出穿過(guò)膜時(shí)才與衣殼蛋白結(jié)合，這種情況不破壞細(xì)胞壁，宿主細(xì)胞仍繼續(xù)存活生長(zhǎng)。,上述增殖性生活周期是較短的如E.coli系在適宜溫度下只需分鐘。每個(gè)宿主細(xì)胞裂解后產(chǎn)生子代噬菌體的量稱裂解量（burst

22、size），不同的噬菌體裂解量不同，例如T2為左右（），T4約，而f2高達(dá)。,.噬菌體效價(jià)的測(cè)定,利用其在敏感菌的菌苔可以形成噬菌斑的數(shù)目即可以測(cè)定效價(jià)(數(shù))。效價(jià)（titre,titer）在此定義為：每毫升試樣中所含有侵染性噬菌體粒子數(shù)，也稱噬菌斑形成單位（pfu,plaqueforming unit）或感染中心數(shù)（infective centre），另外，依噬菌斑的形狀，大小，邊緣和透明度可以進(jìn)行鑒定噬菌體，或進(jìn)行分離。,（1）斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)法,這是一種半定量的預(yù)實(shí)驗(yàn)方法，先將敏感的宿主菌濃懸液涂布于合適的培養(yǎng)基平板上，倒扣在45溫箱以除表面水膜，再將不同稀釋度的試樣用接種環(huán)點(diǎn)種在平板上，保溫?cái)?shù)

23、小時(shí)，依點(diǎn)種處是否有噬菌斑以初步判斷試樣的效價(jià)。,（2）液體稀釋管法,先將不同稀釋度的試樣培養(yǎng)液加入各試管，再將各管接入對(duì)數(shù)期的宿主細(xì)胞以不長(zhǎng)菌的最高稀釋管計(jì)算效價(jià)。,（3）雙層平板法,較廣被用的精確效價(jià)測(cè)定方法：方法預(yù)先分別配2%和1%瓊脂的底層和上層培養(yǎng)基。前者取78ml平皿澆層，再在后者取3ml（須融化并冷卻到約45）中加入較濃的對(duì)數(shù)期敏感菌（0.2ml）和一定體積（0.1ml）的待測(cè)并稀釋的試樣充分混勻倒上層鋪平待凝保溫10小時(shí)，可進(jìn)行噬菌斑計(jì)算。,該法優(yōu)點(diǎn)： 有底層培養(yǎng)基彌補(bǔ)了平皿不平的缺點(diǎn)全部噬菌斑都處于同一平面無(wú)重疊，大小相近邊緣清晰。 上層培養(yǎng)基中瓊脂量少使噬菌斑較大，易于計(jì)數(shù)

24、。,（4）單層平板法,無(wú)雙層平板法的底層培養(yǎng)基，所用培養(yǎng)基的濃度和加量均比雙層法的上層培養(yǎng)基為高和多，該法雖較簡(jiǎn)便但效果較差。,（5）玻片快速法,將噬菌體及敏感宿主細(xì)胞與適量的瓊脂培養(yǎng)基（含0.50.8%瓊脂，先融化）充分混合，涂布無(wú)菌載玻片上，短期培養(yǎng)后在低倍顯微鏡或擴(kuò)大鏡下既可計(jì)算，如金葡球菌僅2.54小時(shí)即可，精確度較差。,4 .一步生長(zhǎng)曲線（onestep growth curve ）,定量描述烈性噬菌體生長(zhǎng)規(guī)律的實(shí)驗(yàn) 曲線稱一步生長(zhǎng)曲線或一級(jí)生長(zhǎng)曲線，它可反映噬菌體的三個(gè)最重要特性參數(shù)潛伏期、裂解期和裂解量。 T4噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線,（1）潛伏期,指噬菌體的核酸侵入宿主細(xì)胞后至第一

25、個(gè)噬菌體粒子裝配并釋放前的一段時(shí)間，潛伏期中無(wú)一個(gè)成熟的噬菌體粒子自細(xì)胞中釋放。該期分兩段： 隱晦期，指在潛伏期前期人為（用氯仿）裂解細(xì)胞裂解液仍無(wú)侵染性的一段時(shí)間。 胞內(nèi)累積期也叫潛伏后期，在隱晦期后如人為的裂解細(xì)胞其裂解液出現(xiàn)侵染性的一段時(shí)間，在電鏡下可觀察到已初步裝配好的噬菌體粒子。,（2）裂解期,為在潛伏期后，宿主細(xì)胞迅速裂解，溶液中噬菌體粒子急劇增多的一段時(shí)間。因噬菌體或病毒無(wú)生長(zhǎng)及宿主細(xì)胞裂解的突發(fā)性，因此理論上的裂解期應(yīng)是瞬間的，但實(shí)際細(xì)菌菌體中個(gè)別細(xì)胞的裂解不可能是同步的，故實(shí)際的裂解期是較長(zhǎng)的。,（3）平穩(wěn)期,指感染的宿主細(xì)胞已全部裂解，溶液中噬菌體效價(jià)達(dá)到最高點(diǎn)之后的時(shí)期。

26、 一步生長(zhǎng)曲線ellis和Delbriick于1939年設(shè)計(jì)，其操作是：用噬菌體的稀釋懸液去感染高濃度的宿主細(xì)胞，以保證每個(gè)細(xì)胞至多不超過(guò)一個(gè)噬菌體吸附，數(shù)分鐘吸附后，混合液中加入一定量的該噬菌體抗血清以中和未吸附的噬菌體。然后用保溫的培養(yǎng)液來(lái)稀釋此混合液，同時(shí)終止血清的作用，隨即置該菌的適宜生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)，在一定時(shí)間內(nèi)，每隔數(shù)分鐘從混合液中取出一份試樣，并作效價(jià)測(cè)定即得此曲線。,5溶原性：兩個(gè)概念（lysogeny） （1）溫和噬菌體,噬菌體侵入細(xì)胞后其DNA只整合在宿主的染色體組上，并隨之繁殖而同步復(fù)制，一般情況不增殖和引起宿主細(xì)胞裂解的噬菌體稱temperate phage或溶原噬菌體（

27、lysogenie phage）.裂性噬菌體的裂解性生活周期與溫和噬菌體的溶原性生活周期關(guān)系,溫和噬菌體的特點(diǎn),核酸類型均為dsDNA 具有整合能力，其核酸與敏感宿主細(xì)胞的核基因組整合，整合態(tài)的噬菌體稱作前噬菌體（prophage） 具有同步復(fù)制能力，復(fù)制后平均分布到二個(gè)子代細(xì)胞中代謝相傳。,因此溫和噬菌體有三種存在形式： 游離態(tài)：成熟后釋放的具侵染性的游離噬菌體粒子 整合態(tài)：即整合在宿主染色體上的前噬菌體狀態(tài) 營(yíng)養(yǎng)態(tài)：前噬菌體經(jīng)外界理化因子誘導(dǎo)后，脫離宿主基因組進(jìn)行復(fù)制、裝配的狀態(tài)。,（2）溶原菌（lysogen或lysogenic bacteria）,指在染色體組上整合有前噬菌體并正常生長(zhǎng)

28、繁殖而不被裂解的細(xì)菌（或其它微生物），溶原菌有以下幾個(gè)顯著特性： 自發(fā)裂解（spontoneous lysis）溶原菌在分裂時(shí)有10-210-5細(xì)胞會(huì)發(fā)生自發(fā)裂解，原因系少數(shù)整合狀態(tài)的前噬菌體轉(zhuǎn)變?yōu)闋I(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的裂解性噬菌體。 誘導(dǎo) 是溶原菌在外界理化因子作用下發(fā)生的高頻裂解現(xiàn)象。紫外線、x射線某些DNA合成抑制絲裂霉素、氮芥等都有誘導(dǎo)作用。,免疫性（immunity）任何溶源菌對(duì)已感染的噬菌體以外的其他噬菌體即超感染噬菌體（不管是溫和的還是烈性的）都具有抵抗能力的性質(zhì)，也稱為超感染免疫性，前噬菌體免疫性或溶源性免疫性。 復(fù)愈，在溶源性細(xì)菌的增殖過(guò)程中有10-5的個(gè)體丟失前噬菌體，而成為非溶源性細(xì)

29、菌，這一過(guò)程叫做復(fù)愈或非溶源化，復(fù)愈的細(xì)胞其免疫性也隨之消失。 溶源轉(zhuǎn)變（lysogenic conversion）少數(shù)溶源菌由于整合了溫和噬菌體的前噬菌體而使自己產(chǎn)生了除了免疫性以外的表型現(xiàn)象。,溶原化與裂解循環(huán),檢驗(yàn)溶源菌的方法,是將少數(shù)溶源菌與大量敏感性指示菌（遇溶源菌裂解后所釋放的溫和噬菌體會(huì)發(fā)生裂解性生活周期者）相混合，然后加至瓊脂培養(yǎng)基中倒一平板，過(guò)一段后溶源菌長(zhǎng)成菌落。由于在溶源菌分裂過(guò)程中有極少數(shù)個(gè)體發(fā)生自發(fā)裂解，釋放的噬菌體會(huì)不斷的浸染溶源菌落周圍的菌苔（指示菌的），形成一個(gè)中央有溶源菌菌落，周圍有透明環(huán)的特殊的噬菌斑。,（二）、植物病毒,植物病毒大部分屬于ssRNA，基本形

30、態(tài)有桿狀、絲狀和等軸對(duì)稱的近球狀二十面體，一般沒(méi)有包膜，少數(shù)種有。植物病毒雖為嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生，但專一性不強(qiáng)，一種病毒可在不同種、屬甚至不同科的植物上寄生。1983年人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)植物病毒600余種，其增殖過(guò)程基本與噬菌體相似，細(xì)節(jié)有別。,（三）、脊椎動(dòng)物病毒,脊椎動(dòng)物病毒主要寄生在人類及其它脊椎動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)，占人類80%的傳染病是由其引起的，估計(jì)15%的惡性腫瘤也是有病毒引起的。另外家畜、禽及野生動(dòng)物，經(jīng)濟(jì)動(dòng)物也有很多的病毒性傳染病。其增殖過(guò)程基本與噬菌體及植物病毒相類似，只在一些細(xì)節(jié)上有所不同。步驟為吸附侵入脫殼復(fù)制和增殖裝配成熟和釋放等。,（四）、昆蟲(chóng)病毒,昆蟲(chóng)病毒的研究和開(kāi)發(fā)起步較晚，但

31、進(jìn)展很快，1990年報(bào)導(dǎo)有1671種。我國(guó)有190余種。它們80%以上是農(nóng)、林業(yè)常見(jiàn)鱗翅目害蟲(chóng)的病原體。 大多數(shù)病毒可在宿主細(xì)胞內(nèi)形成包涵體，并在顯微鏡下呈多角狀，因此稱為多角體。多角體的特點(diǎn)： 外形為多角多面體。 大小一般在0.5-10m,多數(shù)3m 成份系堿溶性結(jié)晶蛋白, 內(nèi)部包含數(shù)目不等的病毒粒子 具有保護(hù)病毒的作用 可在細(xì)胞核或質(zhì)內(nèi)形成,根據(jù)是否形成多角體及其形態(tài)和部位,將昆蟲(chóng)病毒分為以下五類:,1.核型多角體病毒(NPV,nuclear polyhedrosis virus)是于昆蟲(chóng)細(xì)胞核內(nèi)增殖,具有蛋白質(zhì)包涵體的桿狀病毒其數(shù)目在昆蟲(chóng)病毒中首位。 2.質(zhì)型多角體(CPV,cytopla

32、smic polyhedrosis virus) 是于昆蟲(chóng)體內(nèi)增殖,具有蛋白質(zhì)包涵體的一種球狀病毒。 3.顆粒體病毒(GV,granulosis virus) 是一類具有蛋白質(zhì)包涵體,每個(gè)包涵體內(nèi)一般只含一個(gè)病毒粒子的昆蟲(chóng)狀病毒。 4.昆蟲(chóng)痘病毒(EPV,entomopox virus)是一類具有蛋白質(zhì)包涵體的大型病毒。 5.非包涵體病毒,主要包括細(xì)小病毒種的濃核癥病毒和微核糖核酸科的微核糖核酸病毒兩類.,返回目錄,第二節(jié) 亞病毒,亞病毒目前所指的是類病毒、擬病毒和朊病毒。,一、類病毒,馬鈴薯紡錘塊莖病毒早在1922年（美國(guó)）就發(fā)現(xiàn)了，其病原體是瑞士學(xué)者T.O.Piener于1991年發(fā)現(xiàn)的，它是一條長(zhǎng)50nm的棒狀ssRNA分子，稱為馬鈴薯紡錘塊莖病類病毒，是一類新的病原體。,后來(lái)又相繼發(fā)現(xiàn)了許多植物的這種類病毒，它是目前知道的最小，只含RNA一種成分，專性細(xì)胞寄生的分子生物，現(xiàn)在證明PSTV呈棒形結(jié)構(gòu)，是一個(gè)裸露的閉合環(huán)狀RNA分子，整個(gè)環(huán)由2個(gè)互補(bǔ)