蛋白質(zhì)相互作用精品課件

1、蛋白質(zhì)相互作用： 本身具有生物學(xué)意義：這樣的相互作用在生物體中是起什么作用的 發(fā)展技術(shù)：利用這樣的相互作用創(chuàng)造出一些人為的作用,研究蛋白質(zhì)相互作用的目的是發(fā)現(xiàn)并明確其相互作用的生物學(xué)意義 蛋白質(zhì)相互作用是一種表象，通過表象分析規(guī)律，是研究蛋白質(zhì)相互作用的核心 “種瓜得瓜，種豆得豆”是一種表象，反映了遺傳這樣一種本質(zhì) 現(xiàn)象 可研究對象 合適的研究方法,研究蛋白質(zhì)相互作用需要微觀和宏觀的結(jié)合,象與象的一部分,定量分析是研究蛋白質(zhì)相互作用的基礎(chǔ),Input：1020mg total proteins IP sample：Immunoprecipitated from 1000mg of total

2、proteins,定量分析是研究蛋白質(zhì)相互作用的基礎(chǔ),Relative exposure level,研究蛋白質(zhì)相互作用的意義 1、蛋白質(zhì)間的相互作用是細胞生命活動的基礎(chǔ)。 2、基因只是決定蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)才是發(fā)揮作用的主體。蛋白質(zhì)的相互作用是發(fā)揮其功能的主要活動。,生物學(xué)效應(yīng),穩(wěn)定的相互作用與瞬間的相互作用共同構(gòu)成蛋白質(zhì)相互作用的內(nèi)涵。,研究蛋白質(zhì)相互作用是為了研究相應(yīng)的生物學(xué)功能,確定研究目標,尋找相互作用,建立相互作用網(wǎng)絡(luò)和功能體系,從蛋白質(zhì)相互作用到生物學(xué)功能。運用蛋白質(zhì)直接相互作用，發(fā)現(xiàn)相互作用蛋白質(zhì)，再分析這些作用的生物學(xué)意義。 容易犯的錯誤：研究一大堆的蛋白相互作用，卻不知道這些

3、相互作用有什么生物學(xué)意義。 從物學(xué)功能到蛋白質(zhì)相互作用。通過改變生物學(xué)現(xiàn)象，分析蛋白質(zhì)間的遺傳相互作用，進一步研究相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用。 容易犯的錯誤：找到了平行變化的不相關(guān)蛋白質(zhì)。,發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用 遺傳功能分析 序列與結(jié)構(gòu)比較模擬 驗證蛋白質(zhì)相互作用 不同方法的交叉驗證 不同生物體系中驗證,Protein interaction Affinity: A+B=AB,Kd=AB/AB, Kd: dissociation constant,Interaction Kd Streptavidin-biotin binding 10-14M Antibody-antig

4、en interaction (good) 10-8-10-10M Antibody-antigen interaction (weak) 10-6M Enzyme-substrate 10-6-10-10M,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用,Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合） Affinity interaction（親和作用） Yeast two-hybrid and phage display（酵母雙雜交和噬菌體展示） Surface Plasmon Resona

5、nce FRET Proteomic analysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）,Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合） Western blot：變性抗原，主要用于檢測蛋白質(zhì)的存在與否。 免疫共沉淀：非變性抗原，用于鑒定不同蛋白質(zhì)間的相互作用。 免疫共沉淀：AbPr1Pr2 非特異性結(jié)合：Pr1AbPr2 抗體篩庫：cDNA表達庫，抗體結(jié)合表達的蛋白質(zhì)，從而得到基因。已經(jīng)被質(zhì)譜和PCR所淘汰,Western blot,1、電轉(zhuǎn)移效率 2、PVDF膜的充分浸潤 3、轉(zhuǎn)移液中有太多的SDS 4、膜的損壞

6、5、轉(zhuǎn)移時膠和膜沒有完全接觸 6、抗體的問題 7、抗體的濃度太高或太低 8、還原性物質(zhì)的存在 9、封閉不充分,SDSPAGE acrylamide的濃度 蛋白質(zhì)上樣的量 相鄰泳道的蛋白質(zhì)量、離子強度和樣品體積 轉(zhuǎn)移膜：PVDF膜nitrocellulose膜 抗體,免疫共沉淀 免疫共沉淀：AbPr1Pr2 非特異性結(jié)合：Pr1AbPr2,免疫共沉淀,1,2,3,5,4,抗體很差， Western blot問題 Loading比例不對 樣品太多 正確,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用,Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共

7、沉淀和抗原抗體結(jié)合） Affinity interaction（親和作用） Yeast two-hybrid and phage display（酵母雙雜交和噬菌體展示） Surface Plasmon Resonance FRET Proteomic analysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）,Affinity interaction（親和作用） GST pull down：已知蛋白質(zhì)和GST融合，與細胞或組織的“蛋白質(zhì)湯”混合，用谷胱甘肽親和層析分離和已知蛋白質(zhì)結(jié)合的新蛋白質(zhì)。GST tag。 BiotinAvidin結(jié)合：Biotin標記已知蛋白質(zhì)，通過Avidin結(jié)合biotin標記的蛋白質(zhì)，

8、從而得到與biotin 標記蛋白結(jié)合的新蛋白質(zhì)。優(yōu)點是biotinavidin的結(jié)合是最牢靠的；缺點是細胞內(nèi)結(jié)合biotin的蛋白質(zhì)很多。 各種不同的tag。許多,GST pull down,GST Fusion Protein Purification,GST pull down,GST fusion protein 不夠純，用作bait會產(chǎn)生太多的非特異性蛋白質(zhì)污染。,GST pull down,GST Pulldown,binding,wash,elution,BiotinAvidin結(jié)合：生物界最穩(wěn)定的結(jié)合之一,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用,Co-immunoprecipitation

9、and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合） Affinity interaction（親和作用） Yeast two-hybrid and phage display（酵母雙雜交和噬菌體展示） Surface Plasmon Resonance FRET Proteomic analysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）,Yeast two-hybrid （酵母雙雜交）,發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì) 鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用 確定蛋白質(zhì)間相互作用的功能基團,發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì),確定蛋白質(zhì)間相互作用的功能基團,Protein A,AD,3,白 蘭 白

10、 白,鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用,蘭：相互作用 白：不相互作用,Two-Hybrid的優(yōu)點： 是酵母細胞內(nèi)的in vivo相互作用。 只需要cDNA，簡單。 弱的相互作用也能檢測到。,Two-Hybrid的缺點： 都是融合蛋白，萬一融合出新的相互作用。 酵母的翻譯后修飾不盡相同。尤其是蛋白質(zhì)的調(diào)控性修飾。 自身激活報告基因。 都基因庫的要求比較高，單向1/3是in frame 蛋白質(zhì)毒性。 第三者Z插足介導(dǎo)的相互作用。 假陽性。,lacZ,Auto activation,Phage display（噬菌體展示）,Phage display（噬菌體展示） Phage display的最大

11、優(yōu)點是數(shù)量大 細胞：108109 細菌：1010 Phage：1012,尋找受體的配體 7肽：8x1016,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用,Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合） Affinity interaction（親和作用） Yeast two-hybrid and phage display（酵母雙雜交和噬菌體展示） Surface Plasmon Resonance FRET Proteomic analysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）,SPR is used to monitor inter

12、actions occurring in a biospecific surface on a metal layer by measuring changes in the solute concentration at this surface as a result of the interactions.,Surface Plasmon Resonance,SPR 優(yōu)點：無標記、實時 Label-free detection SRP does not require any labels or reporter groups to detect biomolecular interac

13、tions. It follows every step in a multi-step analysis procedure, in contrast to label-based methods that often only report the final step. Real time measurement The progress of interactions is displayed directly, as a plot of response (which is directly related to concentration changes at the surfac

14、e) against time. Immediate feedback on the status of an interaction speeds up assay development and analysis. The results can be processed further after the run, for example to extract kinetic constants for the interaction.,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用,Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和

15、抗原抗體結(jié)合） Affinity interaction（親和作用） Yeast two-hybrid and phage display（酵母雙雜交和噬菌體展示） Surface Plasmon Resonance FRET Proteomic analysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）,Donor,Acceptor,(2-10nm),Excitation frequency,Emission frequency = Excitation frequency,Emission frequency,Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET),Donor

16、is excited at the maximum absorbance wavelength (380 nanometers) of the donor,Acceptor signal is increased at the acceptor emission maximum (510 nanometers),Wavelength of the Fluorescent Proteins,Measure interactions between two proteins in vivo Very sensitive Excellent resolution Helpful in charact

17、erizing major conformational changes in macromolecules Determine the interaction qualitatively and quantitatively,Advantages of FRET,Limitations of FRET,FRET only occurs when the two fluorophores are within 2-10nm of each other, which means that the fluorophores must be brought together via very clo

18、se protein-protein interactions. Require expensive equipment. Require labeling of proteins using fluorophore or GFP fusion,Proteomic analysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)） 有專門的課題加以介紹,研究蛋白質(zhì)相互作用的單分子技術(shù)：原子力相互作用,遺傳功能分析 利用功能缺陷和互補來分析不同蛋白質(zhì)間的相互關(guān)系。 不是蛋白質(zhì)直接相互作用的證據(jù)，但可以提供進一步研究的目標。,蛋白質(zhì)遺傳相互作用（genetic interaction） 是功能性相互作用,有A：小量表達； 有B：無表達；有C：無表達,A,B,C,B,C,有A和B：表達增加；有A和C：小量表達； 有B和C：無表達,A,B,C,C,有A、B和C：高表達,在A、B和C的蛋白質(zhì)復(fù)合體中，A是和基因調(diào)控區(qū)結(jié)合并有小的轉(zhuǎn)錄活性；B可以和A結(jié)合促進A的轉(zhuǎn)錄活性；C本身不能直接促進A的活性，所以不大可能和A有直接相互作用，但能通過B的介導(dǎo)進一步促進轉(zhuǎn)錄。,蛋白質(zhì)直接相互作用：從蛋白質(zhì)物理的相互作用到功能上的相互作用。