微生物遺傳學(xué)課件

1、基因組的精密工程TALE核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)TALENs的研究進(jìn)展及應(yīng)用,生物工程 匯報(bào)人：張瑤,TALENs中文名是轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶，TALENs是一種可靶向特異DNA序列的酶，它借助于TAL效應(yīng)子一種由植物細(xì)菌分泌的天然蛋白來(lái)識(shí)別特異性DNA堿基對(duì)。TAL效應(yīng)子可被設(shè)計(jì)識(shí)別和結(jié)合所有的目的DNA序列。對(duì)TAL效應(yīng)子附加一個(gè)核酸酶就生成了TALENs。TAL效應(yīng)核酸酶可與DNA結(jié)合并在特異位點(diǎn)對(duì)DNA鏈進(jìn)行切割，從而導(dǎo)入新的遺傳物質(zhì)。,簡(jiǎn)介,原理,TALENs充分利用植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonas)自然分泌的蛋白-即激活因子樣效應(yīng)物(TAL effectors,

2、TALEs)-的功能：該蛋白能夠識(shí)別特異性DNA堿基對(duì)。人們可以設(shè)計(jì)一串合適的TALEs來(lái)識(shí)別和結(jié)合到任何特定序列，如果再附加一個(gè)在特定位點(diǎn)切斷DNA雙鏈的核酸酶，就可以構(gòu)建出TALEN，利用這種TALEN就可以在細(xì)胞基因組中引入新的遺傳物質(zhì)。相對(duì)鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言，TALEN能夠靶向更長(zhǎng)的基因序列，而且也更容易構(gòu)建。,TALENs技術(shù)路線圖,TALEs 結(jié)構(gòu)與TALENs,TALEs 具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，包括N 端分泌信號(hào)、中央的DNA 結(jié)合域、1 個(gè)核定位信號(hào)和C 端的激活域( Fig 1A) 通過(guò)對(duì)目前發(fā)現(xiàn)的所有TALEs蛋白分析發(fā)現(xiàn)，T

3、ALEs 蛋白中DNA 結(jié)合域有1 個(gè)共同的特點(diǎn)，不同的TALEs 蛋白的DNA 結(jié)合域是由數(shù)目不同的( 12 30 ) 、高度保守的重復(fù)單元組成，每個(gè)重復(fù)單元含有33 35 個(gè)氨基酸 這些重復(fù)單元的氨基酸組成相當(dāng)保守，除了第12 和13 位氨基酸可變外，其它氨基酸都是相同的，這兩個(gè)可變氨基酸被稱為重復(fù)序列可變的雙氨基酸殘基( repeatvariable di-residues，RVD) ( Fig 1B ) TALEs 識(shí)別DNA 的機(jī)制在于每個(gè)重復(fù)序列的2 個(gè)RVD 可以特異識(shí)別DNA 的4 個(gè)堿基中的1 個(gè)，目前發(fā)現(xiàn)的RVD 共有5 種 統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，HD( 氨基酸名稱) 特異識(shí)別C

4、堿基，NI ( 氨基酸名稱) 識(shí)別A 堿基，NN( 氨基酸名稱) 識(shí)別G 或A 堿基，NG( 氨基酸名稱)識(shí)別T 堿基，NS( 氨基酸名稱) 可以識(shí)別A、T、G、C中的任一種( Fig 1C) 通過(guò)對(duì)天然TALE 的研究發(fā)現(xiàn)，TALEs 蛋白框架固定識(shí)別1 個(gè)T 堿基，所以靶序列總是以T 堿基開(kāi)始。 自然界中，不同TALEs 的DNA 結(jié)合域的氨基酸重復(fù)序列數(shù)目不同，因此，其結(jié)合靶DNA 的堿基數(shù)目也不同 TALEs 蛋白的這一特點(diǎn)可以用來(lái)設(shè)計(jì)基因組修飾的操作工具，理論上可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)DNA 結(jié)合域的重復(fù)序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，得到特異識(shí)別任意序列靶位點(diǎn)的TALEs，因而通過(guò)對(duì)TALEs 重復(fù)序列進(jìn)

5、行人工設(shè)計(jì)并將其與一些功能域融合產(chǎn)生的dTALEs ( designer TALE-type transcription factors) 和TALENs( TALE nucleases ) 引起了人們極大的興趣5，6 這些功能域包括激活子、抑制子、核酸酶、甲基化酶和整合酶等7-9 TALEs 的DNA 結(jié)合域與FokI 核酸內(nèi)切酶的切割域融合，就產(chǎn)生了能夠在特定位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈斷裂( double strand break，DSB) 的嵌合酶TALENs,Fig 1 Structure and base sequence recognition of TALEN,注: NLS 為核定位信號(hào); A

6、D 為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域; VD 為重復(fù)可變雙殘基 圖1 將轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子蛋白構(gòu)建成轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子蛋白核酸酶示意圖,TALENs 基因敲除原理,TALENs 的DNA 結(jié)合域與靶序列結(jié)合后，F(xiàn)okI形成二聚體特異性切割DNA 序列，導(dǎo)致細(xì)胞中發(fā)生的DNA 雙鏈斷裂。NHEJ 途徑和同源重組( homologous recombination，H) 途徑在理論上都可以用于對(duì)感興趣的目的基因進(jìn)行遺傳改造。NHEJ是一種較為簡(jiǎn)單的修復(fù)方式，但是保真度不高，很容易造成DNA 斷裂處的序列發(fā)生改變，產(chǎn)生DNA的小片段插入和/或缺失( indel) ，進(jìn)而造成基因突變。在存在同源序列的情況下，細(xì)胞還可

7、以通過(guò)H 的方式進(jìn)行修復(fù)，不過(guò)效率相對(duì)較低( 見(jiàn)圖2) 。,注: TALENs 為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶; Left TALENs 為識(shí)別突變位點(diǎn)3上游DNA 序列TALENs 質(zhì)粒;Right TALENs 為識(shí)別突變位點(diǎn)5 下游DNA 序列TALENs 質(zhì)粒;NHEJ為非同源末端連接; HR為同源重組 圖2 細(xì)胞通過(guò)同源重組的方式修復(fù)示意圖,TALENs 的構(gòu)建方法研究,設(shè)計(jì)和構(gòu)建TALENs 的最大挑戰(zhàn)是如何把這些能夠結(jié)合靶DNA 的重復(fù)序列( RVD) 組裝起來(lái) 目前，基于Golden gate 方法發(fā)展了幾種組裝不同重復(fù)個(gè)數(shù)TALENs 的方法3，16，17 Golden gat

8、e 方法的核心是應(yīng)用IIs 型DNA 內(nèi)切酶在識(shí)別位點(diǎn)以外對(duì)DNA 進(jìn)行切割，從而達(dá)到將多個(gè)DNA 片段連接起來(lái)的目的( Fig 3),Fig 3 DNA shuffling strategy by using type IIs restriction enzymes Bsa,Two DNA ends terminated by the same 4 nucleotides ( sequence f，composed of nucleotides 1234) flanked by a Bsa recognition sequence，B，form two complementary DNA o

9、verhangs after digestion with Bsa 18,我們實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)反復(fù)嘗試，并結(jié)合已經(jīng)報(bào)道的方法，總結(jié)了一套可以特異結(jié)合靶位點(diǎn)、實(shí)現(xiàn)基因組定點(diǎn)修飾、比較簡(jiǎn)單實(shí)用的TALENs 的構(gòu)建方案( Fig 4),Fig 4 Construction of designed TALENs,The main steps to construct a designed TALEN were present The steps surrounded by broken lines are Golden gate cloning strategy,基因組編輯技術(shù)在模式動(dòng)物中的應(yīng)用,基因組編

10、輯技術(shù)作為靶向修飾方式已經(jīng)成功應(yīng)用到生物學(xué)研究的模式動(dòng)物中，包括斑馬魚(yú)，大鼠，小鼠，果蠅，秀麗線蟲(chóng)和多種其他物種，包括蝴蝶，青蛙和牛。TALSNs 也已被應(yīng)用于研究比較相關(guān)物種的基因功能。這一應(yīng)用為研究較近物種的相似性和不同點(diǎn)，以及可能的同源性基因?qū)Φ姆治鎏峁┝司薮蟊憷?研究者通過(guò)微注射TALENs mNA 和單鏈DNA寡鏈核苷酸或帶有延長(zhǎng)( 800 bp) 同源臂的供體質(zhì)粒至單細(xì)胞胚胎39-40，最終實(shí)現(xiàn)斑馬魚(yú)中l(wèi)oxP 染色體整合，為此模式動(dòng)物的傳統(tǒng)基因激活提供了可能性。除了有價(jià)值的動(dòng)物模型，TALENs 已經(jīng)應(yīng)用于改造植物表型，包括擬南芥和若干種類玉米，最終將像耐病和耐旱特性整合入植物4

11、1-43。這些基因組編輯技術(shù)修飾的生物將毫無(wú)疑問(wèn)的生長(zhǎng)，進(jìn)一步擴(kuò)大基礎(chǔ)研究和基因組生物學(xué)的內(nèi)容,江蘇省醫(yī)藥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地轉(zhuǎn)基因中心基于TALENS和鋅酯酶ZNF技術(shù)建立了快速體細(xì)胞基因重組和小鼠敲除技術(shù)，可在3個(gè)月內(nèi)獲得基因敲出小鼠或是體細(xì)胞重組克隆,基因組編輯技術(shù)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞的方法,雖然基因組編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)的基因突變，但是這項(xiàng)技術(shù)仍然受到將這些酶有效轉(zhuǎn)染進(jìn)入相關(guān)細(xì)胞的限制。例如，核酸酶編碼基因可通過(guò)質(zhì)粒DNA，病毒載體或體外轉(zhuǎn)錄的mNA 形式進(jìn)入相關(guān)細(xì)胞。這些轉(zhuǎn)染方法可以根據(jù)細(xì)胞類型或應(yīng)用性進(jìn)行修改。但是，病毒和非病毒基因的基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)限制基因組編輯技術(shù)的可能應(yīng)用。尤其是，質(zhì)粒DNA 或

12、mNA 的電轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對(duì)于某些細(xì)胞是有毒性且限制性。病毒載體也具有一定的限制性，因?yàn)樗鼈兪菑?fù)雜的，產(chǎn)量低，潛在的免疫原性和調(diào)節(jié)阻礙。盡管有以上缺點(diǎn)，基于腺病毒介導(dǎo)ZFNs基因轉(zhuǎn)染至T 細(xì)胞的臨床實(shí)驗(yàn)正在開(kāi)展，但是未來(lái),科研工作者將努力改善轉(zhuǎn)染方法。 整合酶缺陷慢病毒是一種將鋅指核酶轉(zhuǎn)染至難轉(zhuǎn)染細(xì)胞類型的有效替代方式。但是，這一方法似乎不適用于高度重復(fù)性TALENs 序列44。盡管與ZFNs 相比，TALENs 的合成較簡(jiǎn)單，但是其較難轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。腺病毒載體的轉(zhuǎn)染是ZFNs 的有效轉(zhuǎn)染方式，并可以增加ZFNs 介導(dǎo)HD 效率和增強(qiáng)體內(nèi)ZFNs 介導(dǎo)的基因校正45-47。腺相關(guān)病毒有效包裝只

13、適用于長(zhǎng)度小于4 2 kb 的片段。雖然這只適用于ZFNs 單體和編輯供體結(jié)構(gòu)，但是單一帶有小啟動(dòng)子的TALENs 單體可以插入這一載體。,中科院，港中大PNAS基因編輯研究新成果一種快速組裝基因編輯分子TALEN的方法校轉(zhuǎn)基因中心對(duì)外提供鋅酯酶和TALENS基因敲除服務(wù),基因組編輯技術(shù)的進(jìn)步,為了使核酸酶可以應(yīng)用到基因分析和臨床應(yīng)用方面，科研工作者需要證明此核酸酶可以嚴(yán)格結(jié)合至DNA 靶位點(diǎn)。但是，因?yàn)閺?fù)雜的基因組往往含有與靶位點(diǎn)相似或高度同源序列，從而導(dǎo)致脫靶活性和細(xì)胞毒性。為解決這一問(wèn)題，基于結(jié)構(gòu)和選擇的方法被用來(lái)改善TALENs 異二聚體結(jié)合，同時(shí)具有良好的剪切特異性和較小毒性48-5

14、1。目前，人們已經(jīng)成功改進(jìn)了FokI 切割結(jié)構(gòu)域即Sharkey，與以往的ZFNs 比較，切割活性高15 倍。,其他基因組編輯技術(shù)-轉(zhuǎn)座酶、重組酶和轉(zhuǎn)錄因子,近年來(lái)，人們對(duì)基因組編輯技術(shù)認(rèn)識(shí)不斷加深，應(yīng)用日漸擴(kuò)展，已經(jīng)應(yīng)用于細(xì)胞和生物體的基因修飾。但是，靶向核酸酶的若干限制性( 如，基因組編輯技術(shù)的脫靶效應(yīng)對(duì)于細(xì)胞的毒性的預(yù)測(cè)和檢測(cè)的復(fù)雜) 正在促進(jìn)基因組編輯技術(shù)的程序酶的替代研究發(fā)展。此外，因?yàn)榘邢蚝怂崦敢蕾嘚HEJ 和HD誘導(dǎo)基因突變，在特殊的細(xì)胞類型中可能限制了DNA 修復(fù)機(jī)制的實(shí)現(xiàn)。為解決這一問(wèn)題，鋅指蛋白和TALEs 與酶切結(jié)構(gòu)域結(jié)合，其中包括位點(diǎn)特異性重組酶，轉(zhuǎn)座酶,從而催化DNA

15、 整合、缺失和插入。因?yàn)檫@些酶自動(dòng)實(shí)現(xiàn)DNA 切割和再連接，所以潛在的有毒性DNA 的雙鏈斷裂不會(huì)在基因組中聚集。此外，在應(yīng)用方面，人們往往希望可以靶向插入基因，重組酶和轉(zhuǎn)座酶活性是以供體DNA 插入至基因組為標(biāo)志，因此脫靶效應(yīng)可以直接檢測(cè)。再者，轉(zhuǎn)座酶和重組酶的機(jī)制不依賴細(xì)胞DNA 修復(fù)途徑。因此，這些方法幾乎適用于所有細(xì)胞和細(xì)胞生長(zhǎng)階段。這些過(guò)程的有效性也可以直接進(jìn)化改善，但是，重組酶和轉(zhuǎn)座酶若要具有基因組編輯技術(shù)的功能，它們需要改善其靈活性和效率，尤其，在重組酶催化結(jié)構(gòu)域保持其識(shí)別序列特異性，從而保證與靶位點(diǎn)特異結(jié)合，減少細(xì)胞毒性方面; 同樣，雖然轉(zhuǎn)座酶融合證明在其靶位點(diǎn)具有高活性，這些

16、合成蛋白也有顯著的脫靶危險(xiǎn)。,基因組編輯技術(shù)的臨床應(yīng)用,基因組編輯技術(shù)在疾病治療中的應(yīng)用代表基因治療的巨大進(jìn)步。與傳統(tǒng)治療不同，ZFNs 和TALENs可以通過(guò)精確的基因修飾，徹底治愈疾病的病因。目前，ZFN-誘導(dǎo)的同源定向修復(fù)已應(yīng)用于X 連鎖嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷癥，B 型血友病，鐮刀細(xì)胞病和1-抗胰蛋白酶缺乏的基因缺陷校正。在體外實(shí)驗(yàn)中，ZFNs可以糾正帕金森病患者iPS 細(xì)胞SNCA 基因突變。經(jīng)ZFN-誘導(dǎo)NHEJ 介導(dǎo)修復(fù)是攻克HIV/AIDs 的重要策略。ZNFs 可通過(guò)破壞原代T 細(xì)胞和造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的CC5 基因?qū)崿F(xiàn)HIV-1 的抗性HIV 并已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段( NCT012

17、52641，NCT00842634 和NCT01044654) ?；蚪M編輯技術(shù)可以安全地插入治療性轉(zhuǎn)基因至人類基因組的特異性安全位點(diǎn)。雖然基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用限制在體細(xì)胞，但是在包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞( inducible pluripotent stem cells，iPSCs) 的干細(xì)胞研究中也取得了一定進(jìn)展。這終將為包括自體干細(xì)胞移植的基因治療奠定重要基礎(chǔ).,TALENs是近年來(lái)發(fā)展迅速的編輯基因,TALENs作為一種全新的基因組編輯工具，近年來(lái)引起了人們的極大興趣。與ZFN相比，它更便宜，更高效，脫靶率低。利用這種技術(shù)，研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種疾病的動(dòng)物模型，有助于疾病的分子機(jī)制研究。 在

18、研發(fā)TALENs技術(shù)過(guò)程中，科研人員發(fā)現(xiàn)來(lái)自植物病原菌Xanthomonas中的TAL蛋白核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有較恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。利用此恒定對(duì)應(yīng)關(guān)系，構(gòu)建與核酸內(nèi)切酶的融合蛋白，在特異位點(diǎn)打斷目標(biāo)基因組DNA序列，從而可在該位點(diǎn)進(jìn)行DNA編輯修飾操作，比如knock-out、knock-in、堿基替換、點(diǎn)突變或者基因修飾等。該技術(shù)能識(shí)別任意目標(biāo)基因序列，不受上下游序列影響等問(wèn)題，因此使得基因操作更加簡(jiǎn)單方便。,科學(xué)家首次用TALENs技術(shù)編輯線粒體基因,邁阿密大學(xué)米勒醫(yī)學(xué)院的研究人員利用TAlENs技術(shù)首次清除線粒體內(nèi)的突變DNA，以使得突變的線粒體DNA下降了，這項(xiàng)研究

19、有望用于治療母系遺傳的線粒體病。研究成果發(fā)表在Nature Medicine上 線粒體病通常是由突變的線粒體DNA（mtDNA）引起的，在大部分情況下它與野生型mtDNA共同存在，導(dǎo)致mtDNA異質(zhì)性。常見(jiàn)的線粒體病包括線粒體肌病、線粒體腦病和線粒體腦肌病，如Leber遺傳性視神經(jīng)病（LHON）。這種疾病的主要癥狀為視神經(jīng)退行性病變，在男性中較多見(jiàn)。,TALENs清除突變的線粒體基因,在這項(xiàng)研究中，邁阿密大學(xué)米勒醫(yī)學(xué)院的研究人員探索了轉(zhuǎn)錄激活因子樣（TAL）效應(yīng)物，同時(shí)在尋找修復(fù)線粒體基因缺陷的新策略。他們嘗試了TAL效應(yīng)物核酸酶（TALENs）這種基因編輯的新方法。 研究人員在實(shí)驗(yàn)室中使用細(xì)

20、胞來(lái)設(shè)計(jì)線粒體靶向的TALENs（mitoTALENs），來(lái)結(jié)合并切割線粒體DNA，正是這段基因中的一個(gè)突變引起了LHON。他們隨后檢測(cè)了mitoTALENs是否清除了mtDNA。分析結(jié)果表明，細(xì)胞中總的mtDNA暫時(shí)下降，這是由于突變mtDNA的下降。 文章的通訊作者，神經(jīng)和細(xì)胞生物學(xué)教授Carlos T. Moraes博士表示：“一旦mitoTALENs與特定靶點(diǎn)的DNA結(jié)合并切割，突變的mtDNA就被降解?？偟膍tDNA的下降刺激細(xì)胞通過(guò)復(fù)制未受影響的分子來(lái)增加其mtDNA。兩周之后，mtDNA水平恢復(fù)正常。但由于突變的mtDNA被破壞，細(xì)胞中大部分為正常的mtDNA?！?Moraes博

21、士提到，清除細(xì)胞中的大部分但并非全部突變mtDNA已足以治療多種線粒體病，因?yàn)橹挥挟?dāng)突變mtDNA占了80%以上時(shí)，它才會(huì)引起疾病的癥狀。研究人員計(jì)劃下一步在動(dòng)物中檢驗(yàn)這種方法。,2 0 12年，來(lái)自明尼蘇達(dá)州羅切斯特梅奧醫(yī)學(xué)中心的分子生物學(xué)家斯蒂芬艾克爾領(lǐng)導(dǎo)的研究人員，第一次利用T A L E N s 切割斑馬魚(yú)一段基因序列中的部分DNA，并用合成D N A 取代它們。斑馬魚(yú)是脊椎動(dòng)物生物學(xué)和人類疾病研究的一個(gè)重要的參與者。其胚胎透明、體外受精、短繁殖周期和快速生長(zhǎng)等特點(diǎn)，意味著可對(duì)活體動(dòng)物開(kāi)展緊密的胚胎發(fā)育研究，可作為研究基因行為和功能的一種有用模型。在遺傳組成上，斑馬魚(yú)與人類擁有幾乎90%的相同性，因此研究它們的發(fā)育能夠有助于認(rèn)識(shí)人類疾病。在早期的胚胎發(fā)育階段，這尤其如此。這項(xiàng)研究發(fā)表在2012年9月23日出版的英國(guó)自然雜志上。,轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶主要構(gòu)建能特異性識(shí)別DNA序列的核酸內(nèi)切酶。該酶由兩部分組成： DNA結(jié)合區(qū)域和核酸酶催化區(qū)域。激活因子樣效應(yīng)物主要是識(shí)別靶基因的特定DNA序列，核酸