《分子診斷》PCR.ppt

1、聚合酶鏈反應及其應用,檢驗醫(yī)學院 周 蘭 ,分子診斷學,重醫(yī)醫(yī)學學士（1979年，臨床醫(yī)學） 重醫(yī)醫(yī)學碩士（1986年，病理生理學） 重醫(yī)醫(yī)學博士（1994年，臨床檢驗診斷學） 芝加哥大學博后（00-03年，分子腫瘤實驗室） 電子郵箱 ,檢驗醫(yī)學院 周 蘭,本講內容,1 PCR概述 2 PCR原理 3 PCR產(chǎn)物檢測與分析方法 4 PCR特點及應用 5 PCR技術發(fā)展簡史 6 PCR衍生技術 7 熒光定量PCR 8 其它基因擴增檢驗技術 9 PCR相關檢驗的質量管理,1-1 基因擴增及其方式 gene amplification gene magnification,1 PCR（Polymer

2、ase chain reaction）概述,1-1 基因擴增,1）定義：指基因拷貝數(shù)增加的現(xiàn)象 是基因表達增加的一種重要機制 一般說來 正常細胞中，特定基因的擴增與其對內外環(huán)境因素的應激反應有關 病變細胞中，基因擴增則是致病因素所致的異常擴增,如腫瘤細胞中常見癌基因的擴增 2）方式？,2） 基因擴增的方式,（1）天然擴增-機體細胞內的擴增 在各種因素（發(fā)育和進化的需要、對環(huán)境刺激的應答等）作用下，機體細胞內相關基因的復制擴增 （2）人為擴增 分子克隆-體外、細胞內 DNA合成儀-試管內（無細胞體系） PCR-試管內（無細胞體系）,重組DNA,目的基因,載體,復制子,宿主細胞,擴增,擴增,提取目

3、的DNA分子,1）基礎研究的需要 *醫(yī)學生命科學研究 *農(nóng)林畜牧魚業(yè)的基礎研究 2）應用研究及應用的需要 *醫(yī)學領域（如基因診斷、法醫(yī)學檢測） *現(xiàn)代生物技術產(chǎn)業(yè)（藥物開發(fā)，疫苗， 高質量食品和日常生活用品等） ,1-2 PCR技術誕生所依賴的社會需求,1-3 PCR的定義,模板DNA 引物（引子序列，一對） 耐熱DNA聚合酶 四種單核苷酸 Mg 2+,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,

4、PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,第1輪結束,第2輪開始,一個分子DNA變成兩個分子,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反應條件 PCR過程 PCR的特點,第2輪結束,兩分子DNA變成4分子DNA,利用DNA聚合酶催化一對引物間的特定DNA片段在體外實現(xiàn)快速、大量擴增的方法 也稱：無細胞克隆技術 或：特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法 是一種模擬體內天然DNA復制過程的體外核酸擴增技術，是基因擴增技術的一次重大革新,1-3 PCR定義,現(xiàn)已廣泛應用到分子生物學研究、臨床檢測等各個領域

5、。 優(yōu)點： 特異、敏感、簡便 自動化 快速、高效（數(shù)小時內可使模板擴增107108倍）,2-1 DNA的變性和復性 2-2 PCR標準反應體系及反應過程-三步曲 2-3 反應的結果 2-4 PCR的反應條件及其對PCR的影響 2-5 產(chǎn)物片段及其累積過程,2 PCR原理,2-1 DNA的變性與復性,DNA的變性（denaturation) 熱變性是實驗室最常用的方法 DNA的復性（renaturation),1）標準反應體系（五要素） （1）DNA模板(template)：靶基因 （2）原料：dNTPs（dATP，dGTP，dCTP，dTTP） （3）催化酶：耐高溫的DNA聚合酶（如：Taq酶

6、） （4） 一對引物（primer）：擴增序列的決定者 其與靶基因兩側序列互補 （5） Mg2+ 和 Buffer,2-2 PCR標準反應體系及反應過程,高溫變性：在高溫（95）下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板 低溫退火：在低溫（3755）下，兩條人工合成的寡核苷酸引物分別與互補的單鏈DNA模板結合，形成部分雙鏈 適溫延伸：在耐熱DNA聚合酶的最適溫度（72）下，以引物的3端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新鏈,2） 反應過程-三步曲,2）PCR的反應過程,重復13步 2530輪,目的DNA片段 擴增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈

7、 與引物復性,DNA變性 形成2條單鏈,子鏈延伸 DNA加倍,PCR原理示意圖,Sample denaturatation Primer annealing Primer extension,2-2 反應過程,播放PCR短片,1）每一條雙鏈DNA模板，在一次熱循環(huán)后就成了 兩條雙鏈DNA分子 2）每次循環(huán)產(chǎn)生的DNA均能成為下次循環(huán)的模板 3）每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴增一倍，PCR產(chǎn)物以指數(shù)形式（2n）迅速擴增 4）經(jīng)過2530個循環(huán)后， 理論上可使基因擴增109倍以上 實際上一般可達106107倍（ why？）,2-3 PCR的結果,式中：Y 表示擴增產(chǎn)物的量

8、 A 表示n-1次擴增時DNA分子數(shù)量 E 表示擴增效率 n 表示循環(huán)次數(shù) 擴增30個循環(huán)，即n=30時 若E=100%，則y=230=1073741824(109) 若E=80%，則y=1.830=45517159.6(107) 由此可見，其擴增的倍數(shù)是巨大的!,PCR反應動力學公式：Y=A（1+ E）n,2-3 PCR的結果 30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle

9、 = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,將擴增產(chǎn)物進行電泳，經(jīng)溴化乙錠（EB)等染色，在紫外燈照射下可見到DNA的特異擴增區(qū)帶,是一種熒光染料，可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下發(fā)出紅色熒光 根據(jù)情況，可在凝膠電泳液中加入終濃度為 0.5ug/ml的EB；有時亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色1015min EB染色后，肉眼可見核酸電泳帶的DNA量一般5ng 它是一種高誘變

10、性的化學物質 SYBR-green 和 gelred 是毒性更小的染料,溴化乙錠(ethidium bromide，EB),2-4 PCR的反應條件及其對PCR的影響,PCR操作程序 向一微量離心管中依次加入雙蒸水、緩沖液、Mg2+、dNTPs、引物、DNA模板和Taq DNA聚合酶 混勻后，離心數(shù)秒，使反應成分集于管底 加礦物油50100l于反應液表面，防蒸發(fā) 置反應管于PCR儀上，設置程序，進行熱循環(huán),PCR反應五要素 引物（primer） 酶（Taq DNA polymerase） dNTPs （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板（template） Mg2+ （magnes

11、ium）,1）模板：* 單、雙鏈均可 *幾乎不需要純化 *但，必須了解靶基因兩側的核酸序列 *一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞或裂解病原體，再消化除去染色體的蛋白質以游離靶基因，便可直接用于PCR擴增 * RNA模板提取時，要防止RNase降解RNA 注意：不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類, 微生物 細胞：血痕、精斑、口腔拭子、陰道拭子、尿樣、單根毛發(fā)、指甲削刮的碎屑、牙刷、琥珀中的昆蟲、木乃伊 固定和包埋的組織標本：脫蠟、蛋白酶K消化 模板DNA的濃度： 0.12ug/100ul體系 *PCR產(chǎn)量隨模板DNA濃度的增加而顯著升高 *但，模板DNA濃

12、度過高，則致非特異性產(chǎn)物增加,模板DNA的來源,2）耐熱的DNA聚合酶,來自嗜熱水生菌，耐熱 具有 5-3方向的聚合酶活性 5-3外切酶活性 逆轉錄酶活性 酶量增加：降低反應的特異性 酶量過少：降低反應的產(chǎn)量 來源： 有提純產(chǎn)物 也有基因工程產(chǎn)品,例：經(jīng)典的Taq DNA聚合酶的特性,該基因2496bp（832aa），酶蛋白為94KDa 酶催化反應速度與溫度的關系 7580：延伸約150nt/酶分子/s 70: 延伸60nt/酶分子/s 55: 延伸24nt/酶分子/s 溫度過高(90以上) 過低(22以下),都降低Taq DNA酶活性,良好的熱穩(wěn)定性： PCR混合物中的Taq DNA聚合酶

13、92.5 X 130min 95 X 40min 97.5 X 56min 其熱穩(wěn)定性是該酶用于PCR反應的前提條件 也是PCR技術能迅速發(fā)展和廣泛應用的重要基礎,仍可保持50%的活性,例：經(jīng)典的Taq DNA聚合酶的特性,忠實性 該酶無35外切活性 SO,在PCR反應中如發(fā)生某些堿基的錯配，該酶無法予以校正 即其保真性不如Pfu DNA聚合酶等 其堿基錯配機率：2.110-4,例：經(jīng)典的Taq DNA聚合酶的特性,離子依賴性 Taq 酶依賴Mg2+，對Mg2+非常敏感 *以活性程度很低的鮭魚精子DNA為模板，dNTP的濃度為0.70.8mmol/L時，用不同濃度Mg2+進行PCR反應10mi

14、n，發(fā)現(xiàn)：MgCl2在2.0mmol/L時TaqDNA聚合酶的活性最高 *Mg2+過高：抑制酶活性 Mg2+在10mmol/L時可抑制4050%的酶活性,例：經(jīng)典的Taq DNA聚合酶的特性,TaqDNA聚合酶,具有非模板依賴性活性，可將PCR雙鏈產(chǎn)物的每一條鏈的3端加入單核苷酸尾，故可使PCR產(chǎn)物具有3突出的單A核苷酸尾 另一方面，在僅有dTTP存在時，它可將平端的質粒的3端加入單T核苷酸尾，產(chǎn)生3端突出的單T核苷酸尾 應用該特性，可實現(xiàn)PCR產(chǎn)物的T-A克隆法,除經(jīng)典的Taq酶外，還陸續(xù)發(fā)現(xiàn)下列耐熱酶 1）Tth DNA聚合酶： *從Thermus thermophilus HB8中提取而

15、得 *該酶在高溫和MnCl2條件下，能有效地逆轉錄RNA *當再加入Mg 2+后，該酶的聚合活性大大增加 SO，逆轉錄為cDNA與DNA的擴增可用同一種酶催化 即該酶適用于RT-PCR,2）pfu DNA 聚合酶,是從Pyrococcus furiosis中精制而成的高保真耐高溫DNA聚合酶，它不具有5-3外切酶活性，但具有3-5外切酶活性，可校正PCR擴增過程中產(chǎn)生的錯誤，使產(chǎn)物的堿基錯配率極低，催化DNA的忠實性比Taq DNA聚合酶 高12倍 PCR產(chǎn)物為平端（無3端突出的單A核苷酸）,3）Vent DNA聚合酶 *是從Litoralis棲熱球菌中分離出的 *不具有5-3外切酶活性，但具

16、有3-5外切酶活性，可以去除錯配的堿基，具有校對功能 *可擴增 12kb的模板DNA,對PCR所用的聚合酶的選擇原則和參考信息 （自學，了解）,TaKaRa PCR Enzymes,1.TaKaRa TaqTM 1） 用于12 kbp以下的DNA片段的PCR擴增 2） 比較經(jīng)濟的PCR用DNA聚合酶 3） 適用于一般的PCR擴增或檢測 2.TaKaRa Ex TaqTM 1） 用于15 kbp以下的DNA片段的PCR擴增 2）融合了LA- PCR技術 3） 可信度是TaKaRa TaqTM 的34倍 4）從擴增靈敏度、擴增量、PCR條件的通用性考慮，是一種萬能型PCR用DNA 聚合酶,3.Ta

17、KaRa LA TaqTM 1）用于10 kbp以上的DNA片段的PCR擴增 2） 融合了LA PCR技術 3） 可信度是TaKaRa TaqTM 的7倍 4） 適于擴增富含GC或復雜二級結構的DNA（用GC Buffer） 4.PyrobestTM DNA Polymerase 1）高保真性（High Fidelity）：與Pfu、Vent DNA聚合酶相同，可信度是TaKaRa TaqTM的10倍以上 2）良好的擴增性能：與TaKaRa TaqTM有相同的擴增性能（優(yōu)于 Pfu、Vent DNA聚合酶）,TaKaRa PCR Enzymes,TaKaRa PCR Enzymes,5.TaK

18、aRa Z-TaqTM 1）反應速度快，是TaKaRa TaqTM的5倍 2）擴增性能良好，與TaKaRa Ex TaqTM 相同 3）可信度高，是TaKaRa TaqTM 的34倍,DNA Polymerase的可信度比較,TaKaRa PCR 酶的性能比較,PCR時酶的選用,引物：與靶基因兩側互補的寡核苷酸，其本質是單鏈DNA，它決所得擴增產(chǎn)物的特異性和長度 （1）引物長度：18-40nt,常用20-24nt *至少18nt,這樣才能保證擴增反應的特異性 *太長，則致退火時引物與模板結合不充分，擴增產(chǎn)物減少,3）引物（primer)及其濃度,（2）引物跨度：以200-500bp為宜 特定條

19、件下可擴增長至10kb的片段 （3）引物序列：除與靶序列兩側匹配外，還應與核酸數(shù)據(jù)庫的其它序列不匹配(無明顯同源性） （4）引物濃度：一般是0.1-0.5 mol/L。理想狀態(tài)是-以最低引物量滿足對產(chǎn)物擴增的最大需要 引物濃度偏高： 引起錯配等，致反應特異性下降 增加引物間二聚體的形成機會，降低擴增效率,引物間互補 形成引物二聚體,引物內互補 形成二級結構,引物設計的最大原則 在擴增的特異性和擴增效率上取得平衡 即最大限度地提高擴增反應的特異性和效率 引物設計的軟件有很多 既可以在線設計，如Primer3 /cgi-bin/primer3/prime

20、r3_www.cgi 也可以用Primer5、Oligo6.65 等等,序列應針對靶基因的高度保守區(qū)（最特異的區(qū)） 同時與非擴增區(qū)無同源序列（以減少非特異結合） 引物長度以18-30nt為宜，多為20-24nt ATGC最好隨機分布（避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的 成串排列，尤其3-端不應超過3個連續(xù)的G或C） G+C占45-55% （G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶） 兩引物之間：匹配的GC含量（why? ）,引物設計原則（1）,引物設計原則（2）,引物內部無互補序列，避免形成二級結構 兩引物間無互補序列，避免形成引物二聚體 引物3端為關鍵堿基,其第1和2個堿基要嚴格配對

21、，否則致PCR失敗或擴增效率和特異性降低 5端無嚴格限制，其堿基可不與模板DNA互補而呈游離狀態(tài)，因此可在其外設計附加序列（見后,便于對擴增產(chǎn)物的分析和克隆)，其對PCR反應無明顯影響,3,5,3,5,限制性內切酶的識別序列 啟動子序列 引入定點突變序列 探針標記(讓引物中的核苷酸帶標記）,4）dNTP的質量與濃度,（1）dNTP呈顆粒狀：保存不當易變性失活 （2）dNTP溶液呈酸性：先配成高濃度、小量分裝，-20凍存 （以1M NaOH或1M Tris-HCl的緩沖液將其pH調節(jié)到7.07.5） 多次凍融會使dNTP降解 （3）濃度：取決于擴增片段的長度(920-200mol/L) 濃度過高

22、易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產(chǎn)量 （4）四種dNTP濃度應相等 任何一種dNTP濃度不同于其它時,容易引起錯配,Mg2+是DNA聚合酶的激活劑 *0.5mmol/L-2.5mmol/L反應體系 *Mg2+過低和過高 Taq酶活性降低、特異性降低 PCR產(chǎn)物數(shù)量和質量下降,5）Mg2+,6）循環(huán)參數(shù)（溫度、時間和次數(shù)）的設置, 變性溫度與時間 通常用9394 x l min 或95 x 20-30sec 若低于93，則需延長時間 溫度不能過高，否則降低酶的活性 由于模板DNA鏈比較長，因此PCR反應的第一個循環(huán)的變性時間需要長些 最后才是通過大量培養(yǎng)細菌來擴增目的基因。要經(jīng)過DNA酶

23、切、連接、轉化和培養(yǎng)等、提取和回收等程序,操作復雜，一般需要2-7天左右時間,4）對標本的純度要求低：血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNA 5）重復性好 6）用途廣泛 （1）醫(yī)學 基因組DNA分析，遺傳物質的鑒定和遺傳病、 腫瘤和感染性疾病等的診斷、治療和預防 （2）農(nóng)林牧漁業(yè) （3）環(huán)境科學 （4）法醫(yī)學 （5）考古學,PCR技術的應用,該方法首先被應用于人-珠蛋白DNA的擴增及鐮刀狀紅細胞貧血病的產(chǎn)前診斷 自1985年首次報道PCR方法以來，PCR被廣泛應用于分子克隆、序列分析、基因突變、遺傳病、傳染病、性傳播性疾病、法醫(yī)鑒定和考古研究等多領域，并發(fā)揮著越來越大的作用

24、 九十年代中期PCR臨床應用在國內全面展開 1997年衛(wèi)生部下文禁止普通PCR在臨床診斷的應用 1998年實時熒光PCR技術開始在中國較廣泛的應用于臨床檢測,PCR技術的應用舉例,* DNA重組：目的基因獲得和篩選 * 基因檢測 1）病原生物基因檢測：感染性疾?。℉BV/HCV) 2）遺傳病的診斷：地中海貧血等 3）惡性腫瘤診斷：癌基因或抑癌基因突變、 耐藥基因表達水平、標志物基因 4）性別基因鑒定 5）法醫(yī)學分析：個體識別、親緣鑒定,表 病原微生物檢測項目及方法,例如 癌基因或抑癌基因突變等 程序： PCR- 酶切-電泳 PCR-RFLP,正常,病人,PCR-RFLP,例如 基因鑒定,待測1

25、,待測2,Y引物,PCR 電泳,待2男性 待1女性,4 PCR特點及應用,不足： 1）需靶DNA序列的信息 2）產(chǎn)物短小 3）錯配,5 PCR技術簡史,核酸體外擴增的設想 聚合酶鏈反應的發(fā)明,胡德（LE Hood）實驗室的4大發(fā)明（ABI）,蛋白質測序儀:1977年（ABI) DNA合成儀：1982年（ABI) 1956年美國生物化學家科恩伯格與美國生化學家奧喬亞用人工合成的方法制得了DNA和RNA 1970年，印度血統(tǒng)的美籍學者科蘭納首次用化學方法人工合成了有77個核苷酸對的酵母丙氨酸的結構基因 DNA測序儀：1986-06(ABI) 蛋白質合成儀: 20世紀80年代（ABI) 1969年第

26、一臺自動多肽合成儀問世 第一個產(chǎn)品是核糖核酸酶A(梅里菲爾德） 2003-05 第一臺中國自制多肽自動合成儀投產(chǎn) (中國地奧基團-胸腺五肽） ABI發(fā)明四大生物研究設備，并成功實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，為現(xiàn)在分子生物學的發(fā)展打下了堅實的技術基礎，對世界生命科學研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了深遠的影響。胡德現(xiàn)任CNSI董事、美國納斯達克上市公司董事，他還是美國國家科學院(NAS)院士、美國學者協(xié)會會員、美國科學藝術學院院士,5 PCR技術簡史,核酸體外擴增的設想 聚合酶鏈反應的發(fā)明,由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困

27、難 這使得PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫(yī)學界的足夠重視,1988年才木(Saiki) 等從嗜熱水生桿菌(Thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶，命名為Taq DNA聚合酶 其用于PCR時，在熱變性后不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶，大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，也增加了擴增長度（2.0kb）,Thermus aquaticus,A hot spring in Yellowstone National Park,此菌于1969年由Brock分離自美國黃石公園溫泉，作為棲熱桿菌的標準菌株，其生長溫度為7075。最初從中分離到分子量6068KDa，比活

28、性為20008000U/mg的DNA聚合酶 后來，Cetus公司的Kary Mullis等又分離到比活為20萬U/mg的純酶，分子量為93910。此種9.4KDa酶的最適溫度為7580，與單純核苷酸的結合率（Kcat）可達150核苷酸（nt）/s酶分子。以M13模板，用富含G+C的30bp引物延伸，70時Kact60nt/s；55可達24nt/s；37時為1.5nt/s，而22時低至0.25nt/s。高于90時DNA合成活性甚差，這種高溫條件下，引物與模板已不能牢固結合,5 PCR技術簡史,核酸體外擴增的設想 聚合酶鏈反應的發(fā)明,Kary B. Mullis（1944）,PCR技術問世背后的故

29、事,在一個春天的夜晚,Mullis與女友駕車于美國加州西岸的128號公路途中有了PCR的靈感 Cetus公司以1萬$獎勵他發(fā)展PCR，其后卻于1991年轉手將專利權以3億3千5百萬$轉賣給全球最大的制藥廠-瑞士offman-LaRoche公司，而使得PCR這個技術成為史上最貴的專利 瑞士這家公司現(xiàn)在正以連鎖反應般的速率賺進美金 此后，PCR的應用一日千里，相關的論文發(fā)表量令其他研究難望其項背 PCR對于基礎及臨床醫(yī)學的貢獻之深遠，也難以估量,有時候一個創(chuàng)造性的靈感在你不經(jīng)意中突然浮現(xiàn)出來 在1983年4月的一個星期五的晚上 ，我和一個化學家朋友正在驅車去Mendocino縣的路上，她睡著了，美國10l國道也沒有駕車要求了。我喜歡晚上駕車，每個周末我都要去我北部的小木屋并在車上靜靜地呆上3個小時，來放縱我的思維。那個特殊的晚上我正在想著我計劃中的DNA測序實驗。車行