肺結(jié)核的新診斷技術(shù).ppt

1、新診斷技術(shù)及其在NTP中的應(yīng)用,江蘇省結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室,NTP中現(xiàn)行實(shí)驗(yàn)室技術(shù),涂片：萋尼染色顯微鏡檢 培養(yǎng)：固體培養(yǎng)基：簡(jiǎn)單法、離心法 藥敏：固體培養(yǎng)基：絕對(duì)濃度法、比例法 菌種鑒定：鑒別培養(yǎng)基生化試驗(yàn) 傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)不能適應(yīng)不斷深入的結(jié)核病防治工作的需要,實(shí)驗(yàn)室新診斷技術(shù)總覽,細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法 發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED） 液體培養(yǎng) 分子生物學(xué)檢測(cè)方法 Genexpert HAIN Genechip 免疫學(xué)檢測(cè)方法 ELISOPT 42:2321-2325 2 Mean of 14 studies in MGIT960 = 10.7% (2.0-30.0) = acceptable ran

2、ge,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml + S,MGIT 7 ml + I,MGIT 7 ml + R,MGIT 7 ml + E,GC,S,I,R,E,0,8 ml BACTEC MGIT SIRE 補(bǔ)充劑,每種藥物0,1 ml,轉(zhuǎn)移 0,5 ml 陽(yáng)性 MGIT 培養(yǎng)物,0,1 ml 陽(yáng)性 MGIT 培養(yǎng)物,9,9 ml 蒸餾水,轉(zhuǎn)移 0,5 ml,插入BACTEC MGIT 960,BACTEC MGIT 960 TB 藥敏試驗(yàn) S.I.R.E.,LED顯微鏡,發(fā)光二級(jí)管 (LED)

3、 技術(shù) 提供價(jià)廉、穩(wěn)定的光源 壽命 150,000 h 反復(fù)開關(guān)不影響壽命 不釋放有毒氣體 不需要暗室 操作人員工作負(fù)荷減輕,快速藥敏-商業(yè)化線性探針檢測(cè)（LPAs）,GenoType MTBDRplus, HAIN 檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群以及利福平、異煙肼耐藥相關(guān)的突變 檢測(cè)XDR的試劑盒也已經(jīng)發(fā)布 INNO-Lipa Rif TB 檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群以及于利福平耐藥相關(guān)的突變 大多數(shù)利福平耐藥的菌株同時(shí)也耐異煙肼 WHO 鼓勵(lì)使用的工具 可使用涂陽(yáng)痰標(biāo)本和培養(yǎng)物進(jìn)行操作 快速、簡(jiǎn)便易用，僅需基本PCR技術(shù) 然而，價(jià)格比較昂貴，且不能檢測(cè)造成耐藥突變的熱點(diǎn)區(qū)域外的突變,11,MTBDRp

4、lus 操作流程,DNA提取 用NALC/NaOH 處理痰標(biāo)本,2) PCR擴(kuò)增,3) 雜交 擴(kuò)增產(chǎn)物和 固化在 膜上的特異性探針雜交,4) 結(jié)果判讀,rpoB 野生型探針: WT1 - WT8 rpoB 突變探針: MUT1-3: D516V, H526Y, H526D, S531L 野生型缺失 野生型突變,MTBDRplus rpoB,katG 基因突變,MTBDRplus katG,MTBDRplus inhA,inhA 基因突變,MTBDRplus 反應(yīng)條帶(示范),南非的經(jīng)驗(yàn)：,Genotype MTBDR plus assay: 直接從涂片陽(yáng)性標(biāo)本中檢測(cè)rpob基因突變 (耐利福平

5、), katG 基因 (高濃度異煙肼耐藥), inhA 基因(低濃度異煙肼耐藥) 靈敏度、特異度，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值 耐利福平 98.9, 99.4, 97.9, 和99.7 耐異煙肼 94.2, 99.7, 99.1, 和 97.9 耐MDR-TB 98.8, 100, 100, 和 99.7,Barnard M, et al. Am J Respir Crit Care Med 2008;177:787-92,結(jié)核耐藥檢測(cè)基因芯片,激光共焦掃描儀,軟件判讀,結(jié)核耐藥檢測(cè)芯片獲北京市自主創(chuàng)新產(chǎn)品證書,樣品制備儀,雜交儀,通 量：兩個(gè)一線抗結(jié)核藥 速 度： 6 小時(shí)（比傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)法快 5

6、0-100 倍） 靈敏度：103 CFU/反應(yīng) 特異性：對(duì)照設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)；自動(dòng)判讀,基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測(cè)分離株或者痰樣本中結(jié)核桿菌多藥耐藥（利福平、異煙肼）。,International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 13:914-920, 2009（IF=2.3）,18,獲國(guó)家醫(yī)療器械證書和歐盟CE認(rèn)證,Xpert MTB/RIF,檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌 檢測(cè)利福平耐藥 直接標(biāo)本檢測(cè) 100分鐘可獲得結(jié)果,工作流程 痰 簡(jiǎn)單，僅需1個(gè)步驟的準(zhǔn)備工作 獲得結(jié)果的時(shí)間 16 樣本 / 天 / 模塊 不需要生物安全規(guī) 綜合

7、控制 性能 對(duì) MTB特異 敏感性與培養(yǎng)相似 通過(guò)rpoB 基因檢測(cè)利福平耐藥 產(chǎn)品和系統(tǒng)設(shè)計(jì) GeneXpert 系統(tǒng)的檢測(cè)模塊 測(cè)試模塊的擴(kuò)大和交換 對(duì)非分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室人員僅需要最多1天的培訓(xùn),GeneXpert,樣本準(zhǔn)備、擴(kuò)增、檢測(cè)自動(dòng)化,MTB / 利福平耐藥性檢測(cè),痰標(biāo)本可以直接放入模塊中，而無(wú)需與任何試劑進(jìn)行混合處理,Xpert MTB/RIF,單中心評(píng)估研究（初步結(jié)果）,不同研究設(shè)計(jì)和研究人群，肺結(jié)核和肺外結(jié)核標(biāo)本 檢測(cè)結(jié)核 匯總的未經(jīng)校正的敏感性 92% 匯總的未經(jīng)校正的特異性 98% 檢測(cè)利福平耐藥 匯總的未經(jīng)校正的敏感性 98% 匯總的未經(jīng)校正的特異性 99%,操作方面,廢

8、棄物管理 如痰標(biāo)本容器 儲(chǔ)存和供應(yīng) 反應(yīng)盒龐大, 2 - 28C, 有效期12個(gè)月 電力供應(yīng) UPS (400 VA) 或電池組 培訓(xùn) 需求不高 (使用計(jì)算機(jī)、預(yù)防污染) 生物安全 與涂片鏡檢相同 每年校正 模塊更換 安全 防盜 (計(jì)算機(jī)),世界衛(wèi)生組織 快速開展Xpert MTB/RIF診斷試驗(yàn) 技術(shù)和實(shí)施方面的考慮 2011年3月,WHO對(duì)Xpert MTB/RIF的建議摘要：,高度推薦用于懷疑MDR-TB以及合并HIV感染的結(jié)核病病人的初診診斷 對(duì)于MDRTB、HIV不嚴(yán)重的地區(qū)，可以在涂片之后考慮使用Xpert MTB/RIF，特別是用于診斷涂陰病人（取決于費(fèi)用） 肺外標(biāo)本的有關(guān)證據(jù)尚

9、有限 增加檢測(cè)次數(shù)可能增加敏感性，但需考慮費(fèi)用增加 適用于兒童 不能替代傳統(tǒng)涂片、培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn),步驟 1: 特異抗原激發(fā)淋巴細(xì)胞,IFN- 釋放,陰性對(duì)照,ESAT-6 或 CFP-10,孵育,孵育,顯影,步驟 2: 用ELISA 檢測(cè) IFN- ,Y Y Y,Y,Y,Y,Y Y Y,洗滌,Y Y Y,Y,Y,Y,洗滌,Y Y Y,QuantiFERON TB Gold實(shí)驗(yàn),T-SPOT TB (ELISPOT)技術(shù),單核細(xì)胞分離,TB抗原刺激，IFN- 釋放,一抗捕獲IFN-,與標(biāo)記的二抗結(jié)合,酶作用標(biāo)記物顯色,每一斑點(diǎn)代表釋放IFN-的一個(gè)細(xì)胞,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y

10、,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,IFN-,抗原,小 結(jié),NTP中如何應(yīng)用 給誰(shuí)用？哪里做？怎么用？,國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議,液體培養(yǎng)用于: 結(jié)核病可疑癥狀者檢查, 可以作為結(jié)核?。退帲┑脑\斷依據(jù)和結(jié)核病患者治療效果判斷, 液體培養(yǎng)可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng),推薦理由: 液體培養(yǎng)在已經(jīng)在我國(guó)注冊(cè)； 國(guó)內(nèi)外研究顯示其敏感性和TAT優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)； 數(shù)據(jù)顯示在我國(guó)具有可行性,符合成本效果；,推薦使用層級(jí): 區(qū)縣、地市和省級(jí)（醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)）,國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議,GenXpert 即將可以用于: 結(jié)核病可疑癥狀者檢查, 可以作為結(jié)核病的輔助診斷方法和結(jié)核病患者治療效

11、果判斷, 它有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的培養(yǎng)和利福平的藥敏試驗(yàn)（可疑耐藥結(jié)核病患者）,推薦理由: 即將在我國(guó)獲得注冊(cè)證書； 國(guó)內(nèi)外研究顯示其敏感性和特異性，陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告時(shí)間優(yōu)于傳統(tǒng)方法； WHO 在全球推薦 數(shù)據(jù)顯示在我國(guó)具有可行性,符合成本效果；,可能使用層級(jí): 區(qū)縣（？）、地市和省級(jí)（醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)）,國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議,LPA可以用于: 可疑耐藥結(jié)核病患者查,它有望代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn),推薦理由: 在我國(guó)獲得注冊(cè)證書； 國(guó)內(nèi)外研究顯示其敏感性和特異性（TAT)較好； WHO 在全球推薦 數(shù)據(jù)顯示在我國(guó)具有可行性,符合成本效果；,可能使用層級(jí): 地市和省級(jí)（醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)

12、防機(jī)構(gòu)）,國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議,基因芯片可以用于: 可疑耐藥結(jié)核病患者查,它有望代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn),推薦理由: 在我國(guó)獲得注冊(cè)證書； 國(guó)內(nèi)研究顯示其敏感性和特異性和(TAT)較好； 民族品牌 數(shù)據(jù)顯示在我國(guó)具有可行性,符合成本效果；,可能使用層級(jí): 地市和省級(jí)（醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)）,國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議, 干擾素釋放試驗(yàn)可以用于: 結(jié)核菌潛伏感染篩查,兒童和老年人以及免疫力低下者結(jié)核病的輔助診斷（參考）,推薦理由: 在我國(guó)獲得注冊(cè)證書，國(guó)家對(duì)一些特殊診斷試劑的規(guī)定； 國(guó)內(nèi)外研究顯示其敏感性和（特異性）較好； 數(shù)據(jù)顯示在我國(guó)具有可行性,可能使用層級(jí): 縣區(qū)、地市和省級(jí)（醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)）,我國(guó)新診斷技術(shù)應(yīng)用設(shè)想,根據(jù)國(guó)家結(jié)核病防治規(guī)劃的需要，按照不