《液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用》PPT課件.ppt

1、概 述LC-MS聯(lián)用機(jī)遇與挑戰(zhàn),LC ： 適用面廣，但定性能力差。 MS： 定性能力強(qiáng)，但分析混合物時(shí)效果差。 LC-MS 通過LC的分離，使MS可以分析具有大量雜質(zhì)的混合物中的待 測(cè)物，并提高分析的專一性和靈敏度； LC可以分離同分異構(gòu)體，彌補(bǔ)了MS的不足。,GC-MS : 樣品必須氣化 不適合極性、熱不穩(wěn)定和大分子化合物。（20%）,LC-MS：不揮發(fā)性化合物、極性化合物、熱不穩(wěn)定化合物和大分子化合 物(包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等)，分析范圍廣。,LC/MS 聯(lián)用的主要困難,LC-MS 接口 (Interface)類型,API (atmosphere pressure ionizati

2、on),ESI (electrospray ionization),APCI(atmospheric chemical ionization),熱噴霧(TSP)、等離子體噴霧(PSP)、粒子束(LINC)和動(dòng)態(tài)快原子轟擊(FAB)等。,Electrospray ionization(ESI) ESI 將溶液中的離子轉(zhuǎn)變?yōu)闅庀嚯x子,進(jìn)行MS分析，最軟的質(zhì)譜離子化技術(shù)。,Tayler 錐(電泳機(jī)制）,24kV,0.1mm,2 cm,1、 液體表面帶電 2、帶電霧滴形成 3、霧滴蒸發(fā) 4 、氣相離子從微小的霧滴產(chǎn)生,LC-MS 中常用電離技術(shù),不同表面張力溶劑的起始電位（c 0.1mm, d=40m

3、m),ESI 所需電位,為使Taylor發(fā)生靜電噴霧，在毛細(xì)管尖端需施加的起始電位：,溶劑表面張力 Taylor 錐的半角 0 真空介電常數(shù) c 毛細(xì)管半徑,ESI 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化 、待測(cè)物質(zhì)在溶液中的狀態(tài)（溶液化學(xué)） 待測(cè)物質(zhì)在供試品溶液中以離子狀態(tài)存在，可提高生成氣相離子的效率，提高檢測(cè)靈敏度。 B + RCOOH BH+RCOO- HA + NH3 A- +NH4+ 2、 溶劑的表面張力 純水，因表面張力高，所需起始電位Uon高，易產(chǎn)生放電現(xiàn)象； 常用水甲醇（50:50)溶劑，同時(shí)黏度也下降，有利于霧化 3、 溶液流速 低流速產(chǎn)生細(xì)霧滴，有利于產(chǎn)生氣相離子，提高信號(hào)靈敏度； 高流速范圍內(nèi)，

4、為提高霧化效率，需采用高速同軸氣流輔助霧化技術(shù)。 4、 霧滴的蒸發(fā)速率 提高 霧滴蒸發(fā)速率的方法：采用揮發(fā)性溶劑；提高“干燥氣”溫度和流速； 使用加熱金屬毛細(xì)管。,5、 氣相離子的產(chǎn)生 競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制表面活性高（最低溶劑化能）的離子優(yōu)先轉(zhuǎn)移至霧滴表面， 最 終轉(zhuǎn)變?yōu)闅庀嚯x子，故有較高的實(shí)驗(yàn)靈敏度。 1、 應(yīng)采用表面活性低的緩沖劑 2、 采用低濃度的揮發(fā)性酸、堿及緩沖鹽 3 、 用高純度的溶劑、試劑 4、 樣品應(yīng)作預(yù)處理，除去干擾物及鹽。,Atmospheric chemical ionization (APCI) 樣品溶液借助霧化氣的作用，噴入高溫（如500）蒸發(fā)器中，此時(shí)溶劑和溶質(zhì)均為蒸氣，由63

5、Ni放射源或放電電極產(chǎn)生低能電子使試劑氣，如N 2、O2、H2O、或溶劑B 等離子化，經(jīng)復(fù)雜的一系列反應(yīng)使溶質(zhì)產(chǎn)生正或負(fù)離子。 N2+e- N2+ +2e- A+BH + AH +B (質(zhì)子轉(zhuǎn)移） A+B + A + +B(電荷轉(zhuǎn)移） Na +, M+NH4+、M+Ac-、 M+Cl-等。,APCI ： 適用于小分子極性較低的化合物（醇、醚等）。 ESI ： 熱不穩(wěn)定或難于氣化的極性化合物。,ESI和APCI共同點(diǎn):1、使用高電壓元件和霧化氣噴霧法產(chǎn)生離子2、通常產(chǎn)生(M+H)+或(M-H)-等準(zhǔn)分子離子3、產(chǎn)生極少的碎片，但可以控制產(chǎn)生結(jié)構(gòu)碎片、非常靈敏的電離技術(shù)。,不同點(diǎn):1、生成離子的方

6、式不同，ESI：液相離子化；APCI：氣相離子化2、樣品兼容性ESI：極性化合物和生物大分子,多電荷離子。 APCI：非極性，小分子化合物（相對(duì)ESI而言）且有一定揮發(fā)性， 要產(chǎn)生的是單電荷離子 。,基體輔助激光解吸電離(MALDI),1988年，Hilenkamp 和Tanaka 發(fā)明，可將熱不穩(wěn)定分子完整地?cái)y帶進(jìn)入氣相的離子化技術(shù) 操作過程：樣品與基質(zhì)（1:100-50,000)均勻混合，點(diǎn)在樣品靶子上，空氣干燥，送入離子源。,基質(zhì)吸收激光能量-基質(zhì)離子碰撞樣品質(zhì)子化形成分子離子及分子離子的多聚體。,基體作用： 1 在選定波長(zhǎng)激光照射下，基體對(duì)激光能量有很強(qiáng)的吸收，而分析物一般只有很弱的吸

7、收。 2 基體對(duì)分析物起到溶劑的作用，減少了分析物分子間的相互作用，減少了分析物簇群形成可能性。 3由于基體濃度遠(yuǎn)高于分析物，因而確保了激光大部分能量被基質(zhì)吸收而最小限度地照射分析物。 4 基質(zhì)常為有機(jī)弱酸，作為質(zhì)子化試劑，在分析物離子的形成過程中具有重要作用。,LC-MS中的色譜技術(shù),20世紀(jì)80年代商品化，迅速成為應(yīng)用最廣泛的聯(lián)用技術(shù)。 LC-ESIMS靈敏度影響因素： 質(zhì)量型檢測(cè)器：響應(yīng)與待測(cè)組分的質(zhì)量流速成正比， 如FID、FPD。 濃度型檢測(cè)器： 檢測(cè)器響應(yīng)與流動(dòng)相中待測(cè)成分的濃度成正比。如 UV、TCD。 APCI ：質(zhì)量型檢測(cè)器-4.6mm i.d.色譜柱； ESI： 表觀行為為

8、濃度性檢測(cè)器-細(xì)徑色譜柱（mm i.d. 或更細(xì)）； 進(jìn)入噴霧器的質(zhì)量流速； 氣化樣品離子 離子化效率 可使用柱后分流，不會(huì)導(dǎo)致信號(hào)損失,LC-ESI MS技術(shù),2-25 m,純電噴霧 熔融二氧化硅,涂金,1nL 1 L/min,低流速：,LC-ESIMS流速選擇,毛細(xì)管液相色譜（Cap-LC)和毛細(xì)管電泳（CE)與MS在線聯(lián)用； 樣品量有限、靈敏度優(yōu)先考慮時(shí)使用：如肽圖譜測(cè)定,50-100 m,1 200L/min,氣動(dòng)輔助 （離子噴霧）,中等流速：,微柱液相色譜與MS在線聯(lián)用； 適合于既要高靈敏度又需要較大柱容量的工作：如藥物代謝定性定量分析（1.1mm),高流速：,氣動(dòng)輔助熱輔助,500

9、,200 2mL/min,霧滴周圍的溫度盡管有幾百度，但當(dāng)溶劑蒸發(fā)時(shí)，霧滴會(huì)冷卻，其溫度通常不超過 50，所以有機(jī)化合物不會(huì)熱降解 樣品量充足、可鑒定微量雜質(zhì)：.6mm i.d.,如何將HPLC 方法轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C-ESIMS,1、 緩沖劑 硫酸鹽、磷酸鹽及硼酸鹽醋酸銨、甲酸銨、三氟乙酸（TFA）、七 氟丁酸（HFBA）、氨水、氫氧化四丁基胺（TBAH)等代替 2、 pH 值 通常應(yīng)保持不變 3、離子對(duì)試劑 揮發(fā)性的如HFBA 、 TBAH，但保留時(shí)間有波動(dòng) 4、有機(jī)溶劑 基本匹配 5、色譜柱 離子交換柱（高離子強(qiáng)度）、蔬水相互作用色譜（鹽濃度梯度）,6、 柱后修飾 作用： 調(diào)節(jié)pH值以優(yōu)化正負(fù)離

10、子檢測(cè)； 添加異丙醇以利于含水溶劑的去溶劑化、稀釋緩沖鹽； 添加醋酸鈉（50mol/L)使缺乏或只有弱質(zhì)子化位點(diǎn)的樣品陽(yáng)離子化(a+) 填充毛細(xì)管柱色譜或毛細(xì)管電泳，需在柱后添加適當(dāng)溶劑（補(bǔ)足液流）以達(dá)到穩(wěn)定的噴 霧，以提高質(zhì)譜響應(yīng)。 裝置： 三通、輸液泵,LC-API MS中的質(zhì)譜技術(shù),ESI 和APCI 均為大氣壓離子化（API）技術(shù)，與經(jīng)典的離子源不同，需要有從大氣壓至真空的接口及離子傳輸?shù)妊b置。 1、電噴霧和高電壓的連接,2 、噴霧針的位置和去溶劑方法,帶電霧滴進(jìn)入質(zhì)譜儀會(huì)撞擊離子光學(xué)元件或質(zhì)量分析器，產(chǎn)生離子脈沖，在質(zhì)譜圖中出現(xiàn)尖峰信號(hào)。 ESI 霧滴的去溶劑可采用熱氮?dú)饬骰蚣訜崛?/p>

11、毛細(xì)管（防堵塞）等方法。,3 、大氣壓離子源與真空的連接-自由噴射膨脹,M Mach碟與取樣孔距離 D0 取樣孔 內(nèi)徑 p0 上游（大氣壓）的壓強(qiáng) p1 下游（真空）的壓強(qiáng),4、簇離子問題 產(chǎn)生：APIMS 與LC、CE 等聯(lián)用時(shí)，在離子源中有溶劑與水蒸氣，由于自由噴射膨脹 而迅速冷卻，極性分子將與離子簇合。,防止簇離子的產(chǎn)生-氣簾,剝離簇離子上的溶劑分子-碰撞誘導(dǎo)解離（collision induced dissociation, CID） 在取樣孔和取樣錐（或取樣孔和離子光學(xué)元件）之間加一電場(chǎng)，離子在電場(chǎng)作用下被加速。 簇合物與隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的背景氣碰撞而被“加熱”，可導(dǎo)致氫鍵的斷裂。 如果電場(chǎng)較高，不僅剝離溶劑分子，而且也導(dǎo)致樣品離子的裂解，這種由樣品離子生成 碎片離子的技術(shù)稱為源內(nèi)（in source )CID 。 分離大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì))時(shí),碰撞能分配在大量的振動(dòng)