《生化反應(yīng)工程實(shí)驗(yàn)》PPT課件.ppt

1、芽孢桿菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)及堿性磷酸水解酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?。掌握細(xì)胞反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究方法；將還原糖和生物質(zhì)的測定原理和方法結(jié)合起來。掌握酶促反應(yīng)速度的實(shí)驗(yàn)決定。4.掌握最大反應(yīng)速度rmax和米氏常數(shù)Km的測量方法。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)原理，對(duì)細(xì)胞的反應(yīng)：實(shí)驗(yàn)可以獲得不同T的基質(zhì)濃度Cs值和Cx值(細(xì)胞濃度)。動(dòng)力學(xué)參數(shù)KS，max需要。必須求出，測定時(shí)間區(qū)間T內(nèi)細(xì)胞濃度平均值。堿性磷酸水解酶堿性條件下磷酸單酯水解催化劑。酶催化反應(yīng)機(jī)理：可以推導(dǎo)出米氏方程：通過在不同基質(zhì)濃度CS中測定反應(yīng)速度R，可以確定rmax和Km。在510nm波長上非顏色地測量ODM值，以計(jì)算酶的活性(反應(yīng)速度R)。Na2HP

2、O4，H2O，堿性磷酸水解酶，特定pH，T，催化反應(yīng)：醌化合物(紅色)，AAP，鐵氰化鉀，OH，3種，培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)試劑和主要儀器，桿菌亞基(NH4)2so 41%；KCl 0.1%；CaCl 20.1 mmol/l；MgCl 21m mol/l:Na2 hpo 420mol/l；0.1%的酪蛋白水解溶于0.1mol/LTris-HCl緩沖區(qū)(pH7.4)。150ml三角瓶，每瓶50ml，115，滅菌30min，冷卻。(星期二下午)30.1mol/LTris-HCl緩沖(pH7.4)40.1mol/L pH8.8Tris-乙酸緩沖540mmol/L底物溶液60.5mol/L氫氧化鈉溶液70.3%

3、 5 DNS試劑甲苯12吸管，刻度管，容量瓶，濾紙，三角瓶，布漏斗，電子秤，恒溫水浴，搖床，干燥，721分光光度計(jì)4茄子試驗(yàn)方法和程序，1。種子液制備(半單位)枯草桿菌在固體斜培養(yǎng)基中激活后。連接8個(gè)裝有50ml Tris-培養(yǎng)基的150ml三角瓶，在30振動(dòng)下用種子液培養(yǎng)18h。(星期三下午2336030)，2。發(fā)酵液制備(組)包括上述培養(yǎng)的種子液50ml tris10個(gè)裝有培養(yǎng)基的150ml三角瓶，接種量5 (V: V)，37振動(dòng)中0h，1h，表1發(fā)酵動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，3枯草桿菌堿性磷酸酶的制備，2瓶種子液，酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，反應(yīng)前：反應(yīng)后：酶活性(單位)=OD5101000=(OD510

4、反應(yīng)后OD510反應(yīng)前)1000，r是酶活性。氣質(zhì)濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響rmax和Km的測定，13個(gè)試管，編號(hào)，根據(jù)下表正確操作。用空管零，510nm波長比色測定A510nm。5實(shí)驗(yàn)結(jié)果，1 .發(fā)酵動(dòng)力學(xué)確定，發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，制作，確認(rèn)max和Ks。決定發(fā)酵動(dòng)力學(xué)。2 .氣質(zhì)濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響rmax和Km的測量，酶促反應(yīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，在坐標(biāo)紙上制作1/r1/CS圖，得出Km和rmax值。3，5二硝基水楊酸比色法(DNS方法)在還原糖、附錄1，1，1原理、一定范圍內(nèi)，還原糖的數(shù)量與褐色紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比，在540nm波長上測定光密度值，可以通過調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)曲線得出還原糖的數(shù)量。2試

5、劑，1。3，5二硝基水楊酸試劑(DNS試劑)2。1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液體，7個(gè)25ml刻度試管，編號(hào)，下表操作。2 .建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將上述各寬容液均勻混合后，在540nm波長下用空寬容液調(diào)節(jié)0，以測量吸光度值。以光密度值為橫坐標(biāo)，以葡萄糖毫克數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以10個(gè)試管為例，按表格操作。均勻混合各管后，測定各管的光密度。用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的空管溶液調(diào)節(jié)0。，3 .糖的測定，每杯濃度(mg/ml)=每還原毫克數(shù)/0.3，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中闡明相應(yīng)的還原糖含量，并根據(jù)下面的公式計(jì)算發(fā)酵液每杯濃度。菌體(CX)測量：附錄2，生物量測量方法有濁度法和直接計(jì)量法等。本實(shí)驗(yàn)兩組采用濁度法，兩組直接采用計(jì)量

6、法。比濁法是根據(jù)菌顯液的透光量間接測定細(xì)菌數(shù)。細(xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與光密度成正比，因此可以用色度計(jì)測定菌液的光密度(OD值)，表示樣品菌液濃度。具體操作：將培養(yǎng)0 h，1h，2h，2.5h，3h，3.5h，4h，4.5 h，5h，5.5 h的菌懸浮液均勻搖晃，以560nm波長的0D值測定為CX。使用未接種的培養(yǎng)基作為空對(duì)照組。1 .濁度法、牙齒法分為濕重法和干重法。干重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)過濾(或離心)后，在105烤箱中烘干至恒重(11.5hr)，冷卻至室溫，稱重。具體操作：首先將干燥的濾紙重量放在W1(g)、發(fā)酵液過濾、上清液保存在冰箱里進(jìn)行糖濃度測定，從菌體和濾紙105烤到恒重，然后叫濾紙及菌體重量，用W2(g)標(biāo)記，按下式計(jì)算菌體生