HPLC實驗步驟和方法開發(fā)ppt課件.ppt

1、液相色譜的應(yīng)用以及方法開發(fā),1,提綱：,一.HPLC的廣泛應(yīng)用 二.方法開發(fā)過程 一）選擇HPLC檢測器 二）分配色譜及選擇流動相 三）方法開發(fā)的具體步驟 四）梯度洗脫方法,2,一.HPLC的廣泛應(yīng)用,據(jù)2004年統(tǒng)計，世界上化合物總數(shù)多達4700多萬種 在全部有機化合物中僅有20左右的樣品適用于GC分析 而HPLC可對80左右的有機化合物進行分離和分析,3,HPLC的廣泛應(yīng)用,HPLC特別適用于高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的化合物以及生物活性物質(zhì)的分離和分析并且可以做制備 在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、生命科學(xué)、化工、環(huán)保等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用潛力。,4,HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域,在食品研究中的分析應(yīng)

2、用 食品中的天然成分 碳水化合物 類脂化合物、甘油三酸酯、膽固醇 脂肪酸和有機酸 蛋白、肽、氨基酸 食品添加劑 酸味劑、甜味劑、香精、乳化劑 抗氧化劑、防腐劑 顏料和染料（色素 維生素 污染物 霉菌（黃曲霉毒素 農(nóng)藥殘留和獸藥殘留 多環(huán)芳烴（PAHS和亞硝酸,5,HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域,在醫(yī)藥研究中分析應(yīng)用 藥物分析有USP、BP、CP等標準 常用藥物研究中的應(yīng)用：解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類消炎藥等。 甾體藥物研究中的應(yīng)用：腎上腺皮質(zhì)激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。 抗菌素類藥物研究中的應(yīng)用：青霉素、頭孢菌素、慶大毒素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星等。 中草藥研究中的應(yīng)用：生物堿

3、、甙類(皂甙、強心甙、黃酮甙等)、萜類 手性藥物研究中的應(yīng)用：光學(xué)異構(gòu)體的拆分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構(gòu)體毒性很強) 醫(yī)療藥物的檢測、新藥研究、藥物代謝、藥代動力學(xué)研究。 在獸藥研究中分析應(yīng)用,6,HPLC 的應(yīng)用領(lǐng)域,在生物化學(xué)和生物工程中的應(yīng)用 氨基酸、多肽合成和蛋白質(zhì)的分析研究 核堿、核苷、核苷酸和核酸的分析研究 生物胺的分析研究（兒茶酚胺類) 在精細化工分析中的應(yīng)用 醇、醛和酮、醚的分離分析 酸和酯的分離分析 表面活性劑的分析 聚合物的分析研究 藥物、農(nóng)藥、染料、炸藥等工業(yè)產(chǎn)品,7,HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域,化妝品行業(yè)要控制和分析： 防腐劑、防曬劑、性激素以及維生素等； 在公安、刑

4、警破案工作需要 投毒藥物、毒品分析等 在環(huán)境污染分析中的應(yīng)用 廢氣、廢水、廢渣中多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、農(nóng)藥殘留、酚類和胺類的檢測,在無機離子分析中應(yīng)用 飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽離子分析,8,二.方法開發(fā)的過程,Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 2,9,第一步干什么?,想辦法得到各種信息 向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方法 查文獻和方

5、法，如CA,AA,AOAC,EPA- 儀器制造商的文獻，如Dionex,Waters 對色譜柱有足夠的了解 掌握分離機理，自己開發(fā)方法 充分了解您自己的樣品,10,分析時要了解哪方面的情況？,靈敏度的要求有多高? 樣品的本底是否很復(fù)雜? 有多少組份要分析? 對分析的精確度、準確度等有多高要求? 是否因是日常檢驗，而要求方法容易使用?,11,分離(制備)時要了解哪方面的情況？,要分離（即制備）的樣品量有多大? 要分離的組份在樣品中的含量很高? 還是微量? 是否需要保持生物活性? 對分離產(chǎn)物純度的要求有多高? 純度或活性的鑒定如何完成?,12,使用文獻方法注意點,色譜柱填料的種類、品牌是否相同?

6、注意文獻方法的流動相 是否損害色譜柱? 如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動相 注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長 需要調(diào)整流速、進樣量 注意梯度條件 了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）,13,一）選擇HPLC檢測器,對樣品有響應(yīng)并有一個輸出信號 應(yīng)該提供在檢測器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計的校正技術(shù)應(yīng)該促進這種關(guān)系 但是： 由于受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響會產(chǎn)生響應(yīng)與濃度之間關(guān)系的與線性偏離現(xiàn)象 并不是所有的檢測器是線性的 受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響，檢測器的表現(xiàn)可能與其最佳水平有較大的差距,14,用于HPLC的檢測器,沒有任何一種單獨的檢測器可以適應(yīng)所有的液相色譜分離！ HPLC檢測器可以分

7、為： 溶質(zhì)性質(zhì)檢測器（選擇型） 對溶質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)，一般不反應(yīng)流動相的變化（選擇型） 整體性質(zhì)檢測器（通用型） 不管是否有溶質(zhì)，對流動相任何物理性質(zhì)的變化作出響應(yīng)（通用型）,15,理想的HPLC檢測器,高靈敏度；可忽略的基線噪音 寬的線性范圍 獨立于流動相及操作參數(shù)的響應(yīng) 對壓力、溫度及流速等變化不敏感 長時間操作的穩(wěn)定性 低死體積 非破壞性 選擇性,16,靈敏度：信噪比,靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N） 檢測限（LOD）：S/N = 3 定量限（LOQ）：S/N = 10 好的信噪比有利于： 更好的色譜峰確認 更好的定量 更好地完成色譜峰純度/均一性,6:1

8、,N,S,17,選擇液相色譜的檢測器,要考慮的因素： 你要分離的化合物/樣品的化學(xué)特性 化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量及紫外光譜等等 流動相的影響（溶劑、緩沖鹽改性劑等） 梯度還是等度 靈敏度需求 是否有雙檢測的需求,18,選擇液相色譜的檢測器,通用檢測器 RI ELSDMS 靈敏度ugngpg 線性范圍104否103 流速敏感是否是 溫度敏感是否否 破壞性否是是,選擇性檢測器 ABSFLEC Cond MS 靈敏度ngpgfgpgpg 線性范圍105103106105103 流速敏感否否是是是 溫度敏感否否是是是 破壞性否否是否是,19,吸光度（ UV/Vis）檢測原理,原理：基于被分析組分對特定波長紫外

9、光的選擇性吸收 定量基礎(chǔ)：比耳定律，AKCL 優(yōu)點：1）對溫度和流速不敏感 2）可用于梯度洗脫 3） 靈敏度較高，ng級檢測 缺點：選擇性檢測器，僅適用于測定有紫外吸收的物質(zhì),20,吸光度（ UV/Vis）檢測的應(yīng)用,大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度，可以測定大多數(shù)的化合物，是目前實驗室中使用最多的檢測器 -多數(shù)公司售出的檢測器中75%以上是吸光度檢測器（其中50%以上是紫外/可見檢測器，25%是PDA）,21,背景吸收的影響,背景吸收降低了線性范圍 多數(shù)流動相有紫外吸收,22,光電二極管矩陣（Photo Diode Array）,Photo Diode Array 簡稱：PDA或DAD,2

10、3,光電二極管矩陣檢測器（ PDA ）的特點和用途,一種三維水平的吸光度檢測器-采集三維譜圖 兼顧紫外檢測器及可見分光光度計的信息 在收集色譜圖的同時，得到光譜圖 提供許多有用的功能 -色譜峰的純度鑒定，色譜峰的確認 -可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時未測到的峰 -任意波長的色譜再處理 -光譜信息-光譜庫的建立檢索和擬合,24,熒光（Fluorescence）檢測原理,原理：發(fā)熒光的化合物吸收光（UV或VIS）使其分子達到激發(fā)態(tài)，當其返回到基態(tài)時發(fā)射光的現(xiàn)象即熒光 優(yōu)點：熒光檢測器靈敏度高, pg級檢測 缺點：不是所有化合物都有熒光，必要時需要衍生,熒光檢測器原理,26,熒光檢測器的應(yīng)用,環(huán)境中的污染物

11、多環(huán)芳烴(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等 食品、飲料 食品中的毒素；例如：黃曲霉毒素 染料 維生素及衍生氨基酸 生物技術(shù)及制藥,氨基甲酸酯類殺蟲劑,黃曲霉毒素,多環(huán)芳烴（PAH）,維生素,27,示差折光（Refractive Index）檢測,示差折光檢測器（RI）是第一個商品化的液相色譜檢測器（上世紀六十年代末、七十年代初） 通常被認為是一種通用檢測器 檢測溶液中所有被溶解的溶質(zhì) 非特異性 任何光學(xué)介質(zhì)的折光率都被定義為光在該介質(zhì)中與真空中的速度之比值,28,示差折光（RI ）檢測 的原理,原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率來測定試樣 各組分濃度。 優(yōu)點：通用型檢測器 缺點： 1）對溫度變化敏感

12、 2）不能用于梯度檢測 3）靈敏度低，ug級檢測,返回,29,示差檢測器的應(yīng)用,示差折光檢測器是通用型檢測器,如果選擇合適的溶劑，幾乎所有的物質(zhì)都可以檢測 特別適用于檢測沒有紫外吸收的化合物,例如糖類,醇類,酯類以及脂肪酸等 高分子化合物GPC,GFC分析以及復(fù)雜樣品純化,30,蒸發(fā)光散射（ELSD）原理,用氮氣把流動相吹成細霧狀 流動相的液滴通過一個預(yù)加熱的腔體后被蒸發(fā)掉 蒸發(fā)的溶劑被從檢測器中除去 溶質(zhì)的揮發(fā)性小于流動相，因此產(chǎn)生顆粒束與光束相交 被顆粒散射的光由光電倍增管（PMT）收集 PMT的輸出與溶質(zhì)的存在量呈比例關(guān)系,31,ELSD 優(yōu)點及應(yīng)用領(lǐng)域,通用型 比流動相揮發(fā)性小的物質(zhì)都

13、能被檢測 可以作梯度實驗； 檢測下限可到納克級水平 對環(huán)境條件不敏感；可以使用有強紫外吸收的溶劑作流動相 應(yīng)用領(lǐng)域： 碳水化合物 油脂及脂肪酸 未衍生的氨基酸 制藥行業(yè) 表面活性劑 天然產(chǎn)物,32,ELSD 缺點,不能使用不揮發(fā)性的流動相（例如：磷酸鹽） 要求使用霧化氣源（典型的是氮氣或空氣） 不同的色譜條件下霧化及除溶劑的參數(shù)需要重新優(yōu)化 破壞性技術(shù) 蒸發(fā)出的溶劑要引到戶外或通風(fēng)櫥里 對揮發(fā)性化合物的檢測不理想 一般得到的是非線性校正曲線 某些化合物的檢測靈敏度不如其他檢測器,33,二）色譜基本分類,色譜基本分類： 按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)可以分為： 1.分配色譜分配系數(shù)

14、* 2.親和色譜親和力 3.吸附色譜-吸附力 4.離子交換色譜離子交換能力 5.凝膠色譜（體積排阻色譜）-分子大小引起的體積排阻,34,分配色譜,分配色譜分為： 正相色譜：固定相（填料）為極性，流動相為非極性 反相色譜：固定相（填料）為非極性，流動相為極性。 用得最多，約占60-70% 相對應(yīng)的色譜柱： 反相柱：烷基硅烷鍵合硅膠填料，如C18（ODS） C8,C4,C3，苯基等 正相柱：典型的為硅膠柱，其它官能團為-CN氰基， -NH2氨基等,35,分配色譜的分離機理,36,分配色譜概述,反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離 洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫,37,流動相極性,38,

15、流動相洗脫強度,反相色譜最常用的流動相及其洗脫強度： 水 甲醇乙腈 乙醇丙醇異丙醇四氫呋喃 最常用的流動相組成“甲醇-水；乙腈-水” 正相色譜最常用的流動相及其洗脫強度： 正己烷乙醚乙酸乙酯異丙醇 *應(yīng)用添加劑，成為離子對、離子抑制方法,39,流動相的選擇原則,樣品易溶，且溶解度盡可能大 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱子 不妨礙檢測器檢測，所選波長處無吸收 * 黏度低，流動性好 * 無毒或低毒，易于操作 易于從其中回收樣品 易于制成高純度，即色譜純 廢液易處理，不污染環(huán)境,40,三）方法開發(fā)的具體步驟,先用一根短的色譜柱 用相對較高的流速 使用盡可能純度高的標準品 先用高強度的洗脫液 調(diào)節(jié)k 值改變保

16、留值 調(diào)節(jié)a值改變選擇性 通過改變流動相的pH值，使樣品成中性 加入“對離子”，使樣品呈中性 調(diào)節(jié)柱長度改變柱效及分離速度,41,反相色譜的方法開發(fā),開發(fā)過程實例 色譜條件 色譜柱：C18，4.6mm15mm 流動相：乙腈/水，乙腈從100%逐漸降低（或走梯度） 舉例中用不同的溶劑強度，60/40、50/50、40/60，由強漸弱 流速：1ml/min 樣品： 對羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 對羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 對羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben),42,1.改變?nèi)萘恳蜃?K,譜圖,43,2.調(diào)節(jié)值改變選擇性,同樣強度的不同溶劑，改變了

17、流動相值 改變色譜柱,44,離子型化合物的色譜分離,離子型化合物的分離方式 多數(shù)化合物是離子型的！ 使用離子交換柱：離子交換法 主要用于“強”陰、陽離子 使用反相柱 離子抑制色譜法：通過改變流動相的pH值，使樣品成中性 離子對色譜法：加入“對離子”，使樣品呈中性,45,3.離子抑制色譜,離子型化合物在反相色譜柱上不保留 改變流動相的pH值，抑制樣品離子的電離使樣品成中性 適用于弱酸性化合物的分離 加入TFA,磷酸鹽等降低流動相的pH值，使樣品降低離子化 使用硅膠基質(zhì)C18填料 使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi) 硅膠柱的pH在2-8（較保險值3-7）內(nèi),46,離子抑制色譜實例,而在乙腈/水并且pH=

18、7時，多數(shù)組份保留時間很短，無法完全分離。,離子抑制色譜的使用范圍,下列情況下不能使用離子抑制方法，如果： 一些酸在pH低于2時還保持離子化 一些堿在pH高于7時還保持離子化 可以有以下的選擇 離子交換色譜 使用聚合物或其他耐堿性流動相的反相柱，在pH高于7時用離子抑制法 使用“離子對色譜法”,48,4.離子對色譜法,在反相色譜流動相內(nèi)加入“離子對”試劑 與樣品中可電離的組份形成“對離子” 在反相色譜柱上分離離子型化合物 離子對試劑的類型 季銨鹽、叔胺鹽 （正離子），適用于弱酸 烷基磺酸鹽、高氯酸鹽（負離子），適用于弱堿 烷基長度不同，形成對離子的能力不同,49,離子對色譜機理,50,離子對色

19、譜的應(yīng)用,抗組胺及減充血劑藥物的分析,51,離子對色譜分析水溶性維生素,52,用離子對、還是用離子抑制方法？,53,方法開發(fā)的其他因素,流速對柱效的影響 不同內(nèi)徑的色譜柱有自己的最佳流速 樣品的進樣量(濃度)對柱效的影響 樣品的進樣體積對柱效的影響 溶劑粘度對柱效的影響 以上因素均影響分離度,54,色譜方法轉(zhuǎn)換,如果沒有與文獻或要求相近的色譜柱 轉(zhuǎn)換進樣量 轉(zhuǎn)換流速,55,四）液相色譜方法開發(fā),梯度洗脫方法,56,在這一部分您將學(xué)習(xí):,關(guān)于梯度洗脫過程及其優(yōu)點. 如何優(yōu)化梯度分離. 有關(guān)梯度分離的一些實用考慮.,57,液相色譜泵,穩(wěn)定平滑并且重現(xiàn)性好的流速 可靠且充分的溶劑混合 準確及重現(xiàn)的自

20、動溶劑混合 準確及重現(xiàn)的梯度形成 有效的流速范圍 制備色譜或微柱、窄柱色譜要考慮 滯后體積 梯度分析更為關(guān)注 目的：在任何情況下保持最高精度,58,梯度的洗脫方式,高壓梯度及低壓梯度,59,梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響,注意滯后體積包括進樣器、阻尼 器、混合器及其管路,60,梯度滯后大小的影響,滯后體積太大會引起梯度變化的延遲 例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min 實際梯度會比設(shè)置值晚 2 分鐘響應(yīng)，沒有問題 對微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min 實際梯度會比設(shè)置值晚20 分鐘響應(yīng)，不能接受 滯后體積的不同會使方法轉(zhuǎn)換麻煩 滯后體積比文獻大或小都會使方法不能重現(xiàn) 滯后體

21、積的變化會導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好 普通分析型液相色譜的滯后體積為14ml（戴安的4元泵700l，高壓泵400l ）,61,滯后體積變化的影響,設(shè)計不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化 滯后體積隨反壓變化的后果： 梯度的準確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好 用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性,色譜柱反壓變化對梯度實驗的影響,P680A LPG without pulse damper Back-pressure:60 bar, 85 bar and 105 bar Variation: 1%,Pump with pulse damper Back-pressure:60 bar, 85

22、 bar and 105 bar Variation: 2%,Acclaim 120, C18, 5 m, 4.6 x 100 mm; 0.5 mL/min; 25C; 5 L injection volume; UV detection at 256 nm; Eluent (A) Water and (B) Acetonitril; Gradient: 30 % b to 100 % B in 10 min; Methyl-, Ethyl-, Propyl- and Butylparabene, 10 mg/L each,63,梯度洗脫的特點,優(yōu)點 縮短分析時間 增加分離能力 檢測靈敏度提高

23、 缺點 儀器設(shè)備要求高 不適合某些檢測方式(RI) 柱需再生平衡 定量分析的重復(fù)性較低？,64,一般流出問題,早流出峰的分離度差. 遲流出峰的峰寬增加而峰高降低. 由于k范圍寬，所以分析時間長. 強保留組分造成柱污染.,等梯度洗脫 - 在洗脫樣品的整個過程中，流動相的組成保持不變.,65,Analytical Education Center,H5929A 11-09,梯度洗脫 - 一個解決方案,梯度洗脫 - 在分離過程中改變流動相組成.,66,梯度運行中發(fā)生了什么?,67,梯度方法開發(fā)- 優(yōu)化溶劑梯度,您必須確定: 有機溶劑 初始組成 梯度時間 梯度陡度 梯度形狀,流速 柱長 柱重新平衡時間,68,選擇梯度陡度,陡,平緩,69,梯度形狀,%B,time,線性,步進,凹形,凸形,70,Analytical Education Center,線性梯度,對下列每種情況，您認為使用哪種梯度曲線能改善分離?,線性梯度,線性梯度,選凹形梯度曲線,用步進梯度或流速梯度,選凸形梯度曲線,71,梯度平衡時間的影響（一