種子的擴大培養(yǎng)及滅菌.ppt

1、種子擴大培養(yǎng)的目的與要求,種子制備實例,種子制備的技術(shù)概要,種子的擴大培養(yǎng),種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。,種子擴大培養(yǎng)的概念:,種子的擴大培養(yǎng),種子擴大培養(yǎng)的目的與要求,種子擴培的目的,接種量的需要,菌種的馴化,縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平,種子的要求：,總量及濃度能滿足要求,生理狀況穩(wěn)定,活力強，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長,無雜菌污染,種子的擴大培養(yǎng),種子擴大培養(yǎng)的目的與要求,一、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備,制備過程,斜面菌種,一級種子培養(yǎng),二級種子

2、培養(yǎng),發(fā)酵,種子的擴大培養(yǎng),種子擴大培養(yǎng)的目的與要求,1、斜面 (谷氨酸棒桿菌AS1.299),培養(yǎng)基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化鈉 0.5 瓊脂 2%， pH 7.0-7.2,培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細,培養(yǎng)條件：32，生長18-24小時,生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過 3次,種子的擴大培養(yǎng),種子擴大培養(yǎng)的目的與要求,2. 一級種子（搖瓶）,培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32培 養(yǎng)12小時。,培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿 2.5%， K2HPO4 0.1%,培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基 本接近于

3、發(fā)酵培養(yǎng)基,種子的擴大培養(yǎng),種子擴大培養(yǎng)的目的與要求,3. 二級種子(種子罐),培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%(10%)），32培養(yǎng)7-10個小時,培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%,培養(yǎng)基的特點：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基,種子的擴大培養(yǎng),種子擴大培養(yǎng)的目的與要求,種子的質(zhì)量要求：,108-109個/ml 大小均勻，呈單個或八字排列 PH 7.0-7.2時結(jié)束 活力旺盛,種子的擴大培養(yǎng),種子擴大培養(yǎng)的目的與要求,一、種子制備的過程,1-砂土孢子；2-冷凍干燥孢子；3-斜面孢子；4-搖瓶液體培養(yǎng)；5-茄子瓶斜面培養(yǎng)；6-固體培養(yǎng)基培養(yǎng)；7、8-種子罐培

4、養(yǎng)；9-發(fā)酵罐,種子的擴大培養(yǎng),種子制備的技術(shù)概要,二、實驗室階段,1、培養(yǎng)物選擇的原則,目的：種子擴培到一定的量和質(zhì)，根據(jù)菌種的特點，最終培養(yǎng)物可分為兩類：,對于不產(chǎn)孢子和芽孢的微生物 獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體,種子的擴大培養(yǎng),種子制備的技術(shù)概要,獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子,孢子培養(yǎng)步驟少，因而更容易獲得量和質(zhì)穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。,對于產(chǎn)孢子的微生物,獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體,便于操作，但需要更仔細的控制。,種子的擴大培養(yǎng),種子制備的技術(shù)概要,二、實驗室階段,2、培養(yǎng)基選擇的原則,培養(yǎng)基的選擇應該是有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應該是有利于孢子的生長。,在原料方面，實驗室種子培養(yǎng)階段，規(guī)

5、模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細。,種子的擴大培養(yǎng),種子制備的技術(shù)概要,二、實驗室階段,三、生產(chǎn)車間階段,1、培養(yǎng)物的選擇原則,在生產(chǎn)車間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體。,縮短發(fā)酵時間,有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果,菌絲體比孢子要有利：,種子的擴大培養(yǎng),種子制備的技術(shù)概要,2、培養(yǎng)基選擇的原則,目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，因此培養(yǎng)基的選擇應首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長，所以營養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。,在原料方面：不如實驗室階段那么精細，而是基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個方面的原因: 一是成本 二是馴化,種子的擴大培養(yǎng),種子制備的技術(shù)概要,三、生

6、產(chǎn)車間階段,例：檸檬酸發(fā)酵,以蔗糖為原料,成分 斜面 種子罐 發(fā)酵 麥芽汁 麥汁 蔗糖 2.5-5% 20% NH4NO3 0.225% 0.11% K2HPO4 0.03% MgSO4.H2O 0.025% 0.025% KCl 0.015% 瓊脂 2%,種子的擴大培養(yǎng),種子制備的技術(shù)概要,3、發(fā)酵級數(shù)的確定,谷氨酸：三級發(fā)酵,一級種子（搖瓶）二級種子 （小罐）發(fā)酵,青霉素：三級發(fā)酵,一級種子 （小罐）二級種子（中罐）發(fā)酵,一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù),種子的擴大培養(yǎng),種子制備的技術(shù)概要,三、生產(chǎn)車間階段,發(fā)酵級數(shù)確定的依據(jù),級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌

7、體生長特性、接種量的影響,級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一 般2-4級。,在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應級數(shù)的確定是非常重要 的一個方面,種子的擴大培養(yǎng),種子制備的技術(shù)概要,三、生產(chǎn)車間階段,4、接種量的確定,移入種子的體積 接種量 接種后培養(yǎng)液的體積,過大過小都不好，最終以實踐定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認為大一點好。,種子的擴大培養(yǎng),種子制備的技術(shù)概要,三、生產(chǎn)車間階段,5、種齡,種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。,種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。,原則：對數(shù)生長期末，細胞活力強，菌體濃度相對較大，但是最終由實驗結(jié)果定。,種子的擴大培養(yǎng)

8、,種子制備的技術(shù)概要,三、生產(chǎn)車間階段,舒琴， 林產(chǎn)化學與工業(yè)，2004,種子的擴大培養(yǎng),種子制備的技術(shù)概要,6、種子的質(zhì)量要求：,量：要求達到一定的濃度,質(zhì): 形態(tài) （生長處于某個階段、均勻等等） 理化指標：C、N、P的含量，pH 酶活等,無污染,種子的擴大培養(yǎng),種子制備的技術(shù)概要,三、生產(chǎn)車間階段,滅 菌,污染雜菌的危害 防止雜菌污染的措施 滅菌的方法 培養(yǎng)基的濕熱滅菌 空氣的除菌,1、污染雜菌的危害,使生物化學反應的基質(zhì)或產(chǎn)物消耗，造成產(chǎn)率下降； 雜菌所產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物，或染菌后發(fā)酵液的某些理化性質(zhì)的改變，使產(chǎn)物的提取變得困難，造成收得率降低或產(chǎn)品質(zhì)量下降； 雜菌可能會分解產(chǎn)物； 雜菌

9、大量繁殖，會改變反應介質(zhì)的pH，使生化反應發(fā)生異常變化； 發(fā)生噬菌體污染。,2、防止雜菌污染的措施,設(shè)備滅菌并確保無泄漏 所用培養(yǎng)基必須滅菌 通入的氣體應經(jīng)除菌處理 種子無污染，確保純種 培養(yǎng)過程中加入的物料應經(jīng)滅菌處理，并在加入過程中確保無污染,3、滅菌的方法,化學滅菌 射線滅菌 干熱滅菌 濕熱滅菌 過濾除菌,滅菌：用物理或化學的方法殺滅或去除物料或設(shè)備中 一切有生命物質(zhì)的過程。應用的范圍有培養(yǎng)基滅菌； 氣體除菌；設(shè)備及管道滅菌等。,化學滅菌,一些化學試劑能使微生物中的蛋白質(zhì)、酶及核酸發(fā)生反應而具有殺菌作用。 常用的化學藥劑有甲醛、氯、高錳酸鉀、環(huán)氧乙烷、季銨鹽、臭氧等。 化學藥劑也會與培養(yǎng)

10、基中的一些成分作用，而且加入后不易除去，一般不用于培養(yǎng)基的滅菌。,射線滅菌,即利用紫外線、高能電磁波或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的射線進行滅菌的方法。 波長為（2.1-3.1）10-7m的紫外線具有滅菌作用，最常用的波長是2.53710-7m但紫外線穿透能力低，僅用于表面消毒和空氣的消毒。,干熱滅菌,常用的干熱條件為在160下保溫1h，滅菌效果不如濕熱滅菌。 一般要求保持干燥的實驗器具和材料（培養(yǎng)皿、接種針、固定化細胞用的載體材料等）可用干熱滅菌。,濕熱滅菌,即利用飽和水蒸氣進行滅菌。 蒸氣有很強的穿透力，在冷凝時放出大量冷凝熱，很容易使蛋白質(zhì)凝固而殺滅各種微生物。同時，整齊價格低廉，來源方便，滅菌效果可

11、靠。 培養(yǎng)基滅菌、發(fā)酵設(shè)備及管道滅菌、實驗用器材的滅菌，普遍采用濕熱滅菌。 通常的滅菌條件是在121維持30min。,過濾除菌,即利用過濾方法截留微生物，達到除菌的目的。 本法只適用于澄清流體的除菌。 工業(yè)上利用此法大量制備無菌空氣，供耗氧微生物的深層培養(yǎng)使用。 熱敏性培養(yǎng)基也采用過濾方法來除菌。 產(chǎn)品提取過程中，也可用此法處理料液，獲得無菌產(chǎn)品。,4、培養(yǎng)基的濕熱滅菌,微生物的死亡速率,濕熱滅菌時，培養(yǎng)基中的微生物受熱死亡的速率與殘存 的數(shù)量成正比，即：,式中，N為培養(yǎng)基中活微生物的個數(shù)；,為微生物受熱時間，s,K為比死亡速率，s-1,4、培養(yǎng)基的濕熱滅菌,理論滅菌時間,Ns為滅菌結(jié)束時培養(yǎng)

12、基中活微生物數(shù)，一般取0.001個， 即滅菌失敗的概率為千分之一。 N0為滅菌開始時培養(yǎng)基中活微生物數(shù)，可以參考一般培 養(yǎng)基中活微生物數(shù)為每毫升（12）x107個。,4、培養(yǎng)基的濕熱滅菌,即將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他容器中，通入蒸氣將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起滅菌的操作過程，也稱實罐滅菌。 過程包括升溫、保溫（121，30 min)和降溫三個階段，滅菌主要在保溫過程實現(xiàn)。 顯著缺點是對培養(yǎng)基成分破壞大、升降溫時間長。,培養(yǎng)基的分批滅菌,4、培養(yǎng)基的濕熱滅菌,將配制好的培養(yǎng)基在通入發(fā)酵罐前進行加熱、保溫、降溫的滅菌過程，也稱之為連消。 連續(xù)滅菌時，培養(yǎng)基在短時間內(nèi)被加熱到滅菌溫度（130140）

13、，短時間保溫后（58 min),被快速冷卻，再進入早已滅菌完畢的發(fā)酵罐。 以高溫、快速為特征，具有對培養(yǎng)基破壞小，可以實現(xiàn)自動控制、提高發(fā)酵罐的設(shè)備利用率、蒸汽用量平穩(wěn)等優(yōu)點。,培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌,5、空氣的除菌,流量：連續(xù)提供一定流量的壓縮空氣，單位時間（min)單位體積（m3)培養(yǎng)基中通入標準狀況下空氣的體積（m3)一般為0.10.2。 壓強：表壓為0.20.4MPa. 進入過濾器前，相對濕度70%，以防止過濾介質(zhì)受潮。 溫度可比培養(yǎng)溫度高1030 。 潔凈指標：每立方米空氣中，塵埃粒子數(shù)最大允許值0.5m的為3500， 5m的為0，微生物最大允許數(shù)為5個浮游菌/m3,1個沉降菌/m3,發(fā)酵

14、用無菌空氣的質(zhì)量標準,發(fā)酵廠所使用的空氣除菌流程，隨各地的氣候條件及設(shè)備條件不同而有很大的差別。 要保持過濾器有比較高的過濾效率，應維持一定的氣流速度和不受油、水的干擾。氣流速度可由操作來控制；要保持不受油、水干擾則要有一系列冷卻、分離、加熱的設(shè)備來保證空氣的相對濕度在5060的條件下過濾。,5、空氣的除菌,空氣除菌流程,流程的特點是：兩次冷卻，兩次分離，適當加熱。傳熱系數(shù)高，節(jié)約冷卻用水，油水分離較完全。此流程適合潮濕地區(qū)。,1、兩級冷卻、分離、加熱的空氣過濾除菌流程,第一級冷卻到30-35，第二級冷卻到20-25 。,2、冷熱空氣直接混合式空氣過濾除菌流程,特點：可省第二冷卻分離設(shè)備和空氣再加熱設(shè)備，流程比較簡單，冷卻水用量較少，利用壓縮空氣的熱量來提高空氣溫度。此流程適合中等濕含量地區(qū)。,3、高效前置過濾除菌流程,特點：無菌程度高,5、空氣的除菌,粗過濾器：攔截空氣中較大的灰塵以保