熒光顯微鏡的基本使用方法ppt課件

1、細胞生物學(xué)實驗,熒光顯微鏡的基本使用方法,1,實驗?zāi)康?1. 了解熒光顯微鏡的基本原理； 2. 掌握熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和使用注意事項；,2,自發(fā)性熒光物質(zhì),神經(jīng)細胞和心肌細胞等內(nèi)的脂褐素呈棕黃色熒光。 肝貯脂細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞內(nèi)的維生素A呈綠色熒光。 某些神經(jīng)內(nèi)分泌細胞和神經(jīng)纖維內(nèi)的單胺類物質(zhì)（兒茶酚胺、5羥色胺、組胺等）在甲醛作用下呈不同顏色的熒光。 組織內(nèi)含有的奎寧、四環(huán)素等藥物也呈現(xiàn)一定的熒光。 嗜中性粒細胞中脫氫酶輔酶呈現(xiàn)一定的熒光。,3,4,優(yōu)點： 檢出能力高 對細胞的刺激小 能進行多重染色 用途： 物體構(gòu)造的觀察 熒光的有無、色調(diào)比較進行物質(zhì)判別 發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、

2、定量分析,熒光顯微鏡的優(yōu)點和用途,5,實驗原理,光源,激發(fā)濾色鏡,分色鏡,發(fā)射濾色鏡 （阻擋濾片）,6,實驗原理,熒光顯微鏡的光路及主要部件,光源 激發(fā)光擋片 激發(fā)濾色鏡 分色鏡 發(fā)射濾色鏡,7,8,Microscopes with an upright-style frame are capable of producing fluorescence illumination either through episcopic or diascopic optical pathways, although the latter is rarely used today. Epi-illumin

3、ators usually consist of a mercury or xenon lamphouse coupled to a vertical illuminator that is positioned above the main frame in a separate assembly. The microscope nosepiece and transmitted light components (diascopic illuminator, condenser, field diaphragm, filters, etc.) are built into the main

4、 frame, while fluorescence components are housed in the vertical illuminator. These illuminators often contain a revolving or sliding turret that houses four to six cubes that contain a mixture of interference filters including a barrier filter, dichroic mirror, and an excitation filter. As illustra

5、ted above, light emitted from the lamp positioned in the episcopic lamphouse passes through a collector lens and then the field and aperture diaphragms before entering the first interference filter in the cube set, the emission filter. This light is then directed through the objective and onto the s

6、pecimen by a special dichroic mirror that reflects certain wavelengths while passing others. Secondary fluorescence, emitted by fluorophores residing in the specimen, travels back through the objective and the dichroic mirror before passing through a barrier filter and into the microscope eyepieces

7、or camera system.,9,激發(fā)光源,高壓汞燈擁有313, 337, 365, 405, 436, 546, and 577 納米的峰值譜。高壓 Xenon燈有連續(xù)的可見光光譜范圍, 光源強度比較平均。,汞燈光譜,10,激發(fā)濾色塊,具有多套激發(fā)濾色塊：激發(fā)濾色鏡（Excitation Filter），分光鏡（Dichromatic Mirror），發(fā)射濾色鏡（Emission Filter）。,激發(fā)濾色塊,六孔激發(fā)塊轉(zhuǎn)盤,11,多用途型BX-RFA(適合多種科研要求)及通用型BX-URA2?？赏瑫r使用6種熒光激發(fā)塊， “輕撥式”激發(fā)塊轉(zhuǎn)換功能，使不同熒光激發(fā)之間的迅速轉(zhuǎn)換非常方便，

8、并可消除震動，有利于復(fù)染樣品的熒光觀察。激發(fā)塊標(biāo)識在暗室環(huán)境中發(fā)光，在暗室中也能很容易地選擇需要的熒光激發(fā)塊。另外，根據(jù)需要還可以選擇6孔濾色片滑塊(U-RSL6/U-RSL6EM)安放激發(fā)濾色片和發(fā)射濾色片進行熒光觀察。,12,13,BX51 在鏡基上裝有3個濾色片（ND6，ND25，LBD），另外，還可以選裝第四個。鏡基側(cè)面的拉桿可以很容易地插入/取出濾色鏡。,Specimen color fading can be delayed by reducing the excitation light intensity with ND filters. Use the ND filters

9、as far as they do not hinder observations. Insert the ND filters (U-25ND6 and/or U-25ND25) with the marked side facing toward the observer.,14,15,1、該鏡可作為明視場顯微鏡使用，也可作為熒光顯微鏡使用，根據(jù)需要，做相應(yīng)的附件連接，開啟相應(yīng)的電源。禁止亂調(diào)設(shè)置，以免影響他人正常使用。 2、作為明視場顯微鏡使用；A、接通電源后，打開顯微鏡底座前的電源開關(guān)，按光亮需要調(diào)節(jié)底座右側(cè)的滑竿。B、根據(jù)需要，調(diào)節(jié)底座光柵和聚光器光柵及其高度，可獲得最佳的圖象效果。

10、C、需要圖片，要把鏡體上的相應(yīng)拉桿拉到綠線位子。按下相應(yīng)附件上的照相按扭。 3、作為熒光顯微鏡使用；A、先關(guān)閉熒光通道，再打開熒光激發(fā)器電源，等待15分鐘。B、等待期間，打開顯微鏡光源，找到需要觀察的樣品，選用合適的物鏡，調(diào)整焦距。C、關(guān)閉顯微鏡光源，打開熒光通道。D、需要圖片，要把鏡體上的相應(yīng)拉桿拉到綠線位子。按下相應(yīng)附件上的照相按扭。,16,細胞核與細胞質(zhì)DNA的直接熒光染色,17,線粒體GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥,根（顯示葉綠體）,葉片,18,注意事項,激發(fā)光擋片的使用-減少淬滅,19,注意事項,熒光的淬滅與激發(fā)光的照射時間成正比，因此應(yīng)盡量減少觀察時間外激發(fā)光對樣品的照射。激發(fā)光擋片可以部分或

11、完全阻斷激發(fā)光光路。在正式觀察樣品之前，激發(fā)光光路應(yīng)該處于完全阻斷狀態(tài)。否則，在我們將樣品放到載物臺上，移動樣品臺將樣品調(diào)整到物鏡位置，找到要觀察的細胞并進行調(diào)焦的過程中，樣品上的熒光可能已經(jīng)發(fā)生了相當(dāng)程度的淬滅。為了避免觀察前不必要的淬滅，上述一系列操作需要在透射光源下進行。 當(dāng)眼睛離開物鏡進行記錄或?qū)@微鏡交給合作實驗者觀察時，要隨手阻斷激發(fā)光光路。實踐結(jié)果表明，熟練、規(guī)范和合理的觀察操作可以將樣品淬滅對觀察和記錄造成的影響降低到最小限度。 熒光信號的淬滅還與激發(fā)光的強度成正比。因此，在可以觀察到熒光信號的情況下，應(yīng)該盡量降低激發(fā)光的強度。這樣做還有利于降低背景。,20,NOTES,The

12、 inside of the ultrahigh-pressure mercury burner is very hot and hazardous during lighting and for about 10 minutes after turning off. Do not open the lamp housing in this period. The mercury burner has a service life period of 200 hours (USH102D) or 300 hours (HBD103W/2). When the hour counter on the power supply unit indicates this value, set the main switch to “O ” (OFF) and wait for more than 10 minutes before replacing the mercury burner. Unlike electric bulbs, the mercury burner seals high-pressure gas inside. If it continues to be used after the service life has expired, the glass tub