PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)置和要求,

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及要求甘肅省疾病預(yù)防控制中心 二一一年四月張林才,在由中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部辦公廳于2002年1月14日下發(fā)的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法衛(wèi)醫(yī)發(fā)200210號(hào)文)附件臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)。,設(shè)計(jì)根據(jù),臨床pcr診斷實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)方案,錯(cuò)誤的設(shè)計(jì),臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室四個(gè)隔開(kāi)的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的標(biāo)記，以避免設(shè)備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。 進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)(簡(jiǎn)稱擴(kuò)增區(qū))至產(chǎn)物分

2、析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。,在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，以便于鑒別。此外，當(dāng)工作者離開(kāi)工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。 清潔方法不當(dāng)也是污染發(fā)生的一個(gè)主要原因，因此實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。,試劑準(zhǔn)備區(qū)設(shè)置要求, 超凈工作臺(tái)或試劑配置箱 試劑冰箱 可調(diào)移液器一套（四支）， 配有帶濾芯（防止氣溶膠）及無(wú) rnase酶的吸嘴 無(wú)粉的乳膠手套 渦旋器 專用工作服 無(wú)菌離心管 ,下述操作在該區(qū)進(jìn)行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。 貯存試劑和用于標(biāo)本制備的材料應(yīng)直接運(yùn)送至

3、試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過(guò)產(chǎn)物分析區(qū)。在打開(kāi)含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當(dāng)貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆?，避免由于?jīng)常打開(kāi)反應(yīng)管吸液而造成污染。,含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴(kuò)增的試劑都應(yīng)冰凍貯存。為避免因單次反應(yīng)取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一次測(cè)定所需的擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)來(lái)決定。 主反應(yīng)混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過(guò)預(yù)試驗(yàn)來(lái)檢查，評(píng)價(jià)結(jié)果必須有書面報(bào)告。對(duì)于熱啟動(dòng)技術(shù)(在第一個(gè)高溫變性步驟后加

4、入酶)，聚合酶也可不包含在主反應(yīng)混合液中。 在整個(gè)本區(qū)的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施。,嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。 工作結(jié)束后必須立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔。本工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面的紫外照射應(yīng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對(duì)去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動(dòng)紫外燈(254nm波長(zhǎng))，在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上6090cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百bp，對(duì)紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長(zhǎng)照射時(shí)間，最好是照射過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須

5、有日常記錄。,標(biāo)本制備區(qū)設(shè)置要求,生物安全柜 樣本冰箱 可調(diào)移液器一套（四支）， 帶濾芯（防止氣溶膠）及無(wú)rnase酶的吸嘴 臺(tái)式微型離心機(jī)（最大rcf 16000g， 最小rcf12500g）； 試管架（sarstedt 93.1428） 無(wú)粉的乳膠手套 渦旋器 專用工作服 無(wú)菌離心管 加熱塊,下述操作在該區(qū)進(jìn)行：臨床標(biāo)本的保存，核酸(rna、dna)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定rna時(shí)cdna的合成。 要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)?？赏ㄟ^(guò)在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入

6、待測(cè)核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。,用于rna擴(kuò)增檢測(cè)的樣本制備好以后，應(yīng)立即進(jìn)行cdna合成，因?yàn)閏dna鏈較rna穩(wěn)定，保存相對(duì)容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要，應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)設(shè)置一個(gè)以上的溫育裝置。 cdna合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的dna聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其較cdna合成后再開(kāi)蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)生污染的可能性降低。 待測(cè)rna的cdna拷貝須保存在標(biāo)本制備區(qū)，不得在本區(qū)對(duì)樣本進(jìn)行pcr擴(kuò)增。,擴(kuò)增區(qū)設(shè)置要求, cobas ampl

7、icor nuclisens easyq lightcycler 熒光定量pcr儀 lightcycler capillary releaser 專用工作服 pcr擴(kuò)增儀,下述工作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：dna或cdna擴(kuò)增。此外，已制備的dna模板和合成的cdna(來(lái)自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式pcr測(cè)定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開(kāi)反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。 不能從本區(qū)再進(jìn)入任何上游區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。,為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動(dòng)。如有加樣

8、則應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。打開(kāi)預(yù)處理過(guò)的反應(yīng)混合液時(shí)必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴(kuò)增步驟之間。一個(gè)簡(jiǎn)單的方法是在打開(kāi)反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機(jī)，因其所占實(shí)驗(yàn)臺(tái)面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺(tái)。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過(guò)的加樣器必須注意清潔消毒。 完成操作及每天工作后都必須對(duì)實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面進(jìn)行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。,產(chǎn)物分析區(qū)設(shè)置要求, 孵箱 洗板機(jī) 酶標(biāo)儀 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 專用工作服,下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測(cè)定。 核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法

9、多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、southern轉(zhuǎn)移、核酸測(cè)序方法等。 目前國(guó)內(nèi)的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標(biāo)記的微孔板上探針雜交方法，即pcr-elisa方法，也有膜上探針雜交方法。,本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，因此必須注意避免通過(guò)本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用pcr-elisa方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1mol/l hc1中，并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠(yuǎn)離pcr實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉。用過(guò)的吸頭也必須放至1mol/l hcl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。 由于本區(qū)有可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲