飼料用酶ppt課件

1、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所楊培龍 姚斌,2009年10月18日,飼料用酶的研究進(jìn)展,1,飼料用酶制劑,一種新型的飼料添加劑，可提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能、降低飼料成本、減輕環(huán)境污染及開(kāi)發(fā)新型的飼料資源。 植酸酶、淀粉酶、木聚糖酶、b-甘露聚糖酶、 b-葡聚糖酶、 a-半乳糖苷酶、脂肪酶、角蛋白酶、葡萄糖氧化酶、霉菌毒素降解酶、溶菌酶等,2,飼料用酶種類,對(duì)動(dòng)物內(nèi)源酶進(jìn)行補(bǔ)充的飼料用酶, 如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等 消除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子的飼料用酶, 如b-葡聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、b-半乳糖苷酶等 使某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得到更有效的吸收利用、提高低劣質(zhì)飼料成份的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的飼料用酶, 如纖維素酶、木

2、質(zhì)素酶、植酸酶、果膠酶、角蛋白酶等 毒素、有害微生物去除的飼料用酶， 如霉菌毒素降解酶、有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶、溶菌酶等,3,飼料用酶的意義,1.緩解飼料資源短缺 2015年, 缺口將達(dá)0.5億噸 提高飼料利用率,節(jié)約并開(kāi)發(fā)新的資源 2.減輕環(huán)境污染 排放量(萬(wàn)噸/年) P: 250 N 500 N、P排放量降低40%以上 3.提供更為安全的動(dòng)物產(chǎn)品 具有控制、預(yù)防動(dòng)物疾病 減少抗生素、化學(xué)添加劑的使用 4.提高養(yǎng)殖業(yè)綜合經(jīng)濟(jì)效益 降低飼料成本; 降低料肉比;提高增重,4,飼 料 用 酶 現(xiàn) 狀,九十年代才開(kāi)始規(guī)模應(yīng)用, 2008年市場(chǎng)值達(dá)到3億美元, 酶制劑中年增長(zhǎng)最快的。 以飼料用酶為主體的生物

3、工程產(chǎn)品在飼料中占飼料價(jià)值的20%,卻決定了80%的飼料質(zhì)量 目前b-葡聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶等多個(gè)酶種已得到了一定程度的應(yīng)用 但與別的飼料添加劑相比, 飼料酶的應(yīng)用還處于嬰兒期, 全球只有不足30%飼料在應(yīng)用,5,原 因,一、酶的性質(zhì)不能滿足要求 飼料用酶需同時(shí)具備以下優(yōu)良性質(zhì): 熱穩(wěn)定性好而同時(shí)在常溫下又具有高活性 最適pH在酸性同時(shí)在整個(gè)酸性和中性的pH范圍內(nèi)又能維持較高活性 對(duì)動(dòng)物胃、胰蛋白酶和別的蛋白酶具有較好的抗性等綜合性質(zhì),6,原 因,二、飼料用酶的生產(chǎn)成本 飼料用酶僅是眾多飼料添加劑中的一類,決定了其添加成本必須十分低廉。,7,國(guó)內(nèi)外差距,研究與應(yīng)用起步較晚，差距較大。除少數(shù)

4、產(chǎn)品外, 普遍存在生產(chǎn)技術(shù)水平低、品種少、應(yīng)用技術(shù)不完善等問(wèn)題。國(guó)外已有十余種酶制劑實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化, 并在包括中國(guó)的市場(chǎng)上銷(xiāo)售和應(yīng)用。 生產(chǎn)成本高。國(guó)外80%以上的飼料酶制劑是利用基因工程菌株高效生產(chǎn), 而我國(guó)僅有植酸酶等少數(shù)幾種是利用基因工程菌株高效生產(chǎn), 而大部分酶制劑是采用天然和誘變菌株發(fā)酵生產(chǎn), 成本高。,8,國(guó)內(nèi)外差距,酶的有效性差，應(yīng)用效果不穩(wěn)定。酶的性質(zhì)不夠理想；非單酶生產(chǎn)，各種酶的相對(duì)比例難以控制, 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以控制, 造成使用時(shí)效果不穩(wěn)定、重復(fù)性差。 酶的配套應(yīng)用技術(shù)體系不完善。缺乏針對(duì)我國(guó)飼料日糧和動(dòng)物特征的應(yīng)用技術(shù)。,9,研發(fā)趨勢(shì),注重資源挖掘, 尤其是微生物資源。利用現(xiàn)代

5、分子生物學(xué)和生物技術(shù)手段, 高通量篩選飼料用酶微生物及相關(guān)基因資源, 近來(lái)特殊環(huán)境微生物成為重點(diǎn)目標(biāo)。 利用基因工程、代謝工程技術(shù), 構(gòu)建高效生物反應(yīng)器技術(shù)平臺(tái), 使飼料酶的單位產(chǎn)量成百上千倍的提高, 以期規(guī)模化廉價(jià)生產(chǎn), 以解決飼料添加劑添加成本空間有限的問(wèn)題。,10,研發(fā)趨勢(shì),發(fā)酵技術(shù)和產(chǎn)品加工平臺(tái)技術(shù)。重點(diǎn)針對(duì)幾種主要的飼料微生物反應(yīng)器, 如酵母、曲霉、芽孢桿菌等, 建立高效的高密度發(fā)酵方法, 并開(kāi)發(fā)高效穩(wěn)定的產(chǎn)品加工技術(shù), 提高飼料生物制劑的穩(wěn)定性、實(shí)用性和應(yīng)用的高效性。 飼料生物制劑的應(yīng)用效果快速評(píng)估系統(tǒng)和配套應(yīng)用技術(shù)體系研究。,11,我們的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展,12,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料

6、研究所微生物工程研究室簡(jiǎn)介,成立于1994年 國(guó)內(nèi)飼料科學(xué)研究中第一個(gè)分子生物學(xué)和基因工程實(shí)驗(yàn)室。 研究?jī)?nèi)容: 飼料和工業(yè)用酶及其它生物活性物質(zhì)的研發(fā) 動(dòng)物胃腸道微生物及基因的分子生態(tài) 魚(yú)的分子免疫與基因工程疫苗,13,飼料用酶的研究平臺(tái),技術(shù)平臺(tái)的建立 新酶及基因的高通量篩選平臺(tái)技術(shù) 有效的分子改良平臺(tái)技術(shù) 高效表達(dá)平臺(tái)技術(shù) 發(fā)酵技術(shù)和規(guī)?；a(chǎn)技術(shù),14,基因資源,新酶、新基因的高通量篩選,15,特殊環(huán)境,冰川土樣 雪蓮根部土樣 地方羊品種瘤胃 草魚(yú)胃腸道 天牛胃腸道 深海魚(yú)胃腸道 棉槳廢水 金屬礦廢水 熱泉 火焰山土樣,16,17,主要結(jié)果,基本建立了從特殊環(huán)境中快速篩選新酶編碼基因的有

7、效方法體系 構(gòu)建了一種無(wú)需建庫(kù)和分離微生物而直接從環(huán)境基因組中克隆全長(zhǎng)基因的方法 研究了10余種特殊環(huán)境的微生物多樣性 分離到300株以上的產(chǎn)目標(biāo)酶酶微生物，其中有5個(gè)新種，10余個(gè)潛在的新種 研究了8種目標(biāo)酶在多個(gè)特殊環(huán)境中的基因多樣性 克隆到了超過(guò)2000個(gè)的目標(biāo)酶基因片段 克隆到了300個(gè)以上的全長(zhǎng)新基因,18,主要結(jié)果,篩選到了大量的性質(zhì)各異、具有重要應(yīng)用價(jià)值的酶及基因 可加深我們對(duì)酶關(guān)鍵性質(zhì)與結(jié)構(gòu)功能的了解, 指導(dǎo)進(jìn)一步的分子改良 綜合性質(zhì)極為優(yōu)良的植酸酶、木聚糖酶、b-甘露聚糖酶等 具有特殊性質(zhì)的酶: 如低溫酶、高溫酶、高比活性酶、強(qiáng)酸性酶、強(qiáng)堿性酶、抗蛋白酶降解的酶等,19,雪蓮

8、根部土壤低溫脂肪酶基因片段進(jìn)化樹(shù)圖譜,進(jìn)化樹(shù)顯示為五個(gè)獨(dú)立分開(kāi)的進(jìn)化簇，說(shuō)明冰川土壤中的脂肪酶基因序列呈現(xiàn)出多樣性的特點(diǎn), HSL家族脂肪酶作為參考序列,20,Diversity of BPP gene fragments from grass carp digestive tracts,21,冰川土樣中第10族木聚糖酶多樣性分析,F134,F211,F207,F234,F179,F77,F121,F20,F100,F119,F10,F96,F45,F109,F219,F58,F83,F210,F89,F128,F140,F31,F239,F8,F67,F50,F19,F197,F153,F5

9、6,F81,F99,F78,F28,F84,F136,F36,F47,F223,F133,F156,F216,F17,F160,F204,F144,F188,F26,F22,F122,F88,F87,F27,F241,F6,F206,F37,F60,F95,F24,F68,F21,F117,0.02,22,結(jié)構(gòu)具有特點(diǎn)的植酸酶基因,類似于操縱子的Erwinia herbicola E3植酸酶基因結(jié)構(gòu),IMP基因和HAP基因，這兩個(gè)基因共用一個(gè)啟動(dòng)子，IMP基因的終止密碼子TAA后，緊接著是HAP基因的起始密碼子ATG， 在E. herbicola E5也存在類似的結(jié)構(gòu) 活性研究表明：IMP和H

10、AP都能水解植酸，最適pH都為4.5左右。并且兩個(gè)酶一起作用時(shí)，比兩個(gè)酶各自單獨(dú)作用的效果之和更好,23,結(jié)構(gòu)具有特點(diǎn)的植酸酶基因,來(lái)源于Pseudomonas fluorescens 206串聯(lián)的植酸酶結(jié)構(gòu),phytase1全長(zhǎng)1284 bp，編碼了427個(gè)氨基酸，phytase2全長(zhǎng)1287 bp，編碼了428個(gè)氨基酸 序列之間具有較低的一致性（蛋白序列 52.1%） 兩個(gè)基因在大腸桿菌中都得到活性表達(dá)，最適合pH分別為 5.0 和4.5,24,結(jié)構(gòu)具有特點(diǎn)的植酸酶基因,多個(gè)磷代謝相關(guān)結(jié)構(gòu)域的N. punctiforme 植酸酶基因,磷酸酶結(jié)構(gòu)域，植酸酶結(jié)構(gòu)域，堿性磷酸酶結(jié)構(gòu)域，和鈣離子結(jié)

11、合域 完整的蛋白和單獨(dú)的植酸酶結(jié)構(gòu)域都能有效的水解植酸 完整蛋白的比活性高于單個(gè)植酸酶結(jié)構(gòu)域。作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。,25,綜合性質(zhì)優(yōu)良的植酸酶 Y4,26,在低pH值和強(qiáng)胃蛋白酶下高效水解植酸的Y. rohdei 植酸酶(豬專用植酸酶),具備三個(gè)必要條件 在強(qiáng)酸性條件下有高活性 強(qiáng)酸穩(wěn)定性 高濃度胃蛋白酶抗性 該酶同樣具有高比活，高的表達(dá)量 是豬用植酸酶最好的候選者,27,最適pH比較,28,pH穩(wěn)定性比較,29,胃蛋白酶抗性比較(標(biāo)準(zhǔn)方法),30,具有低溫活性的E. carotovora植酸酶,具有低溫酶典型特性 低溫時(shí)高的活性 差的熱穩(wěn)定性 在零度時(shí)具有5%的活性 最適活性溫度，與

12、動(dòng)物體溫相近 首次報(bào)道的低溫植酸酶 是研究植酸酶結(jié)構(gòu)的優(yōu)良材料,31,來(lái)源于藻類的中性植酸酶,最適鈣離子濃度1.5 mM 最適pH 6.5 最適溫度50C 具有典型BPP植酸酶的特性 鈣離子對(duì)該植酸酶的熱穩(wěn)定性和酶活性是必須的,32,瘤胃中性植酸酶CP53,首次從宏基因組中通過(guò)改進(jìn)的TAIL的方法克隆到一致性低的新基因 與報(bào)道的CP基因有不同的pH特性（6.5 VS 4.5）, 增加了對(duì)的CP植酸酶認(rèn)識(shí) 在中性條件下具有高活性為CP植酸酶的應(yīng)用研究提供更多的拓展空間,33,Pedobacter nyackensis 中性植酸酶,在pH7.0、20 時(shí)，r-PhyMJ11水解豆粕的能力是A.ni

13、ger和E.coli植酸酶水解能力的10倍以上以上,34,綜合性質(zhì)優(yōu)良的木聚糖酶,35,抗多種蛋白酶的木聚糖酶,36,高溫強(qiáng)酸性木聚糖酶,Optimum temperature at 93C and high stability at 90C,Optimum pH 4.0 with high activity at acidic condition,37,多個(gè)pH峰的木聚糖酶和葡聚糖酶,Glucanase,Xylanase,38,對(duì)多種底物有高活性的-glucanase Bg1,39,抗多種蛋白酶的Lipase lipS221,40,低溫磷脂酶LIPA,41,pH5.0的高溫淀粉酶,42,嗜酸

14、性淀粉酶 AMY2,43,具有高角蛋白降解活性的蛋白酶,44,對(duì)多種底物有高活性的 a -galactosidase AGL1,45,抗多種蛋白酶的a-galactosidase AGL5,46,高效a半乳糖苷酶(豆粕降解),I-1: 加a-半乳糖苷酶 I-2: 同時(shí)加a-半乳糖苷酶和胰蛋白酶,47,-Galactosidase with high efficiency to release galactose from soybean W/O trypsin,48,高比活b-mannanase,49,具有強(qiáng)嗜酸性的甘露聚糖酶,50,抗金屬離子的甘露聚糖酶MAN5A,51,在SGF下有高活性的

15、乳糖酶,與來(lái)源于A.oryzae的乳糖酶比較,52,對(duì)飼料有害真菌有抗菌活性的b-1,3-葡聚糖酶,53,酶的分子改良,分子改良技術(shù) DNA改組 定點(diǎn)突變 基因雜合 全新設(shè)計(jì) 突變酶篩選技術(shù),54,主要結(jié)果,已取得了一些進(jìn)展，但還未建立完整高效的技術(shù)體系 在突變酶表達(dá)篩選系統(tǒng)上有所突破 有成功的例子 多種具有特點(diǎn)的酶蛋白在進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)解析,55,突變酶表達(dá)篩選系統(tǒng)-木聚糖酶-突變酶胞外表達(dá)系統(tǒng),前期研究發(fā)現(xiàn), 在大腸桿菌中 木聚糖酶高表達(dá), 大量分泌至胞外 C端可自動(dòng)斷裂 解決的問(wèn)題: 不/低表達(dá)的酶-活性表達(dá)/高表達(dá) 細(xì)胞周質(zhì)-胞外 融合酶會(huì)自動(dòng)斷裂成單酶,56,植酸酶Y3的pH改良,57,

16、植酸酶Y5的突變體,58,木聚糖酶的熱穩(wěn)定性改良,After treated at 70 for 20 min, XS and TS showed better thermastability than XYNB, TS showed 12.4 times of enzyme activity than XYNB.,59,木聚糖酶的比活性改良,60,達(dá)到領(lǐng)先水平的表達(dá)技術(shù),進(jìn)行了大量的有關(guān)畢赤酵母重組生物反應(yīng)器的研究,建立了有效的高效表達(dá)方法體系,61,高效表達(dá)技術(shù),綜合以下手段 目標(biāo)基因的優(yōu)化：密碼子、二級(jí)結(jié)構(gòu)、自由能等 啟動(dòng)子改良、多啟動(dòng)子組合 信號(hào)肽改良 分子伴侶 解決溶氧的血紅蛋白 能

17、穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的多拷貝技術(shù) 整合位點(diǎn)的控制,62,高效表達(dá)：高效生物反應(yīng)器,構(gòu)建了特有的穩(wěn)定、高效的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，其特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)在于： 單位表達(dá)量更高。尤其對(duì)以往在原始畢赤酵母中表達(dá)量較低的外源基因可大副度提高其表達(dá)量 多種蛋白表達(dá)量達(dá)到了5mg/mL以上, 最高的達(dá)到12mg/mL 表達(dá)的穩(wěn)定性更好，并在8年來(lái)的實(shí)際生產(chǎn)上得到證明,63,多種植酸酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶表達(dá)量均達(dá)到5mg/mL以上,64,木聚糖酶發(fā)酵水平不斷提高 1500 5000 15000 40000 100000 170000 IU/mL 植酸酶發(fā)酵水平不斷提高800 5000 1000020000 30000

18、45000IU/mL,甘露聚糖酶: 8000IU/mL乳糖酶: 12000IU/mL葡聚糖酶: 35000IU/mL葡萄糖氧化酶: 500IU/mL,65,別的表達(dá)系統(tǒng)已初步建立,芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng) 乳酸菌表達(dá)系統(tǒng) 曲霉表達(dá)系統(tǒng) 木霉表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)基因植物,66,高比活木聚糖酶在煙草中的表達(dá),xynB基因整合入轉(zhuǎn)基因煙草的基因組中。,轉(zhuǎn)基因煙草中xynB基因正確轉(zhuǎn)錄,木聚糖酶蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草中高效表達(dá),67,轉(zhuǎn)基因煙草重組酶的穩(wěn)定性分析,25,37,55 ,60 ,轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)的木聚糖酶在室溫和37 保持穩(wěn)定性,轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)木聚糖酶具有一定程度的熱穩(wěn)定性,轉(zhuǎn)基因煙草T1代植株具有木聚糖酶的活性，具有遺傳穩(wěn)定性,68,高比活性木聚糖酶XYNB在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中的表達(dá),xynB基因整合入轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的基因組中,轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中的xynB基因可以正確轉(zhuǎn)錄,木聚糖酶在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中高效組成型表達(dá),繁殖3-4代，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的酶活性不變，具有遺傳穩(wěn)定性,轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中表達(dá)的木聚糖酶具有熱