FISH雜交技術(shù).ppt

1、a,1,熒光原位雜交（FISH） Fluorescence in situ hybridization,a,2,原位雜交（ISH）,原位雜交 (in situ hybridization, ISH) 將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交。 使用DNA或者RNA探針來(lái)檢測(cè)與其互補(bǔ)的另一條鏈在細(xì)菌或其他真核細(xì)胞中的位置。 原位雜交技術(shù)(ISH)是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，始于20世紀(jì)60年代。,a,3,基本原理,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，同源的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA兩條單鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈。用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA、RNA

2、或與mRNA互補(bǔ)的cDNA作探針，與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測(cè)核酸(RNA或DNA)片段進(jìn)行雜交，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測(cè)體系予以顯示，在組織、細(xì)胞、間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究。,a,4,原位雜交常用的標(biāo)記物質(zhì),3H、35S、125I、32P等,2,熒光素、生物素、地高辛等,70年代,80年代中后期,a,5,幾種原位雜交技術(shù),1 基因組原位雜交技術(shù) 2 熒光原位雜交技術(shù) 3 多彩色熒光原位雜交技術(shù) 4 原位PCR,a,6,熒光原位雜交,熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)

3、展起來(lái)的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù),它提供了將特定DNA片段和特定的真核生物細(xì)胞的染色體區(qū)帶聯(lián)系起來(lái)的快速而有效的手段,是研究DNA序列在染色體上位置的最直接的方法,自問(wèn)世以來(lái)就廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究中。它是以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導(dǎo)分子(reporter molecule)結(jié)合,雜交后再通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)過(guò)程連接上熒光染料。,a,7,FISH發(fā)展,1969年Gall和Pardue利用放射性同位素標(biāo)記的DNA探針檢測(cè)細(xì)胞制片上非洲爪蟾細(xì)胞核內(nèi)的rDNA獲得成功之后,Pardue等同年又以小鼠衛(wèi)星DNA為模板,利用體外合成的含3H的RNA為探針成功地與

4、中期染色體標(biāo)本進(jìn)行了原位雜交,從而開(kāi)創(chuàng)了RNA-DNA的同位素原位雜交技術(shù)。他們都是采用放射性同位素標(biāo)記探針,需要采用放射自顯影進(jìn)行檢測(cè),這種檢測(cè)上的限制及當(dāng)時(shí)分子克隆方法的缺乏使得DNA原位雜交技術(shù)不能很快得到廣泛應(yīng)用。,a,8,FISH發(fā)展,1974 年，Evans第一次將染色體顯帶技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來(lái),提高了基因定位的準(zhǔn)確性。 1975 年,Manning 等最先在溶液的分子雜交中,使用非放射性標(biāo)記,通過(guò)細(xì)胞色素C 將生物素與RNA 分子連接起來(lái)。 1977 年Rudkin發(fā)明了用間接免疫熒光法檢測(cè)目的DNA 的非同位素原位雜交(NISH)。 1981 年，Langer 等首次采用

5、生物素標(biāo)記的核苷酸探針成功地進(jìn)行了染色體原位雜交,建立了非放射性原位雜交技術(shù)。至此,以熒光標(biāo)記的探針在細(xì)胞制片上進(jìn)行基因原位雜交的技術(shù)建立起來(lái)。 1985 年，熒光原位雜交技術(shù)被引進(jìn)到植物。 1986 年，Cremer 與Licher 等分別證實(shí)了熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用于間期核檢測(cè)染色體非整倍體的可行性,從而開(kāi)辟了間期細(xì)胞遺傳學(xué)研究。,a,9,20世紀(jì)90年代，隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)行，由于繪制高分辨人類基因組圖譜的需要，F(xiàn)ISH技術(shù)得到了迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。,FISH發(fā)展,a,10,FISH原理,FISH是以熒光素直接標(biāo)記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交，互補(bǔ)的異源單鏈

6、DNA分子在適宜的溫度和離子強(qiáng)度下退火形成穩(wěn)定的異源待檢的雜交體雙鏈DNA，通過(guò)熒光標(biāo)記顯示出來(lái)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察雜交信號(hào)。,a,11,a,12,熒光原位雜交特點(diǎn),1.FISH不需要放射性同位素作探針標(biāo)記,安全性高； 2.FISH探針?lè)€(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用，經(jīng)濟(jì)、安全； 3.實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確； 4.FISH可定位長(zhǎng)度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)； 5.多色FISH通過(guò)在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列； 6.既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化,也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。,a,13,FISH不需要放射性

7、同位素作探針標(biāo)記,安全性高; FISH的實(shí)驗(yàn)周期短,探針?lè)€(wěn)定性高; FISH能通過(guò)多次免疫化學(xué)反應(yīng),使其雜交信號(hào)明顯增強(qiáng),從而提高靈敏度,檢測(cè)的靈敏度接近同位素探針雜交； FISH的分辨率高達(dá)320Mb； FISH可以用不同修飾核苷酸分子標(biāo)記不同的DNA探針,再用不同的熒光素分子檢測(cè)不同的探針?lè)肿?因此可以在熒光顯微鏡下在同一張切片上同時(shí)觀察幾種DNA探針的定位,直接得到它們的相關(guān)位置和順序,從而大大加速生物基因組和功能基因定位的研究。,a,14,a,15,實(shí)驗(yàn)流程,a,16,植物染色體常規(guī)制片,實(shí)驗(yàn)材料 蠶豆根尖 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?制備出分裂相多、雜質(zhì)少、背景清晰、染色體分散且形態(tài)好的染色體標(biāo)本 實(shí)

8、驗(yàn)步驟,取材 預(yù)處理 固定 解離（酸解） 染色 壓片 鏡檢,a,17,染色體制片,固定 固定液處理 對(duì)保持染色體完好形態(tài)很重要，并能使染色體核蛋白保持原有結(jié)構(gòu)，使染色體更接近活體狀態(tài)。 解離 酸解或酶解 若解離時(shí)間不足，細(xì)胞壁不能完全消化，染色體便無(wú)法分散、鋪展; 若解離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則可能導(dǎo)致染色體離散丟失。 染色 解離后材料徹底水洗并吸干，取根尖2-3mm分生組織于載玻片上夾碎搗爛，滴加12滴染液，染色510min。 壓片 染色后的材料上加一些染液，蓋上蓋玻片，再用鈍頭的用具敲打，使材料分散壓平，最后，覆一層吸水紙，以拇指垂直緊壓蓋片(注意勿使蓋玻片移動(dòng))，便于觀察。 鏡檢 先在低倍鏡下尋找有

9、分裂相的視野，再用高倍鏡仔細(xì)觀察、記數(shù)。找出染色體分散較好的中、后期細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù),并準(zhǔn)確記錄其位置。,a,18,間期,在光學(xué)顯微鏡下，只看到均勻一致的細(xì)胞核及許多的絲狀染色質(zhì)。實(shí)質(zhì)上間期的核是處于高度活躍的生理生化的代謝階段，正為細(xì)胞分裂準(zhǔn)備條件。,a,19,前期,核內(nèi)染色質(zhì)逐漸濃縮為細(xì)長(zhǎng)而卷曲的染色體，每一染色體含有兩個(gè)染色單體，它們具有一個(gè)共同的著絲點(diǎn)；核仁和核膜逐漸模糊不明顯。,a,20,中期,核仁、核膜逐漸消失，各染色體排列在赤道板上，紡錘絲與染色體的著絲點(diǎn)相連。染色體分散，易于鑒定形態(tài)、數(shù)目。,a,21,后期,各染色體著絲點(diǎn)分裂為二，其每條染色單體也相應(yīng)地分開(kāi)，并各自隨著紡錘絲

10、的收縮而移向兩極，每極有一組染色體，數(shù)目和原來(lái)的相同。,a,22,末期,分開(kāi)在兩極的染色體各自組成新的細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中央赤道板處形成新的細(xì)胞壁，使細(xì)胞分裂為二，形成兩個(gè)子細(xì)胞。這時(shí)細(xì)胞進(jìn)入分裂間期。,a,23,a,24,a,25,a,26,a,27,a,28,a,29,小麥染色體制片,a,30,探針制備,所謂核酸探針即是指一段用放射性核素或其他標(biāo)記物(如酶與熒光素等)標(biāo)記的與目的基因互補(bǔ)的DNA片段或單鏈DNA或RNA。根據(jù)其來(lái)源可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針以及PNA探針。 1. cDNA探針 以mRNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成一條與mRNA互補(bǔ)的DNA鏈(c

11、DNA)用堿除去mRNA 2.基因組探針 是把染色體DNA通過(guò)超聲擊斷或以限制性內(nèi)切酶不完全水解獲得許多染色體DNA隨機(jī)片段擇長(zhǎng)度約15-20kb的DNA片段重組到噬菌體中經(jīng)體外包裝轉(zhuǎn)染大腸桿菌篩選出含目的基因的大腸桿菌擴(kuò)增后提取質(zhì)粒 酶切分離目的基因。,a,31,3.寡核苷酸探針 為人工合成的DNA片段，一般長(zhǎng)約20-50個(gè)bp（堿基）?？筛鶕?jù)已知DNA或RNA序列合成精確互補(bǔ)的DNA探針；如不知核酸序列，可依據(jù)其蛋白產(chǎn)物的氨基酸順序推導(dǎo)出核酸序列合成DNA探針。DNA自動(dòng)合成儀的出現(xiàn)使探針的合成十分方便。由于分子小，因此更容易滲透到細(xì)胞的目標(biāo)區(qū)域；但也正由于分子小，限制了其所能攜帶的熒光基

12、團(tuán)或報(bào)告分子數(shù)目，并最終導(dǎo)致雜交后熒光信號(hào)較弱。因此這類探針僅實(shí)用于對(duì)重復(fù)單位較短的高度重復(fù)序列的熒光原位雜交分析。,探針制備,a,32,4.RNA探針 制備的技術(shù)路線為：將一段含完整或部分基因的DNA片段插入重組質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，以內(nèi)切酶在插入片段中某一適當(dāng)部位或在插入片段下游的某一部位消化重組質(zhì)粒，使之成為線性DNA，在相應(yīng)的DNA依賴性RNA聚合酶催化下，以含目的基因的DNA片段為模板合成RNA探針。由于RNA探針為單鏈，雜交時(shí)不存在第二條鏈的競(jìng)爭(zhēng)，所以其敏感性較經(jīng)缺口平移標(biāo)記的DNA探針要高。 RNA-RNA雜交分子在所有可能的雜交分子中最穩(wěn)定，但RNA探針容易被RNase降解。,探針

13、制備,a,33,5.肽核苷酸（PNA）探針 PNA寡聚物是一類新分子，其結(jié)構(gòu)與DNA相似。但在PNA中，沒(méi)有核糖-磷酸基骨架，其骨架是不帶電的肽鏈(聚酰胺)。與DNA相比，PNA對(duì)熱穩(wěn)定、與DNA的結(jié)合不依賴于離子強(qiáng)度，因此雜交時(shí)，受探針變性溫度和溶液PH的影響較小，鑒于這些特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，PNA有望取代DNA或RNA作為FISH的探針。但由于PNA探針只能通過(guò)化學(xué)方法進(jìn)行合成，而且合成費(fèi)用高，因此迄今所用的PNA探針還僅限于染色體的泛著絲粒和泛端粒探針。,探針制備,a,34,PNA與DNA雜交時(shí)也遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,a,35,探針設(shè)計(jì)與特異性,探針是FISH檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。FISH檢

14、測(cè)的準(zhǔn)確性來(lái)源于探針的設(shè)計(jì)。FISH能否應(yīng)用于某一領(lǐng)域也取決于是否具有相應(yīng)的探針。用于FISH檢測(cè)的探針必須具備很高的特異性，能特異性地識(shí)別特定的基因或染色體上特定的片斷。而且FISH的探針必須能經(jīng)受原位雜交的處理而不變性。熒光基團(tuán)的標(biāo)記也直接影響了檢測(cè)的靈敏度和原位雜交結(jié)果的檢測(cè)方式。,a,36,以著名的探針生產(chǎn)商Vysis公司的LSI系列探針為例：LSI系列探針來(lái)源于BAC大片斷基因組文庫(kù)，探針?biāo)采w的染色體片斷總長(zhǎng)可達(dá)100Kb400Kb，保證了探針的高特異性和極強(qiáng)的熒光信號(hào)；熒光基團(tuán)采用直接標(biāo)記法標(biāo)記，不同波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)使探針在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)多種熒光信號(hào)，借此我們可以一次檢測(cè)多個(gè)染色

15、體或基因的異常；由于探針具有極強(qiáng)的熒光信號(hào)因而對(duì)FISH結(jié)果的檢測(cè)也采用直接檢測(cè)法，即在熒光顯微鏡下直接觀察FISH的信號(hào)，而無(wú)需抗原抗體反應(yīng)對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行放大。Vysis探針的設(shè)計(jì)既確保了探針的特異性和靈敏度，同時(shí)直接的鏡檢也使FISH檢測(cè)更簡(jiǎn)便。,探針設(shè)計(jì),a,37,探針設(shè)計(jì),a,38,探針類型,1、染色體單一序列探針，包括各類人工染色體探針，如酵母人工染色體、細(xì)菌人工染色體，主要用以識(shí)別染色體的易位、缺失和擴(kuò)增。 探針標(biāo)記2、染色體涂染探針，包括通過(guò)流式分選或顯微切割獲得的全染色體或染色體臂以及特異性區(qū)帶的涂染探針，用以檢測(cè)染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。 3、染色體重復(fù)序列探針，主要是指著絲粒-

16、衛(wèi)星 DNA 重復(fù)序列探針和端粒重復(fù)序列探針，用以檢測(cè)染色體數(shù)目異常。,a,39,a,40,染色體涂染探針：判斷易位染色體,a,41,a,42,探針標(biāo)記,為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交，有必要對(duì)探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識(shí)別的信號(hào)。,a,43,探針標(biāo)記,放射性標(biāo)記：很難滿足靈敏度和分辨率這兩個(gè)原位雜交成功的條件，靈敏度要求放射性標(biāo)記具有高中輻射能（32P），當(dāng)標(biāo)記物能量過(guò)高時(shí)，會(huì)因?yàn)樾盘?hào)散射導(dǎo)致分辨率過(guò)低；如果使用低輻射能的放射性標(biāo)記物（3H）可以得到較高分辨率，但由于靈敏度低而需要長(zhǎng)時(shí)間曝光，并由此導(dǎo)致背景過(guò)高而難以分辨出真正信號(hào)。 非放射性標(biāo)記：常用的有生物素與熒光素。生

17、物素一般通過(guò)連接到dUTP等核苷三磷酸上，這種經(jīng)修飾的核苷三磷酸再通過(guò)酶促反應(yīng)摻入到探針中；熒光素核苷三磷酸可在DNA聚合酶作用下?lián)饺氲教结樦腥?，常用的熒光素有異硫氰酸熒光素（FITC）、羧基熒光素（FAM）、四氯-6-羧基熒光素(TET)、吲哚二羧氰（Cy3，Cy5）等,a,44,標(biāo)記探針的物質(zhì),標(biāo)記探針的物質(zhì)： （1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin) 半抗原報(bào)告分子（間接標(biāo)記） 間接標(biāo)記：是采用生物素標(biāo)記DNA探針，雜交后再用聯(lián)有熒光素的抗生物素抗體檢測(cè)。（可將檢測(cè)信號(hào)放大，監(jiān)測(cè)到小至500bp的靶序列） （2）熒光物質(zhì)（直接標(biāo)記） 直接標(biāo)記：是通過(guò)熒光素直接與探針

18、核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)摻入熒光素核苷三磷酸標(biāo)記探針。（檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單，但不能將信號(hào)放大，不如間接標(biāo)記的探針靈敏）,a,45,探針標(biāo)記,探針標(biāo)記可以采用均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記的方法。 均勻標(biāo)記有切口平移法、隨機(jī)引物法和PCR擴(kuò)增等方法。,a,46,對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，可復(fù)制合成一段新的探針?lè)肿樱趶?fù)制合成過(guò)程滲入標(biāo)記核苷酸，從而使整個(gè)新分子被均勻地標(biāo)記。其顯著的特點(diǎn)是標(biāo)記不局限一個(gè)位點(diǎn)，而是均勻地滲入，探針的信號(hào)強(qiáng)。,均勻標(biāo)記,a,47,切口平移法： 先由胰DNA酶I在DNA雙鏈上隨機(jī)切口，大腸桿菌DNA聚合酶I 作用以切口處開(kāi)始，以另一條DNA鏈為模板，以4種三磷酸脫氧

19、核苷酸為原料，沿切口水解5端核苷酸和3端修復(fù)加入標(biāo)記核苷酸同時(shí)進(jìn)行，切口平行推移，可均一標(biāo)記DNA鏈。 （引物延伸法） 本法與切口平移法相似，都是利用DNA聚合酶來(lái)合成與模板互補(bǔ)的新的DNA鏈。由于DNA聚合必須從具有3-OH的末端開(kāi)始合成，因此與切口平移不同，引物延伸法需要一段與模板序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸作引物，將它與模板雜交，以提供3-OH端。,均勻標(biāo)記,a,48,切口平移標(biāo)記法,標(biāo)記部分,a,49,切口平移法可對(duì)環(huán)狀或線性雙鏈DNA進(jìn)行標(biāo)記。一般對(duì)克隆的DNA片段用這種方法標(biāo)記的效果較好。 該方法使用時(shí)應(yīng)注意： A.只能標(biāo)記雙鏈DNA 使用探針時(shí)要預(yù)先變性后再使用，而且標(biāo)記時(shí)DNA片段不能

20、太小。 B.DNA酶I使用的量要合適 太多會(huì)將DNA模板切碎，不能進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)；太少則不能有效地打開(kāi)缺口，使標(biāo)記物不能進(jìn)入缺口。 C.標(biāo)記時(shí)間不能太短 太短時(shí)間會(huì)造成標(biāo)記量不足，影響雜交的進(jìn)行。,a,50,均勻標(biāo)記,隨機(jī)引物法 原理是使被稱為隨機(jī)引物的6-9個(gè)核苷酸的寡核苷酸片段與單鏈DNA或變性的雙鏈DNA隨機(jī)互補(bǔ)結(jié)合（退火），以提供3-OH端，在5-3外切酶活性的DNA聚合酶大片段作用下，在3-OH端逐個(gè)加上核苷酸直至下一個(gè)引物。當(dāng)反應(yīng)液中含有標(biāo)記的核苷酸時(shí)，即形成標(biāo)記的DNA探針。引物與模板的結(jié)合以一種隨機(jī)的方式發(fā)生，標(biāo)記均勻跨越DNA全長(zhǎng)。,a,51,隨機(jī)引物標(biāo)記法,a,52,1、不但

21、可用于雙連DNA的標(biāo)記，而且可用于單連DNA和RNA的標(biāo)記 2、操作簡(jiǎn)單 3、標(biāo)記率高,隨機(jī)引物標(biāo)記法的特點(diǎn),a,53,PCR擴(kuò)增 在PCR反應(yīng)底物中，將一種dNTP換成標(biāo)記物標(biāo)記的dNTP，這樣標(biāo)記的dNTP就在PCR反應(yīng)的同時(shí)摻入到新合成的DNA鏈上。用PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)只須極少量的DNA模板（50100ng），即可擴(kuò)增出大量高效標(biāo)記的目的片段。 若進(jìn)行質(zhì)粒的提取工作，需要23d完成。若直接從菌中標(biāo)記目的基因，可以縮短至23h，即可獲得高效率標(biāo)記的探針。也可直接從具有目的基因載體質(zhì)粒中擴(kuò)增出目的基因，同時(shí)適用于不需提取質(zhì)粒DNA迅速鑒定細(xì)菌轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子。,均勻標(biāo)記,a,54,PCR標(biāo)記法

22、,a,55,末端標(biāo)記,直接將探針?lè)肿拥哪硞€(gè)原子替換為放射性同位素原子，或直接在探針?lè)肿由霞由蠘?biāo)記的原子或復(fù)合物，這種直接標(biāo)記一般是在探針?lè)肿拥哪┒诉M(jìn)行，所以稱之為末端標(biāo)記。 經(jīng)過(guò)末端標(biāo)記的核酸分子除作為雜交探針外，更多的用于RNA S1核酸酶作圖以及引物延伸反應(yīng)中的標(biāo)記引物。,a,56,末端標(biāo)記法,a,57,實(shí)驗(yàn)流程,a,58,染色體顯帶,顯帶染色是將染色體經(jīng)過(guò)一定程序的處理,并用特定的染料染色后,使染色體在其長(zhǎng)軸上顯示出一個(gè)個(gè)明暗交替或深淺不同的橫紋,這樣的橫紋就叫做染色體的帶。,食管癌細(xì)胞系24色染色體mFISH核型分析,a,59,每條染色體都含有一定數(shù)量、一定排列順序、一定寬窄和染色深淺或明暗不同的帶,這就構(gòu)成了每條染色體的帶型。顯示染色體帶的過(guò)程稱為染色體顯帶。 染色體顯帶為染色體的研究提供了一個(gè)十分有效的方法。 染色體的顯帶技術(shù)分為兩大類:一類為整條染色體的顯帶技術(shù)；另一類為染色體局部的顯帶技術(shù)。,a,60,熒光原位雜交特點(diǎn),1.熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全； 2.探針?lè)€(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用； 3.實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確； 4.FISH可定位長(zhǎng)度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)； 5.多色FISH通過(guò)在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列； 6.既可以在玻片上