細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術課件

1、細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,第05章 細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,本章主要內容： 1. 動物細胞培養(yǎng)技術 2. 病毒及其培養(yǎng)技術 3. 病毒效價（滴度）測定技術 4. 常用分子病毒學技術,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,第1節(jié) 動物細胞培養(yǎng)技術,一、幾個概念,1.原代細胞：直接由組織制備的細胞培養(yǎng)物。未經建系，不能 無限傳代，僅可傳有限代次，一般58代。 2.傳代細胞：能夠無限傳代繁殖的細胞群，不具有來源組織的 核型和貼壁細胞依賴性。 3.雞胚：孵化至911天的健康或SPF雞胚。 4.基礎培養(yǎng)基（minimum essential medium, MEM）：能夠滿 足動物細胞生長發(fā)育的基本營養(yǎng)需要的培養(yǎng)

2、基。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,5.生長液：含10%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液。 6.維持液：含2%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液。 7.消化（分散）液：0.25%胰酶。配方入下： NaCl 0.8g KCl 0.2g Na2HPO4 12H2O 0.29g KH2PO4 0.02g EDTA 0.03g 胰酶 0.25g 水至 100mL 8.接毒：將毒種按一定比例加入細胞培養(yǎng)物中，以進一步增 殖病毒的過程。方法分為單層接種和同步接毒。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,二、細胞培養(yǎng)步驟,1.細胞的復蘇 從液氮中取出凍存的細胞，迅速投入37水浴中，待完全融化后，直接轉入盛有5-10mL細胞生

3、長液的60mm細胞培養(yǎng)瓶中，在37、5CO2培養(yǎng)，待細胞貼壁后，換生長液培養(yǎng)。 2.細胞的傳代 移去細胞瓶中生長液，用PBS洗兩次，用0.25%的胰酶消化液分散細胞，視細胞消化程度確定消化時間，一般在2-5min。待部分細胞出現(xiàn)脫落后，輕輕拍打細胞瓶，使細胞脫離瓶壁。加入生長液，用吸管吹打數(shù)次使細胞彼此分開，傳代于2-3個與原培養(yǎng)瓶同樣大小的培養(yǎng)瓶中，在37、5CO2培養(yǎng)。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,3.換液與維持培養(yǎng) 待傳代后的細胞生長至80%滿度時(一般應24hrs)，將生長液換掉，加入同樣數(shù)量的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。通?？删S持23天。待細胞長滿并開始出現(xiàn)衰老死亡者時，重復傳代、換液的操作。

4、4.細胞凍存 待細胞長滿后，也可將細胞保存起來。保存在-80或液氮中。具體操作如下：用消化液將細胞分散后，加入含10% DMSO（二甲基亞砜）的FBS營養(yǎng)液，使細胞濃度達106-107/ml，分裝于細胞凍存管中，1ml/管。按照4、1hr，-20、4hrs、-80過夜的順序凍存，最后置液氮中長期保存。 應注意：凍存過程應緩慢，而復蘇過程應迅速。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,第2節(jié) 病毒及其培養(yǎng)技術,病毒：屬于微生物界，是細胞內專性寄生的最小生命形態(tài)-微生物，即在自然情況下，它只能在活的細胞內才能復制和增殖。 細胞外的病毒，沒有新陳代謝，不表現(xiàn)生命活性。但當其進入宿主細胞后，病毒核酸迅即啟動和復制

5、，最后產生數(shù)量增多的子代病毒；病毒具有遺傳性和變異性。 因此，病毒具有生命活動型和生命靜止型的雙重存在形式。與其他微生物不同，病毒有其自身的特性。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,一、病毒的特征,1. 病毒一般只含有一種核酸DNA或RNA，而其他微生物，包括細菌、支原體、立克次氏體和衣原體，則都同時含有兩種核酸； 2. 病毒通過基因組復制和表達，產生子代病毒的核酸和蛋白，隨后裝配成完整的病毒粒子；而在其他微生物，則是核酸和許多其他組成成分一起參與生長、增殖過程，并常以二分裂或類似的方式進行； 3. 病毒缺乏完整的酶系統(tǒng)，不具備其他生物“產能”所需的遺傳信息，因此必須利用宿主細胞的酶類和產能機構，并借

6、助宿主細胞的生物合成機構復制其核酸以及合成由其核酸編碼的蛋白，乃至直接利用細胞成分。可以這樣認為，病毒的生物合成實質上是病毒遺傳信息控制下的細胞生物合成過程；,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,4. 某些RNA病毒(反轉錄病毒)的RNA經反轉錄合成互補DNA (cDNA)，與細胞基因組整合，并隨細胞DNA的復制而增殖，這就是所謂的DNA前病毒。 5. 病毒沒有細胞壁，也不進行蛋白質、糖和脂類的代謝活動，因此對抗生素具有明顯的抵抗力。 6. 病毒基因組形式多樣：dsDNA、ssDNA、dsRNA、+ssRNA、-ssRNA等。既有線狀，又有環(huán)狀，還有分節(jié)段的。 細胞是組成動物、植物、微生物等生物體的基本

7、單位，但病毒與此不同，一個簡單的病毒由蛋白質衣殼和核酸組成，復雜一些的病毒僅在衣殼外面多一層囊膜，故病毒可被稱為亞細胞生物或分子生物。 病毒沒有生長，也不以二等分裂方式繁殖，而是以某種方式將基因組釋放到細胞內，一方面以其為模板轉錄mRNA合成蛋白，另一方面合成子代核酸，再組裝為子代病毒粒子，最后釋放到細胞外，這一過程叫增殖。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,復制：病毒的增殖：Replication、Multiplication。病毒以其核酸侵入易感細胞內，在病毒核酸信號指揮下，利用宿主細胞，按其自身為模板合成病毒的蛋白質、核酸及其它部件，然后裝配成新的病毒粒子，最后釋放到細胞外，開始另一個感染周期。

8、,復制周期(Replication cycle)：即感染循環(huán)(infection cycle)。從病毒吸附于宿主細胞開始，到子代病毒從細胞釋放出來為止的全過程，稱為病毒的復制周期。,二、病毒復制周期,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,1.吸附和侵入 病毒吸附分兩步進行，即可逆的非特異性吸附和不可逆的特異性吸附。首先，非特異性吸附即病毒與細胞以靜電引力相結合。這種吸附可發(fā)生在細胞表面任何部位且易被沖洗、高濃度鹽類和一定的pH環(huán)境所破壞，使病毒從吸附物上重新解脫出來。 隨后是病毒的特異性吸附，即病毒蛋白(抗受體)與細胞膜上的受體特異性結合。這種吸附是不可逆的。病毒吸附細胞的過程，可在幾分鐘到幾十分鐘的時間

9、內完成。,病毒感染增殖的一般過程： 動物病毒的增殖過程大致可以分為：吸附與侵入、脫殼、病毒成分的合成以及裝配與釋放等4個主要階段。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,細胞受體主要是胞膜上的糖蛋白。據(jù)估計，一個宿主細胞上的特異性受體部位可達104105個。但不一定每個細胞表面都有特定病毒的特異受體。細胞有無特定病毒的受體，直接影響是否對該病毒具有易感性。所以，病毒受體的研究是研究病毒感染的分子機制的重要內容之一。 侵入與吸附是一個連續(xù)過程。不過，侵入是一個依靠能量的過程。目前發(fā)現(xiàn)病毒侵入細胞有3種方式：病毒直接轉入胞漿，如小RNA病毒；細胞吞飲病毒，如多瘤病毒；病毒囊膜同細胞膜融合，如流感病毒。無囊膜病

10、毒以前二種方式侵入，有囊膜病毒常以第三種方式進入。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,2.脫殼 病毒脫殼，包括脫囊膜和脫衣殼兩個過程。有囊膜病毒(除痘病毒外)的脫囊膜過程就是上述侵入的過程。無囊膜病毒則只有脫衣殼的過程。 病毒核衣殼的脫落和核酸的逸出主要發(fā)生在細胞漿內。但不同病毒脫殼發(fā)生的地點和過程不完全一樣。如呼腸孤病毒，并不發(fā)生完全的脫殼。某些在細胞核內增殖的DNA病毒，例如乳多空病毒、腺病毒和皰疹病毒，其核衣殼可能在未被完全脫殼的情況下就進入細胞核內。口蹄疫病毒則可能就在細胞膜上脫掉衣殼，病毒核酸直接進入細胞內。 脫殼必須有酶的參與，脫殼酶來自宿主細胞，有的為病毒基因編碼。迄今，病毒侵入細胞并脫

11、殼的詳細分子機制尚未完全研究清楚。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,3.病毒成分的合成 病毒侵入細胞并脫殼后，在其遺傳信息的控制下，一方面病毒利用自身的特異性核酸聚合酶或反轉錄酶等進行病毒成分的合成；另一方面利用細胞生物合成的場所和原材料合成病毒的各種組成成份及其所需的酶類，包括病毒核酸轉錄或復制時所需的聚合酶；最后是由新合成的病毒成分裝配成完整的病毒粒子。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,4.裝配和釋放 新合成的病毒核酸和病毒蛋白在感染細胞內逐步成熟。所謂成熟，是指核酸進一步被修飾，病毒蛋白亞單位以最佳物理方式形成衣殼。 例如脊髓灰質炎病毒的RNA必須同一個基因蛋白(VPg)結合后，才能成為病毒RNA。

12、與此同時，衣殼蛋白VP0、VP1和VP3形成5S的結構單位，再由60個5S形成80S的衣殼。病毒RNA進入衣殼，就形成完整病毒粒子，這就是裝配。 病毒的裝配效率甚低，常因核酸不能與衣殼有機地結合，形成缺乏感染性的空殼病毒（假病毒）。同樣，病毒成分在細胞內裝配成完整病毒粒子的詳細分子機制尚不清楚。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,由于細胞的生物合成被病毒阻斷，細胞發(fā)生變性及死亡（CPE），細胞自身的溶解就將病毒釋放出來。某些不產生明顯細胞病變的病毒的釋放方式，目前還不十分清楚。相反，小RNA病毒合成速度極快，病毒粒子在胞漿內大量積聚，也許在細胞死亡之前，就可脹破細胞，釋放病毒。 有囊膜病毒的釋放過程就

13、是病毒核衣殼獲得囊膜的過程。反轉錄病毒、披膜病毒、副粘病毒等，由于在胞漿內復制及裝配，病毒在胞漿膜上獲得囊膜。而皰疹病毒由于在胞核內復制及裝配，病毒在核膜上獲得囊膜。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,VIRAL LIFE CYCLE,ATTACHMENT,PENETRATION,HOST FUNCTIONS,ASSEMBLY (MATURATION),Transcription,REPLICATION,RELEASE,UNCOATING,Translation,MULTIPLICATION,病毒的復制過程,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,（一）用細胞培養(yǎng)病毒,三、病毒的培養(yǎng)技術,病毒可用細胞、雞胚和動物進

14、行培養(yǎng)。,細胞培養(yǎng)：cell culture. 用機械的方法(剪碎)或化學的方法(胰酶)，使動物組織或傳代細胞分散成單個細胞懸液后，給以相應的營養(yǎng)和溫度等條件，在體外進行培養(yǎng)。 包括原代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和細胞系（cell line）培養(yǎng)。 細胞培養(yǎng)技術是研究病毒的分子感染機制、生物大分子裝配機制的重要手段，也是大量增殖病毒，制備細胞培養(yǎng)疫苗的基礎技術。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,體外培養(yǎng)的細胞有兩種基本形態(tài),成纖維樣細胞,上皮樣細胞,1.細胞培養(yǎng)的類型,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,雞胚成纖維細胞 CEF：Chicken embryo fibroblast,1)原代細胞 由新鮮的、分化程度較低的組織

15、或胚胎，經剪碎并用胰酶消化后制備的細胞。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,地鼠腎細胞株 BHK21,非洲綠猴腎細胞 Vero細胞,2)細胞株（cell strain） 從原代培養(yǎng)細胞群中篩選出的具有特定性質或標志的細胞群。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,人結腸癌上皮細胞Caco-2細胞,人子宮頸癌細胞HeLa細胞系,3)細胞系(cell line) 從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉化的細胞，在培養(yǎng)條件下可無限繁殖。,細胞的傳代：擴大培養(yǎng)用胰酶將長成致密單層的細胞(原代細胞、二倍體細胞株、細胞系)從一個培養(yǎng)瓶消化下來，并分裝為23瓶，補充培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)的過程。原代細胞的傳代過程常稱之為

16、繼代。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,3. 單細胞制備方法,機械分散法：用于原代細胞的制備，如雞胚成纖維細胞。 用剪刀將雞胚剪成1mm3小塊，放入底部有一塊微孔銅絲網的10-20ml注射器內，將組織細胞擠過網孔，即可得到分散的細胞或配合酶消化法。,胰酶消化法：用于消化細胞間的蛋白成分。視不同組織和細胞，胰酶濃度和消化時間有所不同；一般為0.25%，在室溫或37下作用一段時間胰酶消化后，再用吸管進行吹打，使之分散為單細胞。,螯合劑分散法：EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)可與鈣鎂離子結合，從而使上皮細胞類細胞分散，單獨使用時消化效果可能不佳，與胰酶配制在一起，消化效果更佳。配制EDTA液時，需用無鈣鎂緩沖

17、液。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,4. 細胞培養(yǎng)的方法,1)原代細胞的制備：雞胚成纖維細胞。取911日齡雞胚，去頭、四肢、內臟，PBS洗滌；置于小燒杯中，用剪刀剪碎(1mm3)。用0.25%胰酶消化：37、30min，吸棄胰酶，在組織塊中加入培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打，使細胞分散，用紗布過濾，計數(shù)細胞懸液中的細胞數(shù)。,細胞計數(shù)：白細胞計數(shù)板。在白細胞計數(shù)板上放上蓋玻片 取少量細胞懸液進行適當稀釋，取一滴滴入白細胞計數(shù)板，使其滲入蓋玻片下，計數(shù)五個大方格內的細胞總數(shù)： 細胞數(shù)/ml(五個大方格中的細胞總個數(shù)5)10000稀釋倍數(shù) 將原始細胞懸液稀釋至5105個細胞/ml后，裝瓶培養(yǎng)。,細胞培養(yǎng)與常用病

18、毒學技術,9-10日 齡雞胚,幼齡動 物組織,加培養(yǎng)基吹打分散 過濾、補足培養(yǎng)基,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,25ml培養(yǎng)瓶裝3ml，100ml培養(yǎng)瓶裝10ml， 平放于37溫箱培養(yǎng),細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,37培養(yǎng)2448h，雞胚成纖維細胞可形成致密單層，但細胞瓶中需裝合適的細胞量。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,2) 細胞的傳代,1）取生長良好的細胞； 2）倒掉培養(yǎng)液； 3）用PBS洗細胞面12次（可略去！）； 4）加入適量0.25%胰酶消化液使其覆蓋細胞面； 5）室溫下消化(時間視不同細胞而定)； 6）去胰酶，加入少量生長液，吹打分散細胞； 7）加入足量生長液，分裝為約24瓶，溫箱培養(yǎng)。,細

19、胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,5. 影響細胞的因素,靜置培養(yǎng)、轉瓶培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、中空纖維細胞培養(yǎng)和微囊化培養(yǎng)。,靜置培養(yǎng),將細胞懸液接入轉瓶(塑料或玻璃瓶)，放于恒溫箱的轉鼓上進行培養(yǎng)。細胞仍是貼壁生長，但能增加供細胞貼壁的表面積，便于擴大產量；溫和轉動(68r/h)時，細胞有一段時間離開培養(yǎng)基，懸浮于空中，增加了氣體交換，有利細胞生長。,轉瓶,轉瓶機,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,6. 病毒增殖的技術,1.培養(yǎng)基：Eagle氏液、RPMI-1640、199、DMEM。 2.血清：生長液加10%，維持液加2%。 3.pH：用碳酸氫鈉調至中性偏堿，培養(yǎng)液呈粉紅色。 4.溫度：37。 5.細胞

20、接種量：合適，一般為105/ml。 6.消化：適度。 7.污染：嚴格無菌操作。原材料、培養(yǎng)基和試劑的消毒和 除菌、器材的消毒、操作，培養(yǎng)基需加雙抗。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,試劑的配制：,1. 雙抗：用滅菌三蒸水溶解青、鏈霉素，每毫升含青霉素104 IU、鏈霉素104ug，冷凍保存，使用時，100ml培養(yǎng)基加1ml。 2. 培養(yǎng)液和胰酶均可配制成較高濃度的液體存放于冰箱，前者 4，后者冷凍。 3. 配制培養(yǎng)基使用液時，加雙抗和小牛血清后，再用碳酸氫鈉 溶液調pH，不必按照培養(yǎng)基的使用說明，在溶解培養(yǎng)基粉劑 后立即加入碳酸氫鈉。 注意：若要檢查配制好的培養(yǎng)基是否無菌，可取少量裝瓶，置于37溫箱

21、。 為保持培養(yǎng)基無菌，可分裝成較小的瓶子，每瓶一次用完冰箱保存的培養(yǎng)基較涼，使用前，可將培養(yǎng)基在室溫下適當放置。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,病毒接種與收獲：,1.取生長良好的敏感細胞，倒掉培養(yǎng)基，用PBS或Hanks 液洗滌細胞面12次。 2.加入預先稀釋的病毒液，其體積為維持液的1%2%，輕晃 使其覆蓋細胞面。 3.37靜置如3060min，使病毒吸附于細胞表面。 4.加入維持液，37培養(yǎng)，每日鏡檢，多數(shù)病毒在接種后3 7d可使細胞出現(xiàn)病變(CPE)。 5.在CPE達80%左右時可收毒，凍融3次使病毒釋放，離心去 細胞碎片，取上清液低溫冷凍保存。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,同步接種和異步接種

22、：,1. 細胞長好后，再接種病毒，為異步接種法 2. 某些病毒(如細小病毒)需采用同步接種，才能更好地繁殖，即，在單細胞懸液分裝后或分裝后4h內，同時接種病毒。 3. 合適的病毒吸附時間和收毒時間可參閱相關文獻。 4. 不產生CPE的病毒，可使用一些間接的指標，如免疫學方法 病毒毒價的測定：TCID50、空斑試驗。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,選擇敏感細胞：獲得高滴度的病毒液,若用細胞繁殖病毒，針對不同病毒，需選擇其相應的敏感細胞； 鴨瘟病毒可用雞鴨鵝胚成纖維細胞； 馬立克氏病病毒可用雞胚和鴨胚成纖維細胞； 口蹄疫病毒可用BHK21、PK15等； 未知病毒，通過研究確定敏感細胞。,細胞培養(yǎng)與常用

23、病毒學技術,影響病毒繁殖的因素:,血清：接種病毒后，需使用維持液，即培養(yǎng)基中的血清含量減至2%；若血清影響到病毒繁殖，可用無血清培養(yǎng)基。 溫度：37，某些病毒的最適溫度或高于或低于37，如狂犬病病毒的最適溫度為32。 pH：細胞生長時可產酸，雖然受病毒感染影響，細胞產酸能力下降，但由于大多數(shù)病毒的繁殖需要37d，故維持液中酸性物質仍可蓄積，配制維持液時可偏堿。 病毒接種量：適當稀釋后，體積為維持液的1%10%。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,復習思考題,1. 概念：細胞培養(yǎng)、原代細胞、細胞株、細胞系、細胞 的傳代、靜置培養(yǎng)、轉瓶培養(yǎng)。 2. 用細胞培養(yǎng)繁殖病毒時，有哪些因素可影響到病毒的 增殖？

24、3. 細胞培養(yǎng)有哪些方式？,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,禽胚：雞、鴨、鵝胚。許多病毒適合于禽胚繁殖；禽胚來源充足；操作簡單。,（二）用禽胚培養(yǎng)病毒,目的：適于對禽胚敏感的動物病毒的分離、培養(yǎng)； 病毒滴度的測定； 中和試驗：病毒的鑒定、分型、抗體檢測； 抗原制備； 廣泛用于生物制品的研究和生產。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,1.禽胚的選擇,根據(jù)不同病毒選擇不同禽胚： 雞胚：禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒、禽痘病毒。 鴨胚：狂犬病病毒、減蛋綜合征病毒。 鵝胚或番鴨胚：鵝細小病毒(小鵝瘟)、番鴨呼腸孤病毒。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,大頭朝上：蛋殼、殼膜與氣室,2. 雞

25、胚的結構,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,撕開殼膜，露出絨毛尿囊膜,殼膜,尿囊膜,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,9日齡雞胚結構：,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,3.準備雞胚與毒種,雞胚孵化：3738、相對濕度為53%57%的條件下孵化，孵育3日后，每日翻蛋12次。 孵至第4日，用照蛋器觀察雞胚發(fā)育情況，未受精卵，只見模糊的卵黃黑影，應淘汰?；钆呖煽吹角逦难芎碗u胚的暗影，比較大一些的可以看見胚動；隨后每日觀察一次，將胚動呆滯或不動、血管昏暗模糊者，隨時淘汰。 生長良好的雞胚孵育至接種前。,準備毒種：將病毒毒種用滅菌生理鹽水進行適當稀釋分離病毒時，用適量生理鹽水加入病料中研磨、加抗菌素抑菌、離心取上清、經無

26、菌檢驗后用于接種。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,1）尿囊腔接種：選910日齡雞胚。新城疫病毒、鴨肝炎病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒等。 2）絨毛尿囊膜接種 3）卵黃囊接種 4）羊膜腔接種 5）腦內接種 6）胚體接種 7）靜脈接種,4.接種,根據(jù)不同病毒選擇不同途徑：,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,（1）照胚：在氣室中部做記號，在靠近胚胎一側、氣室邊緣或偏下處劃出接種部位。,避開大血管,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,（2）消毒接種部位,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,（3）打孔,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,（4）接種,稀釋病毒液 0.10.2ml/胚,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,（

27、5）石蠟封口,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,（6）置37溫箱培養(yǎng) 每日照胚、24小時內死胚棄之，根據(jù)不同病毒培養(yǎng)至合適時間。,接種后，收獲時間視不同病毒而異。 一般收集死亡雞胚，有些疫苗也收集存活雞胚。 置冰箱過夜或冰柜0.51 h冷卻使血液凝固，避免某些有血凝活性的病毒與紅細胞凝集造成病毒滴度下降。 消毒氣室處蛋殼，去除蛋殼和殼膜。 收獲雞胚的何種組織，依不同的病毒而定主要考慮組織的含毒量高低。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,取出尿囊液、胚胎、尿囊膜，制成勻漿，加適量抗菌素。制備鴨瘟弱毒疫苗時，加入保護劑制成凍干品；勻漿中加甲醛滅活為雞胚組織滅活苗。,（7）收獲全胚或尿囊液,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術

28、,用吸管穿過絨毛尿囊膜插入尿囊腔，吸取尿囊液和羊水，加保護劑凍干即為新城疫弱毒疫苗； 而含新城疫病毒和禽流感病毒的尿囊液用甲醛滅活，加油乳佐劑乳化，即為油苗。,收獲尿囊液：,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,影響病毒增殖的因素： 1）種蛋質量：最終影響到疫苗的質量，應使用SPF雞胚。 蛋傳微生物：白血病病毒、腦脊髓炎、腺病毒、支原體、傳染性貧血因子、沙門氏菌等，既污染生物制品，又影響病毒繁殖。 母源抗體：種雞免疫后、或感染過病原后，種蛋會含有母源抗體，可影響某些病毒在雞胚中的增殖。,2）孵化技術 溫度：雞胚孵化適宜溫度為37.838，病毒繁殖的適宜溫度一般為37 。 濕度：雞胚孵化適宜濕度為53%57

29、%，水禽胚可高5% 10%，過干導致胚胎失去水份，發(fā)育不良。 通風：孵化機內設有排風扇，保持箱內空氣新鮮。 翻蛋：種蛋大頭朝上，定期翻蛋，以改變位置，既可使胚胎受熱均勻，利于發(fā)育，也可避免胚胎與蛋殼粘連，還可強制胚胎定期活動，促進胚胎發(fā)育。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,3）接種技術 接種途徑：不同病毒有不同的接種途徑，需選擇合適的接種途徑，以獲得最高的病毒滴度； 使用不同的接種途徑時，需選擇合適日齡的雞胚，保證獲得最高量的病毒液； 接種時，不應傷及胚體和血管，以免影響發(fā)育，使病毒繁殖速度降低或停止； 操作過程、所用器材，需保持無菌； 需選擇合適的收毒時間。,克服上述這些影響因素，旨在獲得高滴度的

30、、體積盡可能多的病毒液，即獲得足夠的抗原量，這是影響病毒性疫苗質量的關鍵因素。 若抗原量不能滿足需要，應對病毒液進行濃縮，雖然成本提高，但能保證效果。病毒抗原的濃縮技術！,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,（三）用動物培養(yǎng)病毒,動物是繁殖病毒的宿主之一。 1.某些病毒用雞胚和細胞培養(yǎng)難以繁殖，必需用易感的實驗動物或本動物進行繁殖； 2.即使用雞胚和細胞培養(yǎng)能夠繁殖的病毒，在研究和生產中，實驗動物或本動物也是必需的，如： （1）強毒株的篩選； （2）制備同源組織臟器苗或高免血清； （3）疫苗各項指標的檢測：免疫原性或疫苗效力檢驗(免疫攻毒保護試驗)、疫苗的安全性試驗、毒力返強試驗、免疫后抗體消長曲線的檢

31、測等。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,1. 動物的選擇標準,2. 接種方法 根據(jù)病毒及研究目的的不同，可采用不同途徑進行接種：皮下、皮內、肌肉、靜脈、腹腔和腦內等接種方式。,（1）對相應病毒易感； （2）大動物，來自非疫區(qū)、最好未接種過相應的疫苗、青壯年、健康； （3）家兔、大鼠和小鼠等，應符合實驗動物標準； （4）雞應為SPF雞或非免疫雞； （5）犬貓應品種明確，且符合實驗動物標準； （6）體重、年齡等要基本一致，個體差異不宜過大。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,復習思考題：,1. 簡述各類疫苗制造的基本流程。 2. 病毒性疫苗(動物組織苗、雞胚苗、細胞苗)。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,第3節(jié) 病毒

32、效價（滴度）測定技術,一、血清學診斷抗原,1.概念：用已知微生物和寄生蟲及其組分、代謝產物、感染動物組織制成，用于檢測血清中的相應抗體。 2.用途：這類制劑可與血清中的相應抗體發(fā)生特異性反應，形成可見的或可以測知的復合物，以確診動物是否受微生物感染或是否接觸過某種抗原。 3.分類：根據(jù)檢測方法的不同，分為凝集反應抗原、沉淀反應抗原、補體結合反應抗原。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,二、凝集反應 顆粒性抗原(如病原微生物或紅細胞等)與特異性抗體結合時所出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。根據(jù)反應中附加因素的不同，可分為下述幾種形式： 直接凝集反應： 紅細胞凝集反應：病毒顆粒（如流感病毒）上有血凝素，它與某些脊椎動物（豚

33、鼠、雞、猴等）的紅細胞表面上的受體結合，就會出現(xiàn)非特異性的凝集。 這種病毒血凝現(xiàn)象可被特異性抗體抑制，產生血凝抑制反應。用這種反應鑒定病毒型和株以及測定特異性抗體。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,間接凝集反應：將小分子抗原吸附在無關顆粒（如紅細胞、乳膠顆粒、活性炭等）上，再與對應抗體作用而出現(xiàn)的凝集反應。反之，若將抗體預先吸附在無關顆粒上，再與對應抗原作用出現(xiàn)凝集，這叫做反相間接凝集反應。例如： 間接血凝反應：將抗原成分吸附或結合在紅細胞上，然后加入相應的抗體，由于抗體與抗原的特異結合，而把結合抗原的紅細胞間接（被動）凝集起來,這時，紅細胞起到載體的作用，能使微量可溶性抗原與抗體結合，成為肉眼可見

34、的血凝現(xiàn)象。間接血凝反應是檢測抗體的敏感方法。例如，可用腦膜炎球菌、沙門氏菌的抗原成分、乙型肝炎表面抗原與紅細胞結合以檢測病人血清中相應的抗體。 若將特異性抗體結合于紅細胞上，通過血凝反應檢測相應的抗原，則稱為反向間接血凝反應。這是檢測微量抗原（如毒素、細菌成分）和早期快速診斷傳染病的敏感方法，現(xiàn)已用于診斷腦膜炎、布魯斯氏菌病、出血熱、病毒性肝炎等。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,三、沉淀反應 在有適量電解質的情況下，可溶性抗原與對應抗體結合，形成沉淀物的反應。廣泛被應用于鑒定混合系統(tǒng)的蛋白組分，鑒定菌型，診斷疾病以及在法醫(yī)學上鑒定血跡。 凝膠擴散：以瓊脂凝膠或其他類似物質為介質進行的沉淀試驗。把

35、抗原和抗體分別放在介質中，經擴散后，抗原與抗體相遇處就形成沉淀線。凝膠擴散可用于抗原-抗體系統(tǒng)的定性和定量分析。凝膠擴散法分為單向和雙向兩類。 對流免疫電泳：在電場作用下進行的雙向凝膠擴散。其原理是：在通電的瓊脂中，抗原和抗體向相反的電極移動,當它們在最適宜的比例處相遇時,可形成白色的沉淀線。實際上，這是一種加速的雙向瓊脂擴散試驗。試驗所需時間短、敏感性高，但特異性較差。一般用于各類蛋白的定性和半定量測定。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,四、中和試驗 將抗體與毒素或病毒結合，使毒素失去毒性或使病毒失去傳染力的免疫學試驗?？捎靡暂o助診斷疾病，或鑒定病毒、某些未知病原體和毒素等。能在動物、雞胚或組織培

36、養(yǎng)中進行。 病毒中和試驗：用于檢查患過某些病毒疾病或免疫機體血清中抗體的增長情況的方法。也可用于鑒定病毒和研究抗原結構。一般用不同稀釋度血清與定量病毒等量混合，放置一定時間，然后接種到細胞培養(yǎng)管中，每天觀察細胞病變，以能抑制細胞病變的血清最高稀釋度作為終點效價。這一試驗多采用細胞培養(yǎng)，比動物和雞胚試驗經濟而方便。中和抗體特異性高，維持時間較長，是流行病學調查常用的方法。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,五、酶聯(lián)免疫吸附試驗 簡稱酶標法，是20世紀70年代新開展的一項免疫血清學技術。當抗原或抗體結合到固相載體表面時，仍能保持自己的免疫活性。把抗原或抗體與酶的結合物再與相應的抗體或抗原結合，即可根據(jù)加入

37、酶底物的顏色來判定有無相應的免疫反應。顏色的深淺與標本中相應抗體或抗原的量成正比。酶標法和放射免疫技術同是既特異又敏感的方法。 酶標法中最常用的是間接法和雙抗體夾心法。間接法用于測定抗體。雙抗體夾心法用于測定抗原。 酶標法具有特異、敏感、快速、簡便和經濟等特點，原則上可用于檢測一切抗原、半抗原和抗體。目前已用酶標法測定血清蛋白質、腫瘤抗原、激素、藥物、各種微生物和寄生蟲的抗原，以及上述各種抗原所產生的相應抗體。在臨床診斷、疾病普查、法醫(yī)鑒定、獸醫(yī)檢查、植物病害檢驗等方面應用廣泛。,細胞培養(yǎng)與常用病毒學技術,六、TCID50、LD50、EID50,將病毒細胞培養(yǎng)物在滅菌離心管中作連續(xù)10倍稀釋，即取10